Accurate identification of species as biological candidates is the first step in establishing successful biological control programs. In Mexico, Trichogramma parasitoids are identified using morphological characters, which is a laborious procedure made only by experts; in addition, some morphological structures are susceptible to changes due to differences in diet or environment, and consequently there is a latent risk of misidentification. Moreover, morphological identification requires the presence of males, leaving female-only populations unidentifiable. As an alternative to morphological identification, the purpose of this work was to develop a molecular method for the identification of Trichogramma parasitoids from Mexican insectaries. Trichogramma species reared in six insectaries were DNA-identified and subsequently, based on differences in ITS2 sequences, a DNA-multiplex PCR assay was designed to distinguish among those reared species. Thus, discrepancies were found between the reported and DNA-determined species identity, whereas the sample of all the insectaries together was supposed to contain three species of Trichogramma (T. pretiosum, T. exiguum and T. platneri), only two species (T. pretiosum and T. fUentesi) were present. In addition, it was found the presence of unnoticed species replacement. Fortunately, an accurate taxonomic identification of Trichogramma species can be made by using the DNA-multiplex PCR assay that was generated in this work. Additionally, this methodology may identify the native Trichogramma species, whose use in mass rearing projects is uncommon.

La identificación precisa de insectos benéficos es el primer paso en el establecimiento de programas exitosos de control biológico. En México, los parasitoides Trichogramma se identifican mediante caracteres morfológicos, lo cual es un procedimiento laborioso realizado solo por expertos; además, algunas estructuras morfológicas son susceptibles a cambios debido a las diferencias en la dieta o las condiciones ambientales, y por tanto existe el riesgo latente de una identificación taxonómica errónea. Más aún, la identificación morfológica requiere la presencia de machos, dejando a las poblaciones conformadas por solo hembras (partenogenéticas) sin identificar. Como alternativa a la identificación morfológica, el propósito de este estudio fue desarrollar un método molecular para la identificación de parasitoides Trichogramma de insectarios mexicanos. Las especies de Trichogramma reproducidas en seis insectarios se identificaron por ADN y después, con base en diferencias de las secuencias de ITS2, se diseñó una prueba PCR-múltiple para distinguir entre las especies reproducidas. Así, se encontraron discrepancias entre la identidad reportada y la determinada por ADN: se suponía que las muestras de todos los insectarios contenían tres especies de Trichogramma (T. pretiosum, T. exiguum y T. platneri), pero solo hubo dos especies (T. pretiosum y T. fuentesi) presentes. Además, se encontró la presencia de especies de reemplazo. Afortunadamente, utilizando la prueba PCR ADN-múltiple generada en este estudio puede hacerse una identificación taxonómica exacta de las especies de Trichogramma. Además, esta metodología puede identificar las especies nativas de Trichogramma, cuyo uso en proyectos de reproducción masiva es rara.

Quality of mass-reared biological control agents is vital. There are reports that Trichogramma spp. failed to control the target pest, and poor quality may explain these failures. The first goal of this study was to determine which way of reproduction was practiced by Trichogramma spp. colonies from Mexican insectaries, either sexual or asexual, and the second goal was to determine whether those Trichogramma spp. colonies meet the quality standards suggested by the International Organization for Biological Control/ European Community (IOBC/EC). In March 2010, a letter was sent to 27 Trichogramma spp. producers. Six insectaries agreed to participate and sent dead samples of its colonies, a total of 10 colonies. For statistical analysis these colonies were grouped by species, either Trichogramma pretiosum or T. fuentesi. None of the Trichogramma spp. colonies were infected by parthenogenetic-inducing Wolbachia, i.e., all colonies reproduced sexually. Therefore, quality standards for sexual species were used: sex ratio (proportion females) ≥0.5, embryonic mortality ≤20 %, and total fecundity ≥40 eggs. Among the 10 Trichogramma spp. colonies there was great uniformity in sex ratio, embryonic mortality and total fecundity, i.e., per species there were not statistical differences among colonies. In sex ratio (0.552±0.038) and embryonic mortality (21± 4.48 %) the nine colonies of T. pretiosum barely fulfilled the minimum standards suggested by the IOBC/EC. Using hind tibia length as a proxy of total fecundity, the fecundity (37.85 eggs) of nine colonies of T. pretiosum and two colonies of T. fuentesi fell slightly below the standard suggested by the IOBC/EC. In México only sexual species of Trichogramma are mass-reared, but at low host densities asexual species (compared with sexual species) are more effective controlling the target pest. So, Mexican insectary personnel should also rear asexual species, and release one or the other depending of host density.

La calidad de los agentes de control biológico producidos masivamente es vital. Existen reportes de que Trichogramma spp. no controla la plaga objetivo y su mala calidad puede explicar este fracaso. El primer objetivo de este estudio fue determinar qué forma de reproducción, ya sea sexual o asexual, se practicó en las colonias de Trichogramma spp. de insectarios mexicanos, y el segundo objetivo fue determinar si esas colonias de Trichogramma spp. cumplen con los estándares de calidad sugeridos por la Organización Internacional para el Control Biológico/Comunidad Europea (IOBC/EC, por sus siglas en inglés). En marzo de 2010, se envió una carta a 27 productores de Trichogramma spp. Seis insectarios aceptaron participar y enviaron muestras muertas de sus colonias, un total de 10 colonias. Para el análisis estadístico estas colonias se agruparon por especies, Trichogramma pretiosum o fuentesi. Ninguna de las colonias de Trichogramma spp. estaba infectada de Wolbachia, que induce la partenogénesis, es decir, todas las colonias se reprodujeron sexualmente. Por ende, se usaron los estándares de calidad para especies sexuales: proporción sexual (proporción de hembras) ≥0.5, mortalidad embrionaria ≤20 % y fecundidad total ≥40 huevos. Entre las 10 colonias de Trichogramma spp. hubo gran uniformidad en la proporción sexual, la mortalidad embrionaria y la fecundidad total, es decir, no hubo diferencias estadísticas entre las colonias por especie. En la proporción sexual (0.552 ±0.038) y la mortalidad embrionaria (21± 4.48 %), nueve colonias de T. pretiosum apenas cumplieron con los estándares mínimos sugeridos por la IOBC/EC. Con la longitud de la tibia posterior como proxy para fecundidad total, la fecundidad (37.85 huevos) de nueve colonias de T. pretiosum y dos colonias de T. fuentesi se ubicó ligeramente debajo del estándar sugerido por la IOBC/EC. En México se producen sólo especies sexuales de Trichogramma, pero con densidades bajas del huésped las especies asexuales (comparadas con las especies sexuales) son más efectivas para controlar la plaga objetivo. Pot lo tanto, el personal de los insectarios mexicanos debería también reproducir especies asexuales y liberar una o la otra dependiendo de la densidad del huésped.

By comparing their population parameters, fecundity and sex ratio, we examined the performance of four genetically variable populations of Trichogramma pretiosum Riley, two highly inbred pure lines (98%) with low and high performance (2 and 43 respectively) and two genetically variable lines (product of 26 inbred lines) with 2 or 40 generations. The population parameters determined were Ro, T, and λ as r m and fertility, and the overall results indicate significant differences between all the lines. The genetically variable line with two generations had the best performance, then the genetically variable with 40 generations, then line 43 and finally the pure line 2. Fertility and sex ratio were observed at 48 h and compared to overall. After 48 hours, no significant differences were found in fertility between the genetically variable lines to pure line 43. After 48 h, the sex ratio did not differ significantly between the two genetically variable lines and the pure line 43. However, total sexual ratios showed higher number of males in the genetically variable lines.

Mediante la comparación de sus parámetros poblacionales, fecundidad y tasa sexual, se evaluó el desempeño de cuatro poblaciones de Trichogramma pretiosum Riley: dos líneas puras altamente endogámicas (98%) con bajo y alto desempeño (2 y 43 respectivamente) y dos líneas genéticamente variables (producto de la combinación de 26 líneas puras) con 2 y 40 generaciones. Los resultados muestran que tanto en los parámetros poblacionales Ro, T, λ y r m, como en la fecundidad, la línea genéticamente variable con dos generaciones presenta los mejores resultados seguido de la genéticamente variable con 40 generaciones, después se ubica a la línea 43 y por último a la línea pura 2. Se compara la fecundidad y proporción sexual observada a las 48 h y total. La fecundidad a las 48 h no presenta diferencias significativas en entre las líneas genéticamente variables y la línea pura 43. La proporción sexual observada a las 48 h, no presenta diferencias significativas entre las dos líneas genéticamente variables y la línea pura 43, relación que cambia en la proporción sexual total, donde se observó que las líneas genéticamente variables producen un mayor número de machos en los días subsecuentes.

A história da taxonomia de Trichogramma teve um grande avanço com a descoberta dos caracteres morfológicos do macho. Entretanto, nem todas as espécies puderam ser facilmente identificadas. Em alguns casos, a identificação específica tornou-se impossível devido à ausência de insetos machos (condição das espécies telítocas infectadas por Wolbachia). Esse problema foi resolvido com a eliminação da bactéria por meio de tratamentos com uso de antibióticos e altas temperaturas. T. cacoeciae é a única espécie relatada até o momento cuja condição de telitoquia não é induzida por infeccção da bactéria Wolbachia, sendo necessário um novo método para identificação desta espécie. Resultados de alta confiabilidade têm sido obtidos na identificação específica de Trichogramma via sequenciamento da região ITS2 (Internal transcribed spacer 2). T. cacoeciae foi identificado com essa técnica e relatado pela primeira vez no Peru. A situação atual de T. cacoeciae na América do Sul é discutida.

Discovery of male morphological characters for species identification was a great improvement in Trichogramma systematic. However, not all species could be easily identified. In some cases, the lack of males (thelytokous status of species that carry the Wolbachia symbiont) made Trichogramma identification impossible. This problem was solved via antibiotic and heating treatments for elimination of the bacteria and allowing the production of males. The only Trichogramma species reported in which thelytoky is not induced by bacterial infection is T. cacoeciae, so here another means of species identification is needed. This species was identified based on the ITS2 (Internal transcribed spacer 2) sequence, a modern technique that has been proved useful in providing a reliable identification of Trichogramma species. Here we report the first occurrence of T. cacoeciae in Peru and we discuss its distribution in South America.

O sequenciamento da região ITS2 (espaço interno transcrito) do rDNA foi utilizado para identificar duas espécies próximas de Trichogramma: T. rojasi e T. lasallei, esta última recentemente constatada no Brasil. O DNA das amostras foi extraído utilizando-se Chelex 100. O produto de PCR foi ligado ao vetor pGEM-T ® e ambos foram então acondicionados em placas de Petri para o crescimento de colônias brancas, o que constata a ligação correta entre o vetor e o DNA. A partir dessas colônias, uma pequena quantidade (10µl) foi purificada utilizando material específico e seqüenciada. As seqüências foram alinhadas pelo programa ESEE 3.0. Os primers específicos utilizados para a amplificação do rDNA da região ITS2 das espécies de Trichogramma estudadas foram eficientes. O sequenciamento das duas espécies diferiu em comprimento e posição dos nucleotídeos, mostrando que são distintas. Os resultados mostraram que esta é uma boa técnica para identificação de espécies crípticas de Trichogramma, difíceis de identificar quando são utilizados apenas caracteres morfológicos.

The sequence of the ITS2 (internally transcribed spacer 2) region of the rDNA was used to identify two closely related Trichogramma species: T. rojasi and T. lasallei, the second species recently reported in Brazil. The DNA of the samples was extracted using Chelex 100. The PCR product was linked to a pGEM-T® vector and both were then placed into Petri dishes to grow white colonies, which demonstrate the correct ligation between the vector and the DNA. From these colonies, 10µl were purified and sequenced using a special kit, and the sequences aligned using the ESEE 3.0 software. Specific primers were efficient to amplify the ITS2 rDNA region of the Brazilian Trichogramma. The sequence of each species differed in length and in nucleotide position, showing that they are distinct. Thus, the results show that this technique is a good tool to identify Trichogramma cryptic species, otherwise difficult to identify when using only morphological characters.

Comparou-se o efeito da suspensão temporária do fornecimento de hospedeiros sobre a reprodução e sobrevivência de Trichogramma kaykai Pinto & Stouthamer infectado e não infectado com Wolbachia. Ovos de Trichoplusia ni Hübner (Lepidoptera: Noctuidae) foram utilizados como hospedeiro. A progênie de fêmeas arrenótocas e telítocas foi reduzida com o aumento do período de ausência de hospedeiros, contudo fêmeas arrenótocas produziram significativamente mais progênie independentemente do período de ausência de hospedeiros (0 a 10 dias). Essas fêmeas produziram também um número maior de filhas. A ausência de hospedeiros não afetou o número de indivíduos emergentes por hospedeiro quando se consideraram as duas formas reprodutivas isoladamente. Por outro lado, menor número de parasitóides emergiu em ovos parasitados por fêmeas telítocas. Uma relação positiva existiu entre a duração da ausência de hospedeiros e a longevidade. Fêmeas arrenótocas viveram significativamente mais que fêmeas telítocas. Os resultados revelaram que as duas formas reprodutivas responderam de forma similar quando sujeitas a períodos de ausência de hospedeiro (de até 10 dias). Fêmeas arrenótocas, contudo foram mais fecundas e viveram mais que fêmeas telítocas em todos os tratamentos avaliados.

The effect of temporary host deprivation on the reproduction and survival of Trichogramma kaykai Pinto & Stouthamer was determined by comparing a Wolbachia-infected (thelytokous) and an arrhenotokous line of T. kaykai when reared on Trichoplusia ni Hübner (Lepidoptera: Noctuidae) eggs. The progeny produced by both arrhenotokous and thelytokous females decreased with increasing periods of host deprivation, but arrhenotokous females produced significantly more progeny than thelytokous females regardless of the period of host deprivation (0 to 10 days). They also produced more daughters. Host deprivation did not affect brood size within arrhenotokous or thelytokous lines. However, fewer wasps emerged from hosts parasitized by Wolbachia-infected than by uninfected T. kaykai. A direct relationship existed between longevity and the length of time an arrhenotokous or a thelytokous wasp was deprived of hosts. The longer the deprivation period, the longer they lived. However, arrhenotokous females lived longer than their thelytokous counterparts. These findings showed that temporary host deprivation (up to 10 days) affected both reproductive forms similarly. However, in all conditions studied arrhenotokous wasps produced more progeny and lived longer than their thelytokous counterparts.

Infecções causadas por Wolbachia resultando em indivíduos paternogenéticos são comuns dentro do gênero Trichogramma. Contudo, os efeitos do microrganismo sobre a fecundidade e sobrevivência dos parasitóides têm sido relativamente pouco estudados. O objetivo desse estudo foi determinar os efeitos da bactéria na sobrevivência e reprodução de Trichogramma kaykai Pinto & Stouthamer, comparando indivíduos infectados (telítocos) com indivíduos curados através de antibiótico (arrenótocos), ambos criados em ovos de Trichoplusia ni Hübner. Fêmeas curadas produziram significativamente mais progênie, além de maior número de filhas que as fêmeas infectadas. Um número significativamente maior de indivíduos emergiu de ovos parasitados por fêmeas arrenótocas do que de ovos parasitados por fêmeas telítocas. As fêmeas não infectadas, contudo, viveram menos que as fêmeas infectadas. Fêmeas curadas apresentaram maturação de ovos mais rápida que fêmeas infectadas.

Parthenogenetic inducing Wolbachia infections are particularly common in the genus Trichogramma, but the influence of the microrganism on parasitoids' fitness has received relatively little attention. The aim of this study was to determine the effects of the bacteria on the survival and reproduction of Trichogramma kaykai Pinto & Stouthamer, comparing an infected line (thelytokous) with an antibiotically cured (arrhenotokous) line, both reared on Trichoplusia ni Hübner eggs. Cured wasps produced significantly more progeny and more daughters than Wolbachia-infected wasps. Significantly more wasps emerged per host when parasitized by the arrhenotokous females than by the thelytokous females. Cured females, however, lived significantly less than infected females. Eggs of cured females matured faster than infected ones.

Identificou-se pela primeira vez no Brasil a presença de Wolbachia em Trichogramma através de um PCR com o primer específico wsp. A população de Trichogramma atopovirilia Oatman & Platner foi coletada na Embrapa Milho e Sorgo, em ovos de Helicoverpa zea Boddie (Lepidoptera: Noctuidae). Os resultados mostraram através da amplificação de bandas de DNA, a confirmação da presença de Wolbachia na população em estudo. A presença dessa a-proteobactéria irá contribuir para a escolha da população correta a ser utilizada em programas de controle biológico aplicado contra lepidópteros pragas.

For the first time in Brazil, Wolbachia was detected in Trichogramma using PCR with the wsp specific primer. A Trichogramma atopovirilia Oatman & Platner population was colected in Helicoverpa zea Boddie (Lepidoptera: Noctuidae) eggs at Embrapa/Sete Lagoas. The results showed that the amplification of DNA bands, confirms the presence of Wolbachia on the analysed population. The presence of this a-proteobacteria will contribute for the correct choice on which population will be used for applied biological control programs against lepidopterous pests.

Utilizando-se o sequenciamento da região ITS2 do DNA ribossomal juntamente com algumas enzimas de restrição, pôde-se construir uma chave molecular simples e precisa de algumas espécies brasileiras de Trichogramma. Esta chave é fácil de ser elaborada e resultados rápidos são obtidos na identificação desse pequeno parasitóide (0,25 mm). Usando-se essa metodologia, pode-se também verificar possíveis contaminações em criações de laboratório.

Using the ITS2 sequences of the ribosomal DNA together with some restriction enzymes, a simple and precise molecular key to some Brazilian species of Trichogramma was created. This key is very easy to make and quick results can be obtained on the identification of this minute parasitoid (0.25 mm). The methodology presented is easily implemented and can be used to detect possible contaminations under laboratory rearings.