RESUMO: Dentre os problemas fitossanitários da videira, os vírus se destacam pela capacidade de reduzir a qualidade e o rendimento da uva. No entanto, detectar e identificar infecções virais em videiras pode ser um desafio. O objetivo do estudo foi realizar um sequenciamento de alto rendimento (HTS) para determinar os patógenos virais presentes em uma videira com sintomas de virose e elucidar a etiologia. Com o HTS foi detectada, em uma videira híbrida com leve enrolamento dos bordos foliares, a presença de quatro vírus e viroides, os quais provavelmente estavam implicados com os sintomas observados. Os genomas completos determinados mostraram altas identidades genéticas com isolados previamente caracterizados de patógenos homólogos. RESUMO uva entanto desafio (HTS etiologia detectada foliares viroides observados homólogos

ABSTRACT: Among phytosanitary problems of the grapevine, viruses stand out for their capacity of reducing the quality and yield of grapes. However, detecting and identifying viral infections in grapevines can be challenging. This study performed a high throughput sequencing (HTS) of the viral pathogens present in a vine showing virus-like symptoms to elucidate the etiology. HTS analysis reported in a hybrid grapevine with mild curling down of leaf edges, the presence of four viruses and viroids, which were probably implicated in the observed symptoms. The determined complete genomes showed high genetic identities with previously characterized isolates of homologous pathogens. ABSTRACT grapes However challenging (HTS viruslike virus like etiology edges viroids

RESUMO: Physalis rugose mosaic virus (PhyRMV) causa danos severos em Physalis peruviana L., afetando características vegetativas, a quantidade e qualidade de frutos. Os objetivos desse estudo consistem na caracterização molecular do PhyRMV associado a P. peruviana coletada em campos de produção em Lages, Santa Catarina, Brasil; e avaliar a transmissão do vírus por sementes. Plantas apresentando sintomas de mosaico, deformação e nanismo foram coletadas de P. peruviana. Amostras foliares dessas plantas foram utilizadas para extração de RNA de fita dupla, síntese de biblioteca de cDNA e sequenciamento de alto rendimento. No experimento de transmissão, sementes obtidas de plantas infectadas por PhyRMV foram utilizadas, e a infecção viral nas plântulas foi avaliada por inspeção visual de sintomas e diagnóstico molecular. O RNA viral apresentou 4162 nucleotideos (nts), a organização genômica foi similar à de outros sobemovírus e apresentou 97% de identidade de nucleotídeos com o isolado de Piracicaba de PhyRMV previamente caracterizado. Os resultados obtidos sugerem que é improvável a transmissão de PhyRMV por sementes de physalis.

ABSTRACT: Physalis rugose mosaic virus (PhyRMV) causes severe damage to Physalis peruviana L., affecting vegetative parameters, fruit quantity and quality. The aim of this study was to perform a molecular characterization of PhyRMV associated with P. peruviana from commercial fields in the municipality of Lages, Santa Catarina State, Southern Brazil, and to evaluate its transmission by seeds. Plants displaying mosaic, dwarfism, and leaf malformation symptoms were collected from P. peruviana. Double-stranded RNA was extracted and submitted to cDNA library synthesis and high-throughput sequencing (HTS). For the virus transmission assay, seeds from PhyRMV-infected plants were used, and viral infection in seedlings was verified using symptomatic and molecular diagnosis. PhyRMV RNA has 4162 nucleotides (nts) and a genomic organization similar to that of other sobemoviruses and shares 97% nt identity with the previously characterized PhyRMV Piracicaba isolate. Results indicated the unlikely transmission of PhyRMV by physalis seeds.

ABSTRACT Among grapevine (Vitis spp.) pathogens, viruses stand out, considering that this fruit plant is broadly susceptible to them and that they cause several diseases, reducing quality and yield of grape production. However, detecting and identifying viral infections in grapevines can be challenging. The objectives of this study were to detect grapevine viral pathogens by high-throughput sequencing (HTS) and identify grapevine viruses associated with plant propagation material from different origins. A comprehensive picture of a vine exhibiting virus-related symptoms was generated. The detected virome included four different pathogens and their variants. In addition, the incidence of seven viral pathogens was determined in samples collected in three vineyards of the main grape-growing region of Brazil. It is suggested that the observed infections could be related to the technological level of the production system adopted by these grape growers.

ABSTRACT: The aims of this study were to determine the prevalence of viruses in 119 samples from 32 grapevine cultivars, collected from nine vineyards in a specific grape-growing area in southeastern Brazil, perform a partial molecular characterization of 14 isolates of Grapevine Syrah virus 1 (GSyV-1) and Grapevine leafroll-associated virus 3 (GLRaV-3) and assess the coat protein genetic variability of these viruses. The detection of viruses was implemented by real-time RT-PCR (reverse transcription polymerase chain reaction) aiming to detect seven viruses and one viroid. With the exception of the Grapevine Cabernet Sauvignon reovirus (GCSV), the viruses and viroid that were evaluated were widespread in the sampled areas, often in high prevalence and multiple infections, ranging from 15 % up to 76 %. Eight isolates of GSyV-1 and six of GLRaV-3, partially characterized by complete coat protein gene nucleotide sequencing and a variability study showed nucleotide identities ranging from 91 % to 99 % (GSyV-1) and from 98 % to 100 % (GLRaV-3) among themselves, respectively. Comparisons between conventional and real-time RT-PCR detections were implemented for GSyV-1 and GLRaV-3 infections. Analysis of genetic variability indicated molecular differences between GSyV-1 and GLRaV-3 isolates and negative selection acting on the coat protein gene of both viruses. This is the first report of GSyV-1 in commercial vineyards in Brazil. The survey revealed widespread infections of seven important pathogens in one prominent Brazilian grape-producing region implying contaminated grapevine cuttings in the spread of disease.

RESUMO: O GRSPaV é um dos vírus mais comuns da videira. Está associado à doença transmissível por enxertia denominada caneluras de rupestris que compõe o complexo do lenho rugoso. O objetivo do trabalho foi realizar a caracterização molecular do gene da proteína capsidial (CP) de 16 isolados brasileiros de GRSPaV visando determinar a ocorrência de variantes moleculares desse vírus. Nove amostras de videira foram avaliadas das quais foi extraído dsRNA. As sequências de nucleotídeos foram geradas pelo sequenciamento de nova geração (NGS). Quinze sequências completas do gene CP de GRSPaV foram obtidas e filogeneticamente analisadas. Os alinhamentos múltiplos entre as sequências mostraram identidades de nucleotídeos variando de 82% a 99%, sugerindo alta variabilidade entre as CPs de isolados brasileiros. O estudo revelou que a variabilidade genética de GRSPaV compreendendo três variantes moleculares também está presente nos genótipos de videira no Brasil.

ABSTRACT: Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV) is one of the most common viruses of grapevine. It is involved in the graft-transmissible disease rupestris stem pitting of the rugose wood complex. The objective of the research was to perform the molecular characterization of the coat protein (CP) gene of sixteen Brazilian GRSPaV isolates aiming to determine the occurrence of molecular variants (strains) of this virus. Nine grapevine samples were evaluated, from which dsRNA was extracted. Nucleotide sequences were generated by Next generation sequencing (NGS). Fifteen complete sequences of the GRSPaV CP gene were obtained and phylogenetically analyzed. Multiple alignments of the sequences showed identities of nucleotides ranging from 82% to 99%, suggesting high variability among the CPs of Brazilian isolates. The study revealed that genetic variability of GRSPaV comprising three molecular variants is also present in Brazilian grapevine genotypes.

RESUMO A videira (Vitis spp.) é propagada vegetativamente e considerada uma das principais culturas frutíferas por sua importância socioeconômica mundial. Ela é suscetível a vários agentes transmitidos por meio da enxertia, os quais causam diversas doenças e significativas perdas na produtividade e produção, redução na qualidade dos frutos, no vigor da planta e na longevidade dos vinhedos. A propagação vegetativa e o frequente intercâmbio de material propagativo entre países contribuem para a disseminação destes patógenos, favorecendo a emergência de doenças complexas. Seu ciclo de vida perene acelera ainda mais a mistura e a introdução de vários agentes virais em uma mesma planta. Atualmente, aproximadamente 65 vírus pertencentes a diferentes famílias foram reportados infectando videiras, embora nem todos causem doenças economicamente relevantes. As viroses do enrolamento da folha, complexo do lenho rugoso, degenerescência e mancha-das-nervuras da videira são as quatro principais desordens que têm importância econômica mundial. Além disso, novas espécies e estirpes virais foram identificadas e associadas a limitações economicamente importantes para a produção de uvas. Em vinhedos brasileiros, dezoito espécies virais, três viroides e duas doenças semelhantes a viroses já tiveram sua ocorrência reportada e foram molecularmente caracterizados. Aqui, nós revisamos o conhecimento atual dessas viroses, os recentes avanços na diagnose e prospecção viral, e fornecemos recomentações sobre o manejo das viroses da videira.

ABSTRACT Grapevine (Vitis spp.) is a major vegetative propagated fruit crop with high socioeconomic importance worldwide. It is susceptible to several graft-transmitted agents that cause several diseases and substantial crop losses, reducing fruit quality and plant vigor, and shorten the longevity of vines. The vegetative propagation and frequent exchanges of propagative material among countries contribute to spread these pathogens, favoring the emergence of complex diseases. Its perennial life cycle further accelerates the mixing and introduction of several viral agents into a single plant. Currently, approximately 65 viruses belonging to different families have been reported infecting grapevines, but not all cause economically relevant diseases. The grapevine leafroll, rugose wood complex, leaf degeneration and fleck diseases are the four main disorders having worldwide economic importance. In addition, new viral species and strains have been identified and associated with economically important constraints to grape production. In Brazilian vineyards, eighteen viruses, three viroids and two virus-like diseases had already their occurrence reported and were molecularly characterized. Here, we review the current knowledge of these viruses, report advances in their diagnosis and prospection of new species, and give indications about the management of the associated grapevine diseases.

RESUMO: A quantificação absoluta determina a quantidade absoluta de um ácido nucleico alvo expressa como número de cópias ou concentração. O conhecimento das concentrações virais em culturas comerciais tem grande relevância para assegurar um diagnóstico confiável. O objetivo deste trabalho foi realizar uma quantificação absoluta de cinco vírus em videiras infectadas (Vitis spp.). Diferentes quantidades conhecidas da amostra padrão (cDNA viral clonado ou RNA viral transcrito in vitro) foram quantificadas por RT-qPCR TaqMan. A partir destes dados, curvas padrão foram geradas plotando-se os valores de Ct (ciclo limiar) contra o log da quantidade da amostra padrão. Amostras de videiras infectadas foram avaliadas visando-se determinar os títulos virais que foram bastante variáveis. Este resultado contribui para melhorar o diagnóstico viral ao quantificar com precisão variações no título viral em videiras.

ABSTRACT: The absolute quantification determines the absolute amount of a targeted nucleic acid expressed as a copy number or concentration. The knowledge of virus concentrations in commercial crops possesses high relevance to ensure a reliable diagnosis. The objective of this study was to perform an absolute quantification of five viruses in infected grapevines (Vitis spp.). Different known amounts of the standard sample (cloned viral cDNA or in vitro transcribed viral RNA) were quantified by TaqMan RT-qPCR. Based on these data, standard curves were generated plotting Ct values (threshold cycle) against the log of the standard sample amount. Infected grapevine samples were evaluated to determine virus titers, which were highly variable. This result may contribute to improve virus diagnosis by accurately quantifying virus titre variations in grapevines.

RESUMO A propagação de videiras a partir dos métodos clássicos de enxertia e em escala comercial teve origem há mais de 130 anos. Este sistema permaneceu artesanal até meados da década de 1950, quando se iniciaram os primeiros programas internacionais para certificação com foco na obtenção de plantas básicas com elevada sanidade para vírus. No fim da década de 1960 surgiu a necessidade de aumentar a escala para produção em um modelo industrial em que a muda apresentasse um padrão morfológico mínimo. Ao longo da década de 1970, aprofundaram-se as pesquisas relacionadas à automatização da prática de enxertia, à higienização do processo, ao uso de reguladores de crescimento e ao entendimento dos eventos fisiológicos da compatibilidade entre enxerto e porta-enxerto, formação de calos e enraizamentos. Assim, até meados dos anos 2000, os esquemas de certificação e o processo de propagação pouco evoluíram em termos técnicos. Porém, na medida em que a área vitivinícola foi expandindo e a demanda por mudas aumentado verificou-se que novas pragas se alastravam em escala global a partir de viveiros contaminados. Estas novas doenças (complexos virais, fitoplasmas, bactérias e fungos causadores de podridões vasculares), foram sendo descobertas à medida que os métodos de diagnose avançaram em sensibilidade de detecção. Hoje, surge uma nova discussão no segmento viveirista mundial fundamentada no fato de que o processo de propagação está sendo revisto sob o foco da redução de incidência das novas pragas e mínimo dano à muda ao longo das etapas da produção. Surgem assim, inovações tecnológicas, tanto em equipamentos quanto em práticas e insumos, sendo incorporadas aos novos modelos de certificação. Mas, se por um lado, estes esquemas tornam-se cada vez mais multidisciplinares, por outro, a complexidade gerada pode trazer dificuldades para a adesão pelos viveiristas.

ABSTRACT Grapevine production by classical grafting methods and in commercial scale emerged over 130 years. This system remained handmade until the mid-1950s, when the first international certification programs aimed at obtaining mother plants with high viral sanity emerged. The necessity to increase the scale of production on industrial model and plant material production based on minimum morphological standards appeared at the end of the 1960s. Along the 1970s, research unlocked knowledge on semi-automated grafting, process hygiene, use of plant growth regulators and understanding of physiological events of rootstock-scion compatibility, callus formation and rooting. So, until the mid-2000s, certification schemes and propagation processes advanced little in technical standard. However, grapevine growing areas were expanded and demands for plant material increased, and new diseases emerged from contaminated nurseries. These new diseases (new viral complexes, phytoplasmas, bacteria and grapevine trunk diseases) were discovered by high-sensitivity diagnostic methods. Today, there is a new discussion on the nursery segment worldwide. The propagation techniques have been reviewed from the perspective of reducing the incidence of new diseases and minimum physiological damage of nursery plants during the production stages. Therefore, technological innovations regarding equipment, practices and production inputs have been incorporated in new certification schemes. However, despite these advantages, these schemes have become more complex and multidisciplinary than previous ones, bringing difficulties in adaptation of nurserymen.

RESUMO: Inexiste caracterização molecular de isolados brasileiros de Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV), exceto aqueles de pessegueiros. Neste trabalho, o agente causal do mosaico da roseira foi determinado e os genes das proteínas de movimento (MP) e capsidial (CP) de um isolado de PNRSV de roseira foram molecularmente caracterizados pela primeira vez no Brasil. As sequências completas de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos da MP e da CP foram alinhadas e comparadas com outros isolados. Análises das sequências de nucleotídeos da MP e da CP do isolado brasileiro de PNRSV de roseira e outros isolados da mesma hospedeira revelaram altas identidades de 96,7% e 98,6%, respectivamente, sendo o isolado Rose-Br classificado no grupo PV32.

ABSTRACT: There is no molecular characterization of Brazilian isolates of Prunus necrotic ringspot virus (PNRSV), except for those infecting peach. In this research, the causal agent of rose mosaic was determined and the movement (MP) and coat (CP) protein genes of a PNRSV isolate from rose were molecularly characterized for the first time in Brazil. The nucleotide and deduced amino acid sequences of MP and CP complete genes were aligned and compared with other isolates. Molecular analysis of the MP and CP nucleotide sequences of a Brazilian PNRSV isolate from rose and others from this same host showed highest identities of 96.7% and 98.6%, respectively, and Rose-Br isolate was classified in PV32 group.

Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar os efeitos de viroses em videiras sintomáticas e assintomáticas sobre as variáveis agronômicas relacionadas ao vigor das plantas e à qualidade enológica da uva, e comparar os isolados virais obtidos nessas duas condições. Realizaram-se dois experimentos com quatro cultivares. Todas as plantas foram indexadas, por meio da reação em cadeia da polimerase via transcrição reversa (RT-PCR) em tempo real, quanto à provável ocorrência dos seguintes vírus: Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D (GVD), Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV-1 ao -4, GLRaV-4 estirpe 5), Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV) e Grapevine fleck virus (GFkV). As variáveis avaliadas foram: número de gemas brotadas e não brotadas, número de ramos com ou sem cachos, número total de gemas, número de cachos, massa de cachos frescos, massa total de bagas, massa do engaço, número de bagas por cacho, massa média de baga, sólidos solúveis totais, acidez total titulável, pH, massa de ramos podados ou diâmetros do tronco do porta-enxerto e da copa. Os efeitos negativos foram mais pronunciados nas plantas com sintomas de viroses; no entanto, constatou-se frequentemente que plantas sem sintomas também estavam infectadas. A análise molecular de GRSPaV, GVA e GLRaV-2, isolados de plantas sintomáticas e assintomáticas, resultou em alta percentagem de identidade de nucleotídeos entre isolados homólogos.

Abstract: The objective of this work was to evaluate the effect of viroses in symptomatic and asymptomatic grapevines on the agronomic variables related to the plant vigor and the enological quality of grapes, and to compare viral isolates obtained from these two conditions. Two experiments were performed with four cultivars. All plants were indexed by real time, reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) for the probable occurrence of the following viruses: Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine virus D (GVD), Grapevine leafroll-associated virus (GLRaV-1 to -4, GLRaV-4 strain 5), Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV), and Grapevine fleck virus (GFkV). The evaluated variables were: number of buds burst and not burst, number of branches with or without bunches, total number of buds, number of bunches, fresh bunch weight, total berry weight, rachis weight, number of berries per bunch, average berry weight, total soluble solids, total titratable acidity, pH, pruned branch weight, or rootstock and scion trunk diameters. The negative effects were more pronounced on the plants with virus symptoms; however, it was observed that plants without symptoms were also often infected. The molecular analysis of GRSPaV, GVA, and GLRaV-2, isolates from symptomatic and asymptomatic plants, resulted in a high percentage of nucleotide identities between homologous isolates.

Os objetivos deste trabalho foram identificar as espécies virais presentes em vinhedos comerciais de duas regiões do Nordeste do Brasil e realizar a caracterização molecular parcial de isolados de três espécies virais. A diagnose foi realizada por meio de RT-PCR em tempo real para a detecção de Grapevine rupestris stem pitting-associated virus (GRSPaV), Grapevine virus A (GVA), Grapevine virus B (GVB), Grapevine leafroll-associated virus 2, 3 e 4 (GLRaV-2, -3 e -4), Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine rupestris vein feathering virus (GRVFV) e Grapevine fanleaf virus (GFLV). Exceto para GFLV, os vírus avaliados estão amplamente disseminados nas áreas amostradas, frequentemente em altas incidências e em infecções múltiplas, de até 98% e 76,4%, na Zona da Mata e no Vale do São Francisco, respectivamente. Isolados locais de GVA, GVB e GLRaV-3 foram parcialmente caracterizados com base na sequência completa de nucleotídeos do gene da proteína capsidial e apresentaram alta porcentagem de identidade de nucleotídeos com outros isolados brasileiros: 91,2% (GVA), 99,8% (GVB) e 99,7% (GLRaV-3)

The objectives of this study were to identify viral species infecting commercial vineyards in two regions of Northeastern Brazil and perform partial molecular characterization of isolates of three virus species. The diagnosis was performed by real time RT-PCR for detection of GRSPaV, GVA, GVB, GLRaV-2, GLRaV-3, GLRaV-4, GFkV, GRVFV and GFLV. Except for GFLV, the evaluated viruses are widespread in the sampled areas, often in high incidences and in multiple infections, up to 98% and 76.4%, in the Zona da Mata and in the Vale do São Francisco regions, respectively. Local isolates of GVA, GVB and GLRaV-3, partially characterized by complete coat protein gene nucleotide sequencing, showed high percentage of nucleotide identities with other Brazilian isolates of these viruses: 91.2% (GVA), 99.8% (GVB) and 99.7% (GLRaV-3)

'BRS Magna' is a-novel cultivar to make grape juice, which presents intermediate productive cycle and wide climatic adaptation, released as an alternative to improve the color, the sweetness and the flavor of grape juice in Brazil.

'BRS Vitória' is a novel cultivar of black seedless table grape. Its main traits meet the most important demands from the viticulture segment in Brazil.It is recommended for cultivation in tropical and subtropical areas, with excellent horticultural performance, high bud fecundity and resistance to downy mildew, the most important disease which affects grapevines in Brazil.

Os vírus Apple stem grooving virus (ASGV), Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), Apple stem pitting virus (ASPV) e Apple mosaic virus (ApMV) são comuns em macieiras e pereiras e alvos prioritários da detecção em materiais propagativos. Este trabalho objetivou demonstrar a viabilidade do método de hibridização com uma sonda não-radioativa para a detecção simultânea desses quatro vírus. A sensibilidade deste teste foi suficientemente alta para permitir a detecção do ASGV, ACLSV, ASPV e ApMV em RNA total extraído de amostras infectadas. A especificidade da sonda foi confirmada pela reação com cDNA viral homólogo, individualmente clonado, para cada vírus.

The viruses Apple stem grooving virus (ASGV), Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV), Apple stem pitting virus (ASPV) and Apple mosaic virus (ApMV) are common in apples and pears and main targets of detection in propagation materials. This study aimed at demonstrating the usefulness of the hybridization method with a non-radioactive probe for simultaneous detection of these four viruses. The sensitivity of this method was sufficiently high enabling the detection of ASGV, ACLSV, ASPV and ApMV in total RNA extracted from infected samples. The probe specificity was confirmed by reaction with homologous viral cDNA, individually cloned for each virus.

Mancha das nervuras, lenho rugoso e enrolamento das folhas são três doenças virais da videira, cujos agentes causais (ou vírus associados) são o Grapevine fleck virus (GFkV), o Grapevine virus D (GVD) e os Grapevine leafroll-associated virus 5 e 6 (GLRaV-5 e -6), respectivamente. O objetivo deste trabalho foi realizar a caracterização molecular parcial de isolados locais dessas quatro espécies virais que infectam videira. As sequências de nucleotídeos e de aminoácidos deduzidos dos genes completos da proteína capsidial (CP) (do GFkV), da CP e da RNA binding protein (do GVD), da CP do GLRaV-5 e parte do gene codificador da hHSP70 do GLRaV-5 e -6 foram alinhadas e comparadas in silico com sequências de outros isolados. Os dados obtidos expandem a informação existente sobre isolados brasileiros de GFkV, GLRaV-5 e - 6 e relatam pela primeira vez a ocorrência do GVD no Brasil.

Grapevine fleck, rugose wood and leafroll are three grapevine viral diseases whose causal agents (or associated viruses) respectively are Grapevine fleck virus (GFkV), Grapevine virus D (GVD) and Grapevine leafroll-associated virus 5 and 6 (GLRaV-5 and -6). The objective of this work was to perform a partial molecular characterization of local isolates of these four viral species that infect grapevines. The nucleotide and deduced amino acid sequences of complete genes of the coat protein (CP) (of GFkV), the CP and the RNA binding protein (of GVD), the CP and the partial hHSP70 gene (of GLRaV-5) and the partial hHSP70 gene (of GLRaV-6) were aligned and compared in silico with other isolates. These data extend the available information about Brazilian isolates of GFkV, GLRaV-5 and -6, and reports for the first time the GVD occurrence in Brazil.