Resumos

FUSÃO DE PROTOPLASTOS DE Saccharomyces cerevisiae AVALIADA POR FLOCULAÇÃO E PRODUÇÃO DE H₂S

C.V.B. MARTINS¹; J. HORII²; A.A.PIZZIRANI-KLEINER³

¹ Pós-Graduanda, Depto. Ciencia e Tecnologia Agroindustrial-ESALQ/USP.

² Depto. de Ciência e Tecnologia Agroindustrial-ESALQ/USP, C.P. 9, CEP: 13418-900 - Piracicaba, SP.

³ Depto. de Genética-ESALQ/USP, C.P. 9, CEP: 13418-900 - Piracicaba, SP.

RESUMO: Com o objetivo de obter linhagens de leveduras com características de importância para a indústria vinícola, empregou-se a técnica da fusão de protoplastos. A atenção foi dirigida a duas características: floculação e não produção de H₂S. Uma vez que cada característica é de baixa frequência (1% cada) em leveduras vinícolas, torna-se pouco provável a ocorrência natural de uma linhagem com ambas as características. O cruzamento foi realizado via fusão de protoplastos pois as linhagens apresentaram incompatibilidade sexual. Inicialmente foram obtidos os mutantes auxotróficos contrastantes e posteriormente suas marcas foram avaliadas quanto à reversão e, em seguida foram determinadas suas curvas de crescimento. Obteve-se a protoplastização por tratamento com Novozym 234 e a fusão foi mediada por PEG 40% e CaCl₂ 1,2 M. A taxa de fusão de protoplastos foi de 2,7x10^-4, sendo que das colônias resultantes, 54,6% continuaram o crescimento após transferência para MM, "minimal media". Após várias transferências em meio YEPD foram selecionadas as linhagens floculantes e H₂S^-.

Descritores: Fusão de protoplastos, sulfeto de hidrogênio, floculação, leveduras, Saccharomyces cerevisiae, linhagens

PROTOPLAST FUSION OF Saccharomyces cerevisiae EVALUATED THROUGH FLOCCULATION AND H₂S PRODUCTION

ABSTRACT: In order to obtain yeast strains with important characteristics for the wine industry, protoplast fusions were performed. Attention was driven to two important traits: flocculation and of H₂S production. Because both are traits occuring at low frequency in wine yeast (1% each), their natural occurence is unlike. Crossing was made through protoplast fusion because strains were sexualy incompatible. Initially, auxotrophic contrasting mutants were obtained, their marks were tested for reversion and finally, their growth rates were determined. Protoplasts were obtained after treatment with Novozym 234 PEG and CaCl₂. The rate of fusion was 2,7x10^-4, and 54,6% of the resulting colonies were able to grow on minimal media. After several transfers to YEPD media, the flocculant and H₂S^- productive strains were selected.

Key Words: Protoplast fusion, hydrogen sulphide, flocculation, yeasts, Saccharomyces cerevisiae, strains

INTRODUÇÃO

As indústrias que utilizam-se das leveduras nos processos de produção, particularmente as de bebidas alcoólicas, são muito tradicionais, refletindo a atitude conservadora que, em geral, os homens apresentam no tocante à natureza dos alimentos e bebidas que consomem. Apesar disso, as indústrias de bebidas alcoólicas apresentaram recentes inovações, pela introdução de benefícios gerados pela bioengenharia e por manipulações genéticas. As indústrias cervejeiras e vinícolas tiveram muitos desafios nos últimos anos como, por exemplo, aumentar a resistência da levedura ao etanol, à temperatura e ao dióxido de carbono e eliminar ou diminuir a produção de compostos que prejudicam a qualidade das bebidas.

A fim de obter linhagens que apresentassem algumas destas propriedades, foram utilizados métodos de manipulação genética. Mas, em função da natureza aneuplóide, diplóide ou poliplóide da maioria das linhagens da indústria cervejeira e vinícola, as técnicas tradicionais de cruzamento têm apresentado pouco sucesso. Assim, fez-se necessário a utilização de novas tecnologias, como a fusão de protoplastos. Novos genótipos foram obtidos por fusão de protoplasto (Ferenczy et al., 1974; Anné & Peberdy, 1976; Carrau et al., 1982).

Sabe-se que o sabor, o aroma e a qualidade das bebidas alcoólicas, em especial as não destiladas, são determinados por um complexo e delicado balanço de compostos aromáticos. Isto porque, além da conversão dos carboidratos em etanol e dióxido de carbono, as diferentes linhagens de leveduras produzem uma série de compostos desejáveis e indesejáveis, que resultam em determinados flavour nas bebidas, o que pode afetar a qualidade final das mesmas. Sendo assim, as leveduras utilizadas na produção de bebidas não destiladas necessitam de características adicionais, tais como a produção de baixos níveis de ácidos voláteis (Kunkee & Amerine, 1970) e a produção de baixos níveis de H₂S (Parish & Carrol, 1987; Hammond, 1993). O H₂S é um composto indesejável que apresenta maus odores que depreciam seriamente a qualidade das bebidas (Vine, 1993).

A floculação é outra característica de interesse em linhagens utilizadas pelas indústrias de bebidas alcoólicas, que mais recentemente tem sido introduzida por modificações genéticas nesses microrganismos (Varnam & Sutherland, 1994). Este fenômeno é apresentado por algumas linhagens de leveduras que em certas circunstâncias tendem a aglomerar-se e formar flocos, os quais se depositam no fundo da dorna de fermentação. Nas indústrias de bebidas fermentadas não destiladas, onde faz-se necessário retirar o fermento da bebida, a ocorrência da floculação das leveduras é vantajosa quando a fermentação alcança o estágio desejado.

O presente trabalho tem por objetivo obter linhagens de leveduras que tenham a capacidade de flocular e não sejam produtoras de H₂S, pois, tanto a não produção de H₂S quanto o alto grau de floculação ocorrem em apenas 1% das linhagens selvagens de leveduras (Romano et al., 1985). Desta forma, torna-se improvável que ocorram linhagens que possuam as duas características. Como a linhagem não produtora de H₂S tem incompatibilidade sexual com padrões de mating-type de Saccharomyces cerevisiae, o cruzamento das linhagens foi feito via fusão de protoplastos.

MATERIAL E MÉTODOS

Material biológico: foram utilizadas duas linhagens de leveduras catalogadas como Saccharomyces cerevisiae. Uma apresenta a característica de não produção de H₂S (H₂S^-) e foi obtida da micoteca do Departamento de Ciência e Tecnologia Agroindustrial da Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"/USP, identificada por IZ 987. A outra, ABXR.11B, é floculante e foi cedida pelo Laboratório de Genética de Leveduras do Departamento de Genética da Escola Superior de Agricultura "Luiz de Queiroz"/USP. A linhagem IZ 987 já foi utilizada por Ribeiro (1997), que constatou que a referida linhagem produz álcool de forma satisfatória, sendo a aguardente produzida pela fermentação da cana, de boa qualidade. O autor constatou ainda que a linhagem não produzia H₂S.

Meios de cultura: as culturas foram mantidas em YEPD sólido (Glicose 2%, Peptona 2%, Extrato de levedura 1%, Ágar 1,5%). Para a avaliação da habilidade de floculação, as linhagens foram cultivadas em meio YEPD líquido, e para determinar a habilidade de produção de H₂S foi utilizado o meio Bismuth Sulfite Agar (Difco).

Para investigação de auxotrofias foi utilizado um meio mínimo sintético, que continha por litro o seguinte: Glicose 20,00 g; Asparagina 2,00 g; KH₂PO₄ 1,50 g; MgSO₄.7H₂O 0,50 g; CaCl₂.2H₂O 0,30 g; (NH₄)₂SO₄ 2,00 g; KI 0,1 mg; Pantotenato de Cálcio 1,00 mg; Inositol 1,00 mg; MnSO₄ 0,02 mg; ZnSO₄ 2,00 mg; CuSO₄ 0,10 mg; Na₂B₄O₇.10H₂ O 0,01 mg; (NH₄) Mo₇O₂₄.4H₂O 0,02 mg; FeSO₄ 0,20 mg (pH 6,8).

Os meios de regeneração de protoplastos YEPD e meio mínimo, foram preparados como acima descrito, sendo que a estabilidade osmótica foi obtida pela adição de 1,2 M de Sorbitol.

Teste de potencial para produção de H₂S: para analisar a capacidade de produção de H₂S foi utilizado o método proposto por Nickerson (1953) para detecção de redução de sulfito em Candida. Este método foi utilizado por Zambonelli (1964) para identificação de linhagens de Saccharomyces cerevisiae deficientes na atividade da enzima sulfito redutase e mais recentemente foi validado como uma metodologia rápida para a seleção de linhagens H₂S^- para uso vinícola (Jiranek et al., 1995). O método consiste na transferência das linhagens através de estrias para meio Bismuth Sulfite Agar (Difco) seguindo-se incubação por 24/48 horas em BOD, a 28°C.

Após este período, as estrias foram observadas quanto a coloração. As estrias que resultaram na cor branca foram identificadas como sendo de linhagens H₂S^- e as estrias pretas ou enegrecidas, de linhagens H₂S⁺ (Figura 1).

Teste de floculação: foi empregado um teste visual em culturas estáticas. As linhagens foram inoculadas em tubos de ensaio contendo aproximadamente 5 mL de meio YEPD líquido e foram incubadas a 28°C por 48 horas. Transcorrido o período de incubação, a cultura depositada no fundo do tubo foi homogeneizada com o meio de cultura em agitador tipo Vortex e a avaliação consistiu na visualização dos flocos suspensos no meio de cultura (Suzzi et al., 1984).

Obtenção, caracterização e reversão de mutantes auxotróficos: as linhagens foram expostas à luz UV para produzir 5% de sobrevivência. Diluições apropriadas foram semeadas, sendo as placas incubadas a 28°C. Após o crescimento das colônias, elas foram transferidas para duas séries de placas de 26 pontos, uma contendo meio mínimo (Reaume; Tatum, modificado por Fungaro & Pizzirani-Kleiner, 1992) e outra com meio YEPD sólido, técnica da réplica de Lederberg & Lederberg (1952). As placas foram incubadas por 72 horas. As colônias que não apresentaram crescimento em meio mínimo foram consideradas mutantes e, após recuperação do YEPD, foram caracterizadas quanto a auxotrofia. Os mutantes auxotróficos foram caracterizados segundo a técnica de auxonografia (Pontecorvo et al., 1953). Para se avaliar a frequência de reversão das marcas auxotróficas, suspensões celulares dos mutantes obtidos foram inoculadas em meio mínimo e em meio YEPD. As placas foram incubadas por 5 a 7 dias a 28°C, quando procedeu-se a contagem das colônias. A frequência de reversão foi calculada através da seguinte relação: n^o médio de Unidades Formadoras de Colônias em meio mínimo/ nº médio de UFC em YEPD.

Investigação da ploidia: para investigar a ploidia das linhagens, foram semeadas em meio rafinose acetato (Rafinose 2,2%, Acetato de Potássio 20%), que é um meio indutor da esporulação, no qual espera-se que linhagens diplóides de leveduras esporulem.

Curva de crescimento em meio YEPD: a curva de crescimento em meio YEPD foi feita através da estimativa do número de células totais ao microscópio ótico, com o auxílio de uma câmara de Neubauer.

Obtenção e regeneração de protoplastos: foi feito um experimento a fim de se determinar o tempo necessário para obter aproximadamente 100% de protoplastização. Um mililitro de uma suspensão celular contendo entre 5x10⁵ a 1x10⁶ células por mL foi inoculado, em frascos contendo 50 mL de YEPD líquido. Estes frascos foram agitados a 150 rpm durante o tempo necessário para que a cultura atinjisse a metade da fase exponencial de crescimento, com a concentração em torno de 10⁷ a 10⁸ células por mL. Após este período, as células foram coletadas por centrifugação a aproximada-mente 5000 rpm e lavadas duas vezes com EDTA 10 mM; após cada lavagem as células foram ressuspensas. Após a segunda lavagem, o precipitado foi ressuspendido em 5 mL de EDTA 10 mM. A esta suspensão foi adicionado 50 mL de 2-mercaptoetanol e incubada por 10 minutos a 28°C. A seguir, esta suspensão foi lavada duas vezes com TSP 1 M (Tampão Sorbitol Fosfato), sendo que o precipitado da segunda lavagem foi ressuspenso em 2 a 5 mL de TSP 1 M, a fim de obter-se uma concentração em torno de 10⁸ células por mL. Foi retirada uma alíquota de 0,1 mL, para servir de controle. A suspensão restante foi dividida em dois erlenmeyers de no máximo 50 mL, em quantidades idênticas. Num foi adicionada a enzima lítica, Novozym 234 (100 mg/mL) (frasco A), numa proporção de 0,1 mL de solução lítica para cada mL de suspensão celular e o outro permaneceu sem enzima, servindo como testemunha (frasco B). Estes erlenmeyers foram incubados a 28°C com branda agitação. Amostras foram colhidas por centrifugação a 1500 rpm, após 30 e 60 minutos de ação da enzi-ma, e lavadas por três vezes em TSP. E, assim como o controle, 0,1 mL de diluições apropriadas, em TSP 1M, foram semeadas em meio YEPD sólido.

O grau de formação de protoplastos foi estimado como o proposto por Gunge & Tamaru (1978), pela comparação do número de colônias produzidas pelo plaqueamento de células tratadas com a enzima lítica (frasco A), sobre o meio YEPD, com o número de colônias obtidas pelo plaqueamento de igual concentração de células não tratadas por enzima lítica (frasco B).

Para a determinação da porcentagem de regeneração, foram utilizadas as diluições das amostras que foram tratadas com a enzima lítica (frasco A). Alíquotas de um mililitro de diluições apropriadas foram semeadas pela técnica "pour plate" em meio de YEPD de regeneração de protoplastos 1,2 M, bem como alíquotas de 0,1 mL, de diluições apropriadas foram plaqueados por superfície, em YEPD sem estabilizador osmótico. O grau de regeneração de protoplastos foi estimado pela comparação do número de colônias crescidas em meio YEPD com e sem estabilizador osmótico. O excesso de colônias desenvolvidas em YEPD com estabilizador foi considerado como devido à regeneração de protoplastos (Gunge & Tamaru, 1978).

Fusão de protoplastos: foram obtidos protoplastos derivados de duas linhagens com auxotrofias contrastantes, conforme descrito acima. Às suspensões de protoplastos em TSP, foram adicionados alíquotas de solução de CaCl₂ 1,2 M numa proporção de 1:4 (250 mL/mL de suspensão). Posteriormente, essas suspensões contendo protoplastos foram misturadas em igual quantidade e centrifugadas por 10 minutos a 1500 rpm. O sobrenadante foi removido e 1 mL da solução de PEG 40% foi adicionado e misturado. Após incubação a 30°C por 30 minutos, a mistura foi centrifugada e lavada por três vezes em TSP e diluições apropriadas foram semeadas pela técnica pour plate em meio mínimo para regeneração dos produtos de fusão, meio YEPD-sorbitol e meio YEPD. As placas foram incubadas por 7-10 dias a 28°C, quando procedeu-se a contagem das colônias presentes nos dois meios. A frequência de fusão citoplasmática foi estimada pela seguinte relação: número médio de colônias presentes em MM-sorbitol/ número médio de colônias desenvolvidas em meio YEPD-sorbitol menos o número médio de colônias desenvolvidas em meio YEPD.

As colônias que crescerem no meio seletivo para fusão foram transferidas para placas de 26 pontos com MM sem estabilizador osmótico para confirmar a fusão nuclear. As colônias que persistiram o crescimento nessas placas foram consideradas híbridas.

Teste de estabilidade dos produtos de fusão: algumas colônias consideradas híbridas foram avaliadas quanto a sua estabilidade. Após crescimento em meio mínimo, foram transferidas para meio YEPD sólido e incubadas por 48 horas. A seguir, cada colônia foi inoculada em 100 mL de YEPD líquido em frascos erlenmeyer e colocadas para incubar em shaker a 150 rpm, a 28°C por 24 horas. Destas culturas, um mililitro foi transferido para outro erlenmeyer contendo YEPD e incubado nas mesmas condições por mais 24 horas. O último procedimento foi repetido mais uma vez, perfazendo o total de três subcultivos. No terceiro subcultivo, foi retirada uma alíquota de 0,1 mL, efetuou-se as devidas diluições e procedeu-se a inoculação das culturas obtidas a partir dos produtos de fusão avaliados, as quais foram incubadas em BOD a 28°C. As colônias que cresceram isoladas foram testadas quanto a produção de H₂S e floculação. Após 3 subcultivos, os produtos de fusão que apresentassem 100% de colônias H₂S^- e floculantes foram considerados estáveis.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Obtenção, caracterização e reversão de mutantes auxotróficos: uma série de experimentos foram realizados a fim de se obter os mutantes auxotróficos complementares necessários para a fusão de protoplastos. Para tanto determinou-se a curva de sobrevivência à luz ultravioleta para se ter a dose de irradiação necessária para a obtenção de 5% de sobrevivência da população. Esta é a dose mais comumente utilizada para a obtenção de mutantes auxotróficos de várias espécies de microrganismos, pois segundo Burnett (1975), um rendimento efetivo de mutantes só é obtido quando a taxa de sobreviventes, após tratamento mutagênico, for muito baixa, algo em torno de 1 a 5%.

Após o tratamento, as colônias foram transferidas por réplica para meio mínimo e meio YEPD e após o período de incubação em ambos os meios, fez-se a seleção e posterior caracterização das linhagens que não se desenvolveram em meio mínimo. As colônias mutantes oriundas da linhagem IZ 987 foram investigadas quanto à deficiência nutricional pela técnica da auxonografia até mesmo para a caracterização final, pois a triagem inicial da deficiência apontou para o grupo das vitaminas e como a quantidade de requisitos nutricionais a serem testados neste grupo é pequeno, a técnica da auxonografia é indicada. Mas, para os mutantes auxotróficos oriundos da linhagem ABXR.11B que indicaram uma deficiência para aminoácidos, a caracterização final foi realizada pelo método proposto por Holliday e Takahashi, citados por Azevedo (1972), pois se trata de um grupo de requisitos nutricionais maior. Os resultados das frequências de obtenção de mutantes auxotróficos estão apresentados na TABELA 1. Como pode ser observado na referida tabela, a linhagem IZ 987 obteve um único tipo de auxotrofia, bem como uma proporção de mutantes cinco vezes superior ao da linhagem ABXR.11B.

Na tentativa de explicar o grande número de mutantes auxotróficos para piridoxina na linhagem IZ 987, recorreu-se as observações de Fincham et al. (1979), os quais verificaram que o rendimento de um determinado mutante é variável com a espécie, e que em cada caso existe um requisito nutricional obtido mais frequentemente. Uma vez que esta linhagem mostrou-se bioquimicamente diferente da espécie Saccharomyces cerevisiae, pode-se especular que a incidência de uma auxotrofia única seja dada por características típicas deste microrganismo.

Do mesmo modo, Whelan & Magee (1981) observaram em algumas linhagens de Candida albicans, que houve uma taxa de obtenção de mutantes auxotróficos de 0,2 a 1,7% após tratamento com UV, sendo todos deficientes para o mesmo requisito nutricional. Os autores constataram que isto ocorreu devido a ploidia das linhagens, pois elas eram diplóides e heterozigotas para alguns genes recessivos auxotróficos, que sob a ação da luz UV, segregam e dão origem a linhagens prototróficas e auxotróficas.

Para melhor esclarecer este resultado as linhagens originais (IZ 987 e ABXR.11B) foram investigadas quanto a esporulação. Foram semeadas em meio rafinose acetato, que é um meio indutor da esporulação, no qual espera-se que linhagens diplóides de leveduras esporulem. Constatou-se que ambas as linhagens foram incapazes de esporular, levando a conclusão de que ou são haplóides ou que sejam diplóides que apresentam alguma dificuldade em esporular.

Como não foi possível determinar com certeza o nível de ploidia da linhagem IZ 987, pode-se basear na hipótese de Whelan & Magee (1981) para tentar explicar a obtenção de somente um tipo de mutante na referida linhagem. A linhagem IZ 987 seria heterozigota para pdx⁺/pdx^- e sob a ação da luz UV, que é um agente indutor de permutas mitóticas, os alelos mutante e selvagem segregariam, originando colônias auxotróficas e prototróficas.

Quanto à taxa de mutação superior da linhagem IZ 987 pode-se levantar os seguintes pontos: (a) foi utilizado o tempo de exposição à luz ultravioleta que permite 5% de sobrevivência determinado para a linhagem ABXR.11B; (b) não foi feito um controle no momento da exposição, para verificar quanto de sobrevivência esta incidência do mutagênico proporcionaria. Estas observações indicam que a exposição da linhagem IZ 987 ao agente mutagênico por 65 segundos apresenta uma taxa de sobrevivência menor, permitindo assim um aumento na taxa de mutação.

As deficiências dos mutantes auxotróficos obtidos foram avaliadas quanto a frequência de reversão espontânea para o estado selvagem. Nenhum revertente foi observado, em 10⁶ células em 5 repetições, para todas as mutações auxotróficas avaliadas (piridoxina, metionina e arginina). Os resultados demonstram estabilidade genética nos mutantes obtidos, permitindo a utilização destes em técnicas genéticas como a fusão de protoplastos.

Curva de crescimento em YEPD: os protocolos que descrevem a obtenção de protoplastos em Saccharomyces cerevisiae, bem como em outros gêneros de leveduras ou até mesmo em fungos filamentosos, fazem uso das culturas na fase exponencial de crescimento (Svoboda, 1978); outro, mais especificamente, na metade desta fase (Russel & Stewart, 1979) ou no final dela (Gunge & Tamaru, 1978). Portanto, foi realizado um experimento a fim de determinar o tempo de incubação, de ambos os mutantes selecionados para a obtenção e fusão de protoplastos, em meio YEPD, necessário para que atinjam a metade da fase logarítmica de crescimento.

Os resultados obtidos estão apresentados em forma de curva de crescimento na Figura 2, com base na média de três repetições. Pode-se observar através da Figura 2 que para a linhagem ABXR.11B o tempo necessário para que a cultura atinja a metade da fase log de crescimento foi de 15 horas, enquanto que para a linhagem IZ 987 o tempo necessário foi de 21 horas. Assim esses tempos foram utilizados para a obtenção das células a serem protoplastizadas.

Obtenção e regeneração de protoplastos: variou-se o tempo de exposição das células à enzima protoplastizadora para tentar otimizar um protocolo de obtenção e regeneração de protoplastos. Os resultados obtidos quanto a obtenção e regeneração dos protoplastos de ambas as linhagens são apresentados na TABELA 2.

A porcentagem de formação de protoplastos não aumentou com o tempo de exposição das células na enzima lítica, uma vez que no primeiro tempo de análise (30 minutos), já se verificou uma protoplastização de quase 100%. Estes dados sugerem que a taxa de protoplastização já havia atingido um platô aos 30 minutos de exposição à enzima lítica. Hamlyn et al. (1981) obtiveram uma curva de produção de protoplastos em Penicillium chrysogenum, na qual a produção se mostrou constante no período entre 2 e 3 horas de exposição, isto após um período de aumento crescente na taxa de produção de protoplastos.

Quanto à relação tempo de exposição na enzima lítica versus porcentagem de regeneração, a linhagem IZ 987 apresentou comportamento esperado, pois o maior tempo na enzima leva a retirada total da parede celular e portanto a regeneração se torna mais díficil. Gunge & Tamaru (1978) obtiveram resultados semelhantes, onde constataram que quanto maior o tempo de exposição das células à enzima lítica menor o grau de regeneração.

Fusão de protoplastos: uma vez determinado o tempo de exposição à enzima lítica que proporciona uma regeneração razoável (30 minutos), duas linhagens auxotróficas complementares, foram escolhidas para serem submetidas a fusão. A linhagem ABXR.11B apresentava deficiência para arginina (arg^-), enquanto a linhagem IZ 987 requeria piridoxina (pdx^-) e tiossulfato (tio^-), sendo a última necessidade nutricional uma auxotrofia natural da linhagem.

A frequência de fusão obtida (nº de colônias em meio mínimo de regeneração/ nº de colônias em YEPD de regeneração menos o nº de colônias em YEPD) foi de 2,7 x 10^-4. Uma vez que as taxas de reversão das auxotrofias utilizadas foram nulas, pode-se supor que as colônias desenvolvidas no meio mínimo de regeneração foram verdadeiros produtos de fusão citoplasmática. Esta taxa de fusão foi muito menor que a obtida por Farahnak et al.(1986), entre linhagens auxotróficas de Saccharomyces cerevisiae e Kluyveromyces fragilis (7x10^-1). Trabalhando com Saccharomyces cerevisiae Gunge & Tamaru (1978) obtiveram uma frequência de colônias prototróficas de cerca de 1 para cada 10⁶ pares de protoplastos submetidos a fusão.

Os produtos de fusão citoplasmática foram transferidos para meio mínimo. Pode-se observar que 54,6% das colônias transferidas mantiveram a capacidade de crescimento neste meio de cultura. As colônias que não foram capazes de manter o seu crescimento no meio mínimo, provavelmente eram heterocários instáveis que dissociaram os núcleos parentais auxotróficos. Esta mesma situação foi verificada por Fungaro et al. (1992) quando analisavam produtos de fusão em Candida sp., que observaram que cerca de 86% das colônias obtidas em meio mínimo de regeneração, segregavam as marcas parentais, sendo, portanto, heterocários instáveis. Fournier et al.(1977) encontrou 70% de produtos de fusão estáveis em Candida tropicalis.

Entre os produtos de fusão com capacidade de crescimento em meio mínimo, um deles o PF 70, foi feita uma suspensão celular e a mesma foi semeada em meio mínimo e YEPD. Após o crescimento das colônias procedeu-se a contagem e verificou-se que o número médio de colônias obtidas nos dois tipos de meio foi semelhante (207 e 227 em YEPD e meio mínimo, respectivamente). Este fato, sugere a estabilidade do produto de fusão em meio sólido e indica uma ocorrência de fusão nuclear. Este resultado vem de encontro àquele obtido por Fungaro et al. (1992), onde o híbrido obtido pela fusão de protoplastos Candida sp. apresentou crescimento semelhante em BDA (Batata Dextrose Agar) e meio mínimo, indicando produtos de fusão nuclear estáveis.

A fim de se determinar a estabilidade dos produtos de fusão em meio líquido completo, uma vez que esta situação é similar ao que ocorrerá na dorna de fermentação, alguns produtos de fusão que mantiveram a prototrofia foram testados quanto à estabilidade. Nenhum dos produtos de fusão analisados manteve a estabilidade após três subcultivos em YEPD líquido, mas, de 12 produtos de fusão testados, 3 apresentaram recombinantes com as características de floculação e não produção de H₂S, conforme se observa na TABELA 3.

Uma provável explicação para a alta instabilidade dos produtos de fusão em YEPD líquido é a grande diferença bioquímica e fisiológica, derivada de um grande distanciamento filogenético existente entre as linhagens. Carrau et al. (1982) observaram que os produtos de fusão obtidos pelos cruzamentos entre Saccharomyces cerevisiae e Schizosaccharomyces pombe eram muito instáveis do ponto de vista genético e produziram diferentes tipos de segregantes.

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que por fusão de protoplastos é possível obter linhagens de levedura altamente floculantes e não produtoras de H₂S. Os genótipos recombinantes foram obtidos pela alta instabilidade dos produtos de fusão, nos quais as características de floculação e não produção de H₂S expressaram-se numa só linhagem. Esses recombinantes necessitam ser analisados quanto as exigências tecnológicas para serem utilizadas como linhagens potencialmente industriais.

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Recebido para publicação em 05.08.97

Aceito para publicação em 07.11.97

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