As enzimas proteolíticas termoestáveis produzidas por microrganismos do gênero Bacillus possuem grande importância comercial, sendo sua aplicação predominante (35%) na indústria de detergentes. Neste trabalho, foi avaliada a produção de proteases pelo termofílico Bacillus sp. SMIA-2, utilizando-se substratos de baixo custo. A fim de verificar a utilidade da protease para aplicações industriais, a estabilidade e a atividade da enzima a diferentes valores de pH e temperatura foram também estudadas. A atividade da protease secretada por Bacillus sp. SMIA-2 em culturas submersas contendo 0,5% (m/v) de pectina de maçã, 0,1% (m/v) de proteínas do soro e 0,3% (m/v) de água de maceração de milho foi máxima após 24 h de incubação da cultura, com níveis de 54,3 U.mg-1 Proteína. A redução na concentração da pectina para 0,3% (m/v) e o aumento nos níveis das proteínas do soro para 0,3% (m/v) no meio de cultura aumentaram a produção da protease, que alcançou sua máxima atividade em 30 h, com níveis de 72,2 U.mg-1 Proteína. Estudos sobre a protease revelaram que as suas características mais importantes foram a alta temperatura ótima para atividade da enzima (70 °C) e a alta estabilidade em uma grande faixa de pH. A protease reteve em torno de 80% de sua atividade original quando incubada à temperatura ambiente por 2 h na faixa de pH entre 6,0 e 12,0. Essas propriedades constituem importantes vantagens para um possível uso da enzima em indústrias de detergentes.

The thermostable proteolytic enzymes produced by the genus Bacillus are commercially very important, being predominantly applied (35%) in detergents. In this work the production of proteases by a thermophilic Bacillus sp. SMIA-2 using low-cost substrates was evaluated. In order to assess the use of the protease for industrial use, the stability of the enzyme activity at different pH values and temperatures was also studied. The protease activity secreted by Bacillus sp. SMIA-2 in submerged cultures containing 0.5% (w/v) apple pectin, 0.1% (w/v) whey protein concentrate and 0.3% (w/v) corn steep liquor reached a maximum after 24 h, with levels of 54.3 U.mg-1 protein. A reduction in the pectin concentration to 0.3% (w/v) and increase in the whey protein levels to 0.3% (w/v) in the culture medium improved the protease production, which reached a maximum after 30 h, with levels of 72.2 U.mg-1 protein. Studies on the characterization of the protein revealed that the most important kinetic properties of the enzyme were the high optimal temperature (70 °C) and high stability in a very broad pH range. The protease retained about 80% of its original activity when incubated at room temperature for 2 h in a pH range between 6.0 - 12.0. These properties represent important advantages for the possible use of the enzyme in detergent industries.

A produção de poligalacturonase pelo termofílico Bacillus sp. SMIA-2 cultivado em culturas líquidas contendo 0,5% (p/v) de pectina de maçã e suplementado com 0,3% (p/v) de água de maceração de milho foi máxima em 36 horas com níveis de 39 U.mL-1. O aumento da concentração da pectina de maçã e da água de maceração de milho no meio de cultura de 0,5 e 0,3%, respectivamente, para 0,65%, afetou de maneira marcante a produção da poligalacturonase, cuja atividade aumentou cerca de quatro vezes, atingindo o valor máximo de 150,3 U.mL-1. Estudos sobre a caracterização da poligalacturonase revelaram que a temperatura para atividade ótima desta enzima foi entre 60-70 °C. Em relação à termoestabilidade da enzima, a poligalacturonase manteve sua atividade em torno de 82 e 63% a 60 e 70 °C, respectivamente, após 2 horas de incubação. O pH para atividade ótima da enzima foi 10,0. Após a incubação da solução enzimática bruta a pH 8,0 por 2 horas à temperatura ambiente, foi observado um decréscimo em torno de 29% de sua atividade original. À pH 10,0 o decréscimo na atividade foi de 25%.

Polygalacturonase production by the thermophilic Bacillus sp. SMIA-2 cultivated in liquid cultures containing 0.5% (w/v) apple pectin and supplemented with 0.3% (w/v) corn steep liquor, reached its maximum after 36 hours with levels of 39 U.mL-1. The increase in apple pectin and corn steep liquor concentrations in the medium from 0.5 and 0.3%, respectively, to 0.65%, markedly affected the production of polygalacturonase, whose activity increased four times, reaching a maximum of 150.3 U.mL-1. Studies on polygalacturonase characterization revealed that the optimum temperature of this enzyme was between 60-70 °C. Thermostability profile indicated that the enzyme retained about 82 and 63% of its activity at 60 and 70 °C, respectively, after 2 hours of incubation. The optimum pH of the enzyme was found to be 10.0. After incubation of crude enzyme solution at room temperature for 2 hours at pH 8.0, a decrease of about 29% on its original activity was observed. At pH 10.0, the decrease was 25%.

Thermophilic Bacillus sp. SMIA-2, produced protease when grown on apple pectic, whey protein and corn step liquor medium, whose concentration was varied from 3 to 10 gL-1, according to the central composite design 2³. The experiments were conducted in shaker, at 50 °C, 150 rpm and initial pH 6.5. The results revealed that the culture medium affected both, cell growth and enzyme production. After graphical and numerical optimization procedure, the enzyme production reached its maximum value at 30 h fermentation, reaching, approximately, 70 U protein mg-1, suggesting that this process was partially associated to the growth.

A produção de proteases pelo termofílico Bacillus sp cepa SMIA-2 cultivado em culturas líquidas contendo maltose (1%) e suplementada com proteínas de soro (0,1%) e água de maceração de milho (0,3%) alcançou o máximo em 14 h, com níveis de 42 U/mg proteína. O microrganismo foi capaz de utilizar várias fontes de carbono, mas a atividade da protease variou com cada fonte. Amido e maltose foram as melhores fontes para a secreção da protease, enquanto lactose e sacarose não foram muito efetivas. O aumento da concentração de maltose no meio de cultura até 1% melhorou o crescimento do organismo e a atividade da enzima. Em relação à concentração de proteínas do soro e da água de maceração de milho no meio de cultura, 0,1% e 0,2% respectivamente, foram as mais efetivas para a secreção da enzima pelo organismo. Estudos sobre a caracterização da protease revelaram que a temperatura ótima desta enzima foi 70ºC. Em relação a termoestabilidade da enzima, a protease manteve 80% de sua atividade original após 2 h de tratamento a 60ºC. A 70ºC, 70% de sua atividade original foi mantida após 15 min. O pH ótimo para atividade da enzima foi 8,5. Após a incubação da solução enzimática bruta a pH 6,0-10.0 por 2 h a temperatura ambiente, foi observado um decréscimo de em torno de 15% da sua atividade original a pH 8,5. A pH 10,0 o decréscimo na atividade foi de 24%. Na presença de 1.0 M e 5.0 M NaCl, 76% e 37% da atividade da protease foi mantida após 2 h de incubação a 45ºC respectivamente.

Protease production by thermophilic Bacillus sp strain SMIA-2 cultivated in liquid cultures containing 1% maltose as a carbon source and supplemented with whey protein (0.1%) and corn steep liquor (0.3%) reached a maximum at 14 h, with levels of 42 U/mg protein. The microorganism was capable of utilizing a wide range of carbon sources, but protease activity varied according the carbon source. Starch and maltose were the best carbon sources in the present study for protease secretion, while lactose and sucrose were less effective. Increasing maltose concentration in the medium until 1%, improved the growth of the organism and the enzyme activity. Regarding the amounts of corn steep liquor and whey protein in the medium, the concentrations of 0.2% and 0.1% respectively, were considered the most effective for protease secretion by the organism. Studies on the protease characterization revealed that the optimum temperature of this enzyme was 70ºC. Thermostability profile indicated that the enzyme retained 80% of the original activity after 2 h heat treatment at 60ºC. At 70ºC, 70% of the original activity was retained after 15 min heat treatment. The optimum pH of the enzyme was found to be 8.5. After incubation of crude enzyme solution at room temperature for 2 h at pH 6.0-10.0, a decreased of about 15% of its original activity at pH 8.5 was observed. At pH 10.0, the decrease was 24%. In the presence of 1.0 M and 5.0 M NaCl, 76% and 37% of protease activity was retained after 2 h incubating at 45ºC respectively.