ABSTRACT: Infectious enteritis is highly prevalent among dogs worldwide and, in some cases, it can be fatal. This study describes the clinical and laboratorial findings of single and mixed infections associated with severe enteritis in 76 dogs from Southern Brazil. Intestinal segments and/or fecal samples were subjected to histopathology and molecular detection of DNA viruses, bacteria and protozoa. Severe intestinal lesions were observed in most cases. Single infections were detected in 52.6% of cases, double (36.8%) and triple (10.5%) infections were also identified. Carnivore protoparvovirus 2 (CPV-2) was the most frequent agent in single infections (36.8%). Coinfection by CPV-2 and Giardia spp. was the most common in dual infections (19.7%), followed by CPV-2 and Cryptosporidium spp. (10.5%). The most frequent triple infection was CPV-2, Giardia sp. and Cryptosporidium spp. (6.6%). Our results shown that single and mixed infections are associated with severe enteritis in dogs in southern Brazil, mainly involving CPV-2 and Giardia sp.

RESUMO: Enterites infecciosas são altamente prevalentes entre cães em todo o mundo e, em alguns casos, podem ser fatais. Este estudo descreve os achados clínicos e laboratoriais de infecções simples e mistas associadas a enterites graves em 76 cães do sul do Brasil. Segmentos intestinais e/ou fezes foram submetidos à análise patológica e detecção molecular de vírus de genoma DNA, bactérias e protozoários. Lesões intestinais severas foram observadas na maioria dos casos. Infecções únicas foram detectadas em 52,6% dos casos, e infecções duplas (36,8%) e triplas (10,5%) também foram identificadas. O Protoparvovírus carnívoro 2 (CPV-2) foi o agente mais frequente nas infecções simples (36,8% do total). Coinfecção por CPV-2 e Giardia sp. foi a mais comum em infecções duplas (19,7%), seguido por CPV-2 e Cryptosporidium spp. (10,5%). A tripla infecção mais frequente foi CPV-2, Giardia spp. e Cryptosporidium spp. (6,6%). Nossos resultados demostraram que infecções simples e mistas estão associadas a enterites graves em cães no sul do Brasil, envolvendo principalmente CPV-2 e Giardia sp.

ABSTRACT: This study evaluated the vaccine-induced serological response after administering four commercial formulations containing Bovine Viral Diarrhea Virus (BVDV) type-1, BVDV-2, and Bovine Herpesvirus type 1 (BoHV-1) to young heifers with circulating maternal antibody titers. The study also determined the anamnestic response to vaccinations after the complete metabolization of maternal antibodies when the calves reached six months. Eighty-seven Holstein heifers were selected and randomly distributed into four experimental groups based on the vaccine administered. The four vaccine-based experimental groups were as follows: vaccine A (n = 22), vaccine B (n = 22), vaccine C (n = 24), and vaccine D (n = 19), given on the 60th, 90th, and 180th day of life, respectively. Virus-neutralization (VN) tests were performed at baseline (day 60) and 30 days after administering the second (day 120) and third doses (day 210). We analyzed the effect of vaccine group (P ≤ 0.001), day of vaccination (P ≤ 0.001), and group versus vaccine day interaction (P ≤ 0.001) for antibody titers produced against BVDV-1, BVDV-2, and BoHV-1 using the PROC MIXED method (Statistical Analysis System -SAS 9.4). Antibody titers against BVDV-1, BVDV-2, and BoHV-1 were similar at baseline and on day 60 of life. The mean antibody titers were constant and persisted against BVDV-1 in heifers immunized with vaccines A and C. Heifers immunized with vaccine A alone had a similar effect against BVDV-2. Regarding BoHV-1, the antibody titers decreased between days 60 and 210 in groups B, C, and D. The antibody titer for heifers in group A also decreased between days 60 and day 120, and an intense increase in titers was observed on day 210. After being immunized with formulations B, C, and D, the frequency of animals with titers above protective levels for BVDV-1, BVDV-2, and BoHV-1 was very low or null. Indicators of anamnestic response were observed in heifers vaccinated with formulation A only. Therefore, it can be concluded that passive immunity negatively interferes with antibody production after vaccination.

RESUMO: O objetivo desse estudo foi avaliar a resposta sorológica induzida após vacinação com quatro formulações comerciais contendo o BVDV-1, BVDV-2 e BoHV-1 em novilhas jovens com títulos de anticorpos maternos circulantes, assim como analisar uma possível resposta anamnéstica em vacinações, após a completa metabolização dos anticorpos maternais aos seis meses de idade. Foram selecionadas 87 novilhas Holandesas, distribuídas aleatoriamente em quatro grupos experimentais de acordo com as vacinas: vacina A (n = 22), vacina B (n = 22), vacina C (n = 24) e vacina D (n = 19), aplicadas aos dias 60, 90 e 180 de vida. Testes de vírus-neutralização (VN) foram realizados no momento basal (D60) e 30 dias após a aplicação da 2ª dose (D120) e 3ª dose (D210). Observou-se efeito do grupo (P ≤ 0,001), dia da vacinação (P ≤ 0,001), e interação grupo versus dia (P ≤ 0,001) para os títulos de anticorpos produzidos contra o BVDV-1, BVDV-2 e BoHV-1, por meio do comando PROC MIXED (Statistical Analysis System, versão 9,4). Os títulos de anticorpos contra o BVDV-1, BVDV-2 e BoHV-1 eram semelhantes no momento basal aos 60 dias de vida. Os títulos médios de anticorpos foram constantes e persistentes contra o BVDV-1 nas novilhas imunizadas com as vacinas A e C, porém apenas a vacina A teve este mesmo perfil contra o BVDV-2. Em relação ao BoHV-1, os grupos B, C e D apresentaram queda nos títulos de anticorpos do D60 ao D210, enquanto as novilhas do grupo A apresentaram queda do D60 ao D120, com aumento intenso dos títulos no D210. A frequência de animais com títulos acima dos protetores contra o BVDV-1, BVDV-2 e BoHV-1 foram muito baixos ou nulos após as vacinações nos animais imunizados com as formulações B, C e D. Sugere-se que a imunidade passiva interferiu negativamente na indução de anticorpos pelas vacinas, observando-se indicadores de resposta anamnéstica apenas para as novilhas vacinadas com a formulação A.

RESUMO: A raiva bovina é endêmica na maioria dos estados brasileiros, inclusive no Rio Grande do Sul (RS), que enfrentou um surto de raiva sem precedentes entre 2011 e 2018. Descrevemos um PCR quantitativo de transcrição reversa em tempo real (RT-rtPCR) para detecção do vírus da raiva (RABV) em bovinos. Os primers foram desenhados visando uma região altamente conservada do gene da nucleoproteína (N) de RABV obtido de bovinos. O limite de detecção correspondeu a 13 cópias de DNA e a repetibilidade intra e inter-ensaios foi adequada (CV <9%) em todas as diluições testadas. Não foi observada amplificação de outros patógenos associados a doenças neurológicas em bovinos ou contaminação cruzada. Amostras de cérebro de bovinos com suspeita de raiva (n = 21) foram testadas em triplicata no RT-rtPCR e pelo teste de anticorpo fluorescente padrão ouro (DFAT), resultando em 100% de sensibilidade e especificidade do RT-rtPCR. O teste de 41 amostras de cérebro bovino adicionais submetidas ao teste de DFAT de rotina rendeu 37 (90,2%) resultados concordantes (30 positivos / sete negativos) e quatro (9,7%) inconclusivos em DFAT e RT-rtPCR positivo. Esses resultados mostraram boa concordância entre os testes e maior sensibilidade do RT-rtPCR. Este ensaio representa uma alternativa para a detecção do vírus da raiva, seja como teste confirmatório ou para diagnóstico em larga escala em regiões endêmicas.

ABSTRACT: Bovine rabies is endemic in most Brazilian States, including Rio Grande do Sul (RS), which has faced an unprecedented rabies outbreak between 2011 and 2018. We described a real-time reverse transcription quantitative PCR (RT-rtPCR) for detection of rabies virus (RABV) in bovine samples. The primers were designed targeting a highly conserved region of the nucleoprotein (N) gene of RABV obtained from cattle. The detection limit corresponded to 13 DNA copies and the intra- and inter-run repeatability was adequate (CV<9%) in all dilutions tested. Amplification of other pathogens associated with neurological disease in cattle or cross-contamination was not observed. Brain samples from cattle suspicious of rabies (n=21) were tested in triplicate by the RT-rtPCR and by the gold-standard direct fluorescent antibody test (DFAT), resulting in 100% of sensitivity and specificity of the RT-rtPCR. Testing of additional 41 bovine brain samples submitted to the routine DFAT testing yielded 37 (90.2%) concordant results (30 positive/7 negative) and 4 (9.7%) inconclusive in DFAT and RT-rtPCR positive. These results showed a good concordance between the tests and a higher sensitivity of the RT-rtPCR. This assay represents an alternative for RABV detection, either as a confirmatory test or for large-scale diagnosis in endemic regions.

RESUMO: A vacinação tem sido usada para prevenir perdas associadas à infecção pelo alfaherpesvírus bovino 1 (BoHV-1), embora anticorpos adquiridos passivamente possam comprometer a eficácia das vacinas. A imunização intranasal (IN) de bezerros com vacinas de BoHV-1 vivas modificadas pode contornar o obstáculo relacionado à presença de anticorpos adquiridos passivamente, conferindo proteção aos animais vacinados. Nesse contexto, avaliou-se a segurança e imunogenicidade de uma cepa brasileira de BoHV-1 com deleção no gene da glicoproteína E (BoHV-1gEΔ) na imunização IN de bezerros. Dez bezerros, de um a dois meses de idade e com títulos neutralizantes (VN) variando de 2-64, foram inoculados IN com BoHV-1gEΔ (107,1TCID50), e quatro permaneceram como controles não vacinados (títulos de VN 8-32). Após a instilação IN, os bezerros apresentaram secreção nasal transitória leve (2-6 dias) e excretaram o vírus vacinal nas secreções nasais em baixos títulos (<102,6TCID50/mL) por 4-8 dias. Interessantemente, os bezerros vacinados não apresentaram aumento nos títulos de anticorpos neutralizantes após a vacinação. Em vez disso, eles apresentaram uma redução gradual nos anticorpos neutralizantes séricos nas semanas seguintes - semelhante aos controles não vacinados. Após o desafio IN com uma cepa BoHV-1 virulenta heteróloga no dia 55 pós-imunização (107,63TCID50), os bezerros vacinados excretaram o vírus em títulos menores a partir do sexto dia pós-desafio (p < 0,07) e por um período de tempo menor do que o observado nos controles (p < 0,0024). É importante notar que tanto a duração quanto a intensidade dos sinais clínicos foram reduzidas nos animais vacinados. Além disso, os bezerros vacinados apresentaram um aumento abrupto nos títulos neutralizantes após o desafio, indicando uma imunização adequada por BoHV-1gEΔ. Em resumo, a imunização IN de bezerros com anticorpos passivos com a cepa BoHV-1gEΔ foi capaz de estimular a imunidade, proporcionando proteção virológica e clínica parciais após o desafio.

ABSTRACT: Vaccination has been used to prevent the losses associated with Bovine alphaherpesvirus 1 (BoHV-1) infection but passively acquired antibodies may compromise vaccine efficacy. Intranasal immunization (IN) of calves with modified live viral BoHV-1 vaccines has proven to overcome the acquired passive antibodies and confer adequate protection. Herein, we evaluated the safety and immunogenicity of a glycoprotein E-deleted Brazilian BoHV-1 strain (BoHV-1gEΔ) for IN immunization of calves. Ten 1-to-2 months-old calves with virus-neutralizing titers (VN) ranging from 2-64 were immunized IN with viable BoHV-1gEΔ (107.1 TCID50) and four remained as unvaccinated controls (VN titers 8-32). After IN immunization, calves presented a transient (2-6 days) mild nasal secretion and shed the vaccine virus in nasal secretions in low titers (<102.6TCID50/mL) for 4-8 days. Interestingly, the vaccinated calves did not show an increase in VN titers after vaccination. Rather, they presented a gradual reduction in serum VN antibodies in the following weeks - similarly to unvaccinated controls. Upon IN challenge with a virulent heterologous BoHV-1 strain at day 55 post-immunization (107.63TCID50), vaccinated calves shed significantly less virus from day 6 post-challenge onwards (p < 0.07) and for a shorter period of time than the controls (p < 0.0024). Importantly, both the duration and intensity of clinical signs were reduced in vaccinated animals. In addition, vaccinated calves showed an abrupt raise in VN titers post-challenge, indicating adequate immunological priming by vaccination. In summary, immunization of calves harboring passive antibodies with BoHV-1gEΔ by the IN route was able to prime the immunity to afford partial virological and clinical protection upon challenge.

RESUMO: O alfaherpesvírus equino tipo 1 (EHV-1) está amplamente distribuído nos rebanhos equinos de todo o mundo e é um dos principais agentes causadores de abortos, doença respiratória e neurológica em equinos. Ainda não há tratamento específico para a infecção pelo EHV-1 em equinos, mas o potencial da terapia antiviral tem sido investigado. Neste trabalho, foi investigada a atividade anti-herpética in vitro dos fármacos Aciclovir, Ganciclovir, Foscanet, Famciclovir, Vidarabina e Cidofovir frente ao EHV-1. Para isso, foi realizado o teste de MTT, em que todas as drogas não apresentaram citotoxicidade até a dose de 200μg/mL. A seguir, diferentes concentrações dos fármacos foram submetidas ao teste de redução de placas virais em cultivo celular. O índice de seletividade (IS) dos compostos foi determinado usando a concentração citotóxica para 50% dos cultivos celulares (CC50), obtida pelo MTT, e pela concentração dos fármacos efetiva para inibir em 50% o número de placas virais (EC50). O Ganciclovir (IS: 490; EC50: 1,9μg/mL) foi o mais eficiente e seguro frente ao EHV-1, seguido pelo Cidofovir (IS: 150; EC50: 5,7 μg/mL), Aciclovir (IS: 37,4; EC50: 22,2μg/mL), Famciclovir (IS: 25,1; EC50: 24,5μg/mL), Vidarabina (IS: 12,2; EC50: 40,9μg/mL) e Foscarnet (IS: 6,9; EC50: 49,5μg/mL). Estes resultados indicam que o Ganciclovir constitui-se em um candidato para uso em experimentos in vivo.

ABSTRACT: Equid alphaherpesvirus type 1 (EHV-1) is distributed worldwide and is a major agent of abortion, respiratory and neurological disease in horses. No specific treatment is available for EHV-1 infection, yet the potential of antiviral therapy has been explored. In this study we investigated the in vitro activity of Acyclovir, Ganciclovir, Foscarnet, Famciclovir, Vidarabina and Cidofovir against EHV-1. For this, the MTT test was performed, in which all the tested drugs showed no toxicity up to 200μg/mL. Subsequently, different drug concentrations were submitted to viral plaque reduction assays in cell culture. The selectivity index (SI) of the compounds was determined using the cytotoxic concentration for 50% of cells (CC50), obtained by MTT, and effective drug concentration to inhibit by 50% the number of viral plaques (EC50). Ganciclovir (SI: 490; EC50: 1.9 μg/mL) was the most efficient and safest drug against EHV-1, followed by Cidofovir (SI: 150, EC50: 5.7μg/mL), Acyclovir (SI: 37.4, EC50: 22.2μg/mL), Famciclovir (SI: 25.1, EC50: 24.5μg/mL), Vidarabine (SI: 12.2, EC50: 40.9μg/mL) and Foscarnet (SI: 6.9, EC50: 49.5 μg/mL), respectively. These results indicated that Ganciclovir (followed by Cidofovir), is a promising candidate for use in in vivo experiments.

RESUMO: O presente estudo investigou a frequência e a magnitude dos anticorpos neutralizantes do vírus da raiva (RABV) em cães com e sem histórico de vacinação em Santa Maria/RS. O Grupo A incluiu amostras de soro de 440 cães com histórico recente de vacinação contra a raiva, obtidos durante a campanha de vacinação contra a raiva de 2015. O Grupo B incluiu 300 amostras de cães submetidos ao Hospital Veterinário da Universidade Federal de Santa Maria em 2015, cujo histórico de vacinação antirrábica era desconhecido. As amostras de soro foram submetidas ao teste rápido de inibição de focos fluorescentes para detecção de anticorpos neutralizantes do RABV. No grupo A, 70,6% (310/440) das amostras possuíam títulos de anticorpos neutralizantes ≥0,5 unidades internacionais por mililitro (UI mL-1), considerado um indicador de proteção contra a raiva pela Organização Mundial da Saúde. No entanto, aproximadamente 30% dos animais não continham anticorpos em níveis adequados. No grupo B, 42,3% (127/300) das amostras continham títulos de anticorpos neutralizantes ≥0,5UI mL-1 e 57,7% (173/300) eram negativas ou continham títulos abaixo do valor considerado imunizado. Estes resultados demonstram que uma proporção importante de cães vacinados (~30%) não desenvolveu níveis adequados de anticorpos, principalmente aqueles que receberam uma única dose de vacina. O teste sorológico de animais com histórico de vacinação desconhecido revelou uma cobertura vacinal relativamente baixa na população geral de cães. Assim, a reformulação das estratégias de imunização - especialmente a recomendação de uma vacinação de reforço 30 dias após a primeira dose - e a extensão das campanhas de vacinação são necessárias para atingir níveis e cobertura adequados de imunidade contra o RABV na população canina.

ABSTRACT: The present study investigated the frequency and magnitude of neutralizing antibodies to rabies virus (RABV) in dogs with and without historic of vaccination in Santa Maria/RS. Group A included serum samples from 440 dogs with recent historic of vaccination against rabies, obtained during the 2015 rabies vaccination campaign. Group B included 300 serum samples from dogs submitted to the Veterinary Hospital of the Universidade Federal de Santa Maria in 2015, whose historic of rabies vaccination was unknown. Serum samples were submitted to the rapid fluorescent focus inhibition test (RFFIT) to detect neutralizing antibodies against RABV. In group A, 70.6% (310/440) of the samples had neutralizing antibody titers ≥0.5 international units per milliliter (IU mL-1), considered an indicative of protection against rabies by the World Health Organization. However, approximately 30% of the dogs did not contain antibodies in adequate levels. In group B, 42.3% (127/300) of the samples contained neutralizing antibody titers ≥0.5IU mL-1 and 57.7% (173/300) were negative or contained titers below of the value considered immunized. These results demonstrate that an important proportion of vaccinated dogs (~30%) did not develop adequate antibody levels, mainly those receiving a single vaccine dose. Serologic testing of animals with unknown historic of vaccination revealed relatively low vaccine coverage in the general dog population. Thus, reformulation of immunization strategies - especially the recommendation of a boost vaccination 30 days after the primary dose - and extension of vaccination campaigns are necessary to reach adequate levels and coverage of immunity against RABV in the canine population.

RESUMO: A resposta sorológica contra o vírus da raiva (RABV) induzida por vacinas comerciais foi investigada em bovinos. Para isso, 84 novilhas foram vacinadas duas vezes (30 dias de intervalo) com cada vacina (G1 = 14 animais; G2 = 24; G3 = 22 e G4 = 24) e receberam uma vacinação de reforço 360 dias depois. Amostras de soro coletadas em diferentes momentos após a vacinação e após o reforço vacinal foram submetidas ao teste de vírus neutralização (VN) para detecção de anticorpos contra o RABV. Trinta dias após a segunda dose vacinal, 92% dos animais apresentaram títulos neutralizantes ≥0,5UI/mL (GMT 1,7 a 3,8UI/mL). Porém, no dia do reforço (360 dias pós-vacinação), a porcentagem de animais que ainda apresentava títulos ≥0,5UI/mL havia se reduzido a 31% dos animais (0 a 80%, dependendo da vacina), resultando em baixos TMGs (0,1 a 0,6UI/mL). A vacinação de reforço no dia 360 resultou em resposta anamnéstica em todos os grupos, resultando em 83% (65 a 100%) de animais com títulos VN ≥0,5UI/mL trinta dias após (GMT 0,6 a 4,3UI mL-1). Esses resultados indicam que as vacinas avaliadas induzem uma resposta adequada de anticorpos anti-RABV após a vacinação (e também após o reforço). No entanto, os títulos reduzem-se, atingindo níveis <0,5UI/mL em 70% dos animais durante o intervalo antes do reforço. Assim, vacinação de reforço contra a raiva em bovinos, utilizando-se as vacinas atuais, deve ser realizada em intervalo inferior a um ano, de forma a manter os níveis de anticorpos neutralizantes na maioria dos animais.

ABSTRACT: The antibody response to rabies virus (RABV) induced by commercial vaccines in heifers was investigated. For this, 84 heifers were vaccinated twice (30 days interval) with each of four vaccines (G1 = 14 animals; G2 = 24; G3 = 22 and G4 = 24) and received a booster vaccination 360 days later. Serum samples collected at different intervals after vaccination and 30 days after booster were submitted to a virus neutralizing (VN) assay for RABV antibodies. Thirty days after the second vaccine dose, 92% of the immunized animals presented VN titers ≥0.5UI/mL (geometric medium titers [GMT] 1.7 to 3.8UI/mL). At the day of the booster (360 days post-vaccination); however, the percentage of animals harboring antibody titers ≥0.5UI/mL had dropped to 31% (0-80% of the animals, depending on the vaccine), resulting in lower GMT (0.1 to 0.6UI/mL). Booster vaccination at day 360 resulted in a detectable anamnestic response in all groups, resulting in 83% of animals (65 to 100%) harboring VN titers ≥0.5UI/mL thirty days later (GMT 0.6 to 4.3UI/mL). These results indicated that these vaccines were able to induce an adequate anti-RABV response in all animals after prime vaccination (and after booster as well). However, the titers decreased, reaching titers <0.5UI/mL in approximately 70% of animals within the interval before the recommended booster. Thus, booster vaccination for rabies in cattle using the current vaccines should be performed before the recommended one-year interval, as to maintain neutralizing antibodies levels in most vaccinated animals.

Abstract Three dog shelters in Rio Grande do Sul were investigated for associations between the occurrence of respiratory viruses and shelter environmental conditions. Nasal secretions randomly collected during the cold season were tested via PCR, and this data collection was followed by nucleotide sequencing of the amplicons. In shelter #1 (poor sanitary and nutritional conditions, high animal density and constant contact between dogs), 78% (58/74) of the nasal samples were positive, 35% (26/74) of which were in single infections and 44% (32/74) of which were in coinfections. Shelters #2 and #3 had satisfactory sanitary and nutritional conditions, outdoors exercise areas (#2) and animal clustering by groups (#3). In shelter #2, 9% (3/35) of the samples were positive for Canine parainfluenza virus (CPIV), and 6% (2/35) were positive for Canid herpesvirus 1 (CaHV-1). In shelter #3, 9% (7/77) of the samples were positive for Canine adenovirus type 2 (CAdV-2), and 1% (1/77) were positive for Canine distemper virus (CDV). The amplicon sequences (CPIV and CDV nucleoprotein gene; CAdV-2 E3 gene; CaHV-1 glycoprotein B gene) showed 94-100% nucleotide identity with GenBank sequences. Our results demonstrate that CPIV, CAdV-2 and CDV are common in dog shelters and that their frequencies appear to be related with environmental and nutritional conditions. These results indicate the need for control/prevention measures, including vaccination and environmental management, to minimize these infections and improve dog health.

Abstract The open reading frame of a Brazilian bovine viral diarrhea virus (BVDV) strain, IBSP4ncp, was recombined with the untranslated regions of the reference NADL strain by homologous recombination in Saccharomyces cerevisiae, resulting in chimeric full-length cDNA clones of BVDV (chi-NADL/IBSP4ncp#2 and chi-NADL/IBSP4ncp#3). The recombinant clones were successfully recovered, resulting in viable viruses, having the kinetics of replication, focus size, and morphology similar to those of the parental virus, IBSP4ncp. In addition, the chimeric viruses remained stable for at least 10 passages in cell culture, maintaining their replication efficiency unaltered. Nucleotide sequencing revealed a few point mutations; nevertheless, the phenotype of the rescued viruses was nearly identical to that of the parental virus in all experiments. Thus, genetic stability of the chimeric clones and their phenotypic similarity to the parental virus confirm the ability of the yeast-based homologous recombination to maintain characteristics of the parental virus from which the recombinant viruses were derived. The data also support possible use of the yeast system for the manipulation of the BVDV genome.

RESUMO: Um isolado brasileiro de herpesvírus bovino tipo 1, contendo uma deleção na glicoproteína E (gE - BoHV-1gEΔ) foi submetido a testes para avaliar a sua segurança e imunogenicidade em bovinos. Bezerros foram submetidos à inoculação intramuscular com uma alta dose viral e não demonstraram sinais clínicos ou excreção viral durante a fase aguda ou após tentativa de reativação viral pela administração de dexametasona. Bezerros que receberam uma dose do vírus vivo, contendo a deleção na gE, pela via intramuscular (grupo I) ou pela via subcutânea (grupo II) ou duas doses do vírus inativado utilizando o adjuvante hidróxido de alumínio (grupo IV) ou Montanide™ (grupo V), desenvolveram títulos de anticorpos neutralizantes de 2 a 8 (GMT: 2); 2 a 4 (GMT: 1,65); 2 a 16 (GMT: 2,25) e de 2 a 128 (GMT: 3,9), respectivamente. Todos os bezerros vacinados se mantiveram soronegativos quando utilizado um kit ELISA específico para a gE. Para o teste de segurança, seis bezerros foram vacinados com o vírus vivo BoHV-1gEΔ, sendo estes posteriormente desafiados com uma cepa virulenta de BoHV-1. Estes bezerros excretaram menos vírus e desenvolveram apenas sinais clínicos moderados e transitórios quando comparados com dados coletados de quatro animais não-vacinados. Com base nestes resultados, podemos confirmar que o vírus do BoHV-1 que contém a deleção na gE (BoHV-1gEΔ) é seguro e suficientemente imunogênico para bezerros e permite a diferenciação sorológica entre os animais vacinados e infectados perante a a um teste ELISA commercial específico para a gE.

ABSTRACT: A glycoprotein E-deleted Brazilian bovine herpesvirus 1 (BoHV-1gEΔ) was tested regarding to safety and immunogenicity. Intramuscular inoculation of young calves with a high virus dose did not result in clinical signs or virus shedding during acute infection or after dexamethasone administration. Calves vaccinated once IM (group I) or subcutaneously (group II) with live BoHV-1gEΔ or twice with inactivated virus plus aluminum hydroxide (group IV) or Montanide™ (group V) developed VN titers of 2 to 8 (GMT:2); 2 to 4 (GMT:1.65); 2 to 16 (GMT:2.45) and 2 to 128 (GMT:3.9), respectively. All BoHV-1gEΔ vaccinated calves remained negative in an anti-gE ELISA. Lastly, six young calves vaccinated with live BoHV-1gEΔ and subsequently challenged with a virulent BoHV-1 strain shed less virus and developed only mild and transient nasal signs comparing to unvaccinated calves. Thus, the recombinant BoHV-1gEΔ is safe and immunogenic for calves and allows for serological differentiation by a gE-ELISA test.

RESUMO: O vírus da estomatite vesicular (vesicular stomatitis virus, VSV) é o agente de doença vesicular que afeta várias espécies e que, em suínos e ruminantes, é clinicamente confundível com a febre aftosa. Os equinos são particularmente susceptíveis ao VSV, servindo de sentinelas para a circulação viral. O presente trabalho investigou a presença de anticorpos neutralizantes contra o VSV Indiana III (VSIV-3) em amostras de soro de 3626 equinos de seis estados das regiões Sul (RS, n=1011), Centro-oeste (GO e DF, n=1767) e Nordeste (PE, PB, RN e CE, n=848), coletadas entre 2013 e 2014. Anticorpos neutralizantes contra o VSIV-3 em títulos iguais ou superiores a 40 foram detectados em 641 amostras (17,7%; IC95%: 16,5-19,0%), sendo 317 do CE (positividade de 87,3%; IC95%: 83,4-90,5%); 109 do RN (65,7%; IC95%: 57,8-72,7%); 124 da PB (45,4%; IC95%: 39,4-51,5%); 78 de GO/DF (4,4%; IC95%: 3,5-5,5%) e em nove amostras do RS (0,9%; IC95%: 0,4-1,7%). Uma parcela das amostras dos estados do Nordeste e Centro-oeste apresentou altos títulos neutralizantes, indicando exposição recente ao vírus. Já as amostras do RS apresentaram títulos baixos de anticorpos, indicando provável exposição temporalmente remota. Quando testadas contra outros sorotipos do VSV (Indiana I e New Jersey), várias amostras apresentaram atividade neutralizante, porém em títulos muito inferiores, indicando a especificidade dos anticorpos para o VSIV-3. Esses resultados demonstram circulação relativamente recente do VSIV-3 em várias regiões do Brasil, sobretudo em estados do Nordeste, confirmando relatos clínicos e demonstrando a importância sanitária dessa infecção.

ABSTRACT: Vesicular stomatitis virus (VSV) is the agent of a vesicular disease that affects many animal species and may be clinically confounded with foot-and-mouth disease in ruminant and swine. Horses are especially susceptible to VSV and may serve as sentinels for virus circulation. The present study investigated the presence of neutralizing antibodies against VSV Indiana III (VSIV-3) in serum samples of 3,626 horses from six states in three Brazilian regions: Southern (RS, n = 1,011), Midwest (GO/DF, n = 1,767) and Northeast (PB, PE, RN and CE, n = 848) collected between 2013 and 2014. Neutralizing antibodies against VSIV-3 (titers ≥40) were detected in 641 samples (positivity of 17.7%; CI95%:16.5-19.0%), being 317 samples from CE (87.3%; CI95%: 83.4-90.5 %); 109 from RN (65.7%; CI95%: 57.8 -72.7%); 124 from PB (45.4%; CI95%: 39.4-51.5%); 78 from GO/DF (4.4%; CI95%: 3.5-5.5%) and nine samples of RS (0.9%; CI95%: 0.4-1.7%). Several samples from the Northeast and Midwest harbored high neutralizing titers, indicating a recent exposure to the virus. In contrast, samples from RS had low titers, possibly due to a past remote exposure. Several positive samples presented neutralizing activity against other VSV serotypes (Indiana I and New Jersey), yet in lower titers, indicating the specificity of the response to VSIV-3. These results demonstrated a relatively recent circulation of VSIV-3 in northeastern Brazilian States, confirming clinical findings and demonstrating the sanitary importance of this infection.

RESUMO: O vírus Vaccinia (VACV) é o agente etiológico da vaccínia bovina, uma doença zoonótica re-emergente e de importância sanitária e econômica para rebanhos leiteiros. O VACV também pode ocasionalmente infectar outras espécies, incluindo equinos. Nesse sentido, um surto de VACV em equinos foi descrito em Pelotas, RS, em 2008, no qual uma coinfecção com dois isolados de VACV (denominados Pelotas 1 [P1V] e Pelotas 2 [P2V]) foi detectada. Considerando a rara ocorrência da infecção pelo VACV em equinos, o objetivo deste estudo foi investigar a susceptibilidade e a patogenia experimental da infecção pelo VACV nessa espécie. Para isso, seis equinos adultos foram inoculados com P1V ou P2V (106,3DICC50/ml) após escarificação na superfície nasolabial e monitorados para os aspectos virológicos, clínicos e patológicos por 28 dias. Quatro animais inoculados (4/6) desenvolveram lesões macroscópicas leves nos locais da inoculação, consistentes com aquelas causadas por VACV, caracterizadas por úlceras e crostas focais restritas à área inoculada, entre os dias 2 e 8 pós-inoculação (pi). Microscopicamente, havia acantose, degeneração hidrópica do estrato espinhoso e necrose da epiderme, com bactérias intralesionais. Infiltração moderada de neutrófilos, macrófagos e linfócitos foi observada na derme superficial. Inclusões intracitoplasmáticas eosinofílicas foram infrequentemente observadas nos queratinócitos degenerados adjacentes às áreas necróticas. Excreção viral foi detectada por PCR e isolamento viral das lesões de um equino inoculado com o P2V, entre os dias 4 e 8pi. Não foi detectada produção de anticorpos específicos para o VACV em nenhum animal inoculado. Em resumo, a inoculação de cavalos com os isolados P1V e P2V resultou em um baixo nível de replicação viral e em baixa frequência, resultando em lesões cutâneas mais discretas em comparação com outras espécies susceptíveis ao VACV. Apesar dos equinos serem susceptíveis à infecção pelo VACV, possivelmente apresentam baixo potencial de manutenção e de transmissão do vírus para outras espécies.

ABSTRACT: Vaccinia virus (VACV) is the etiologic agent of bovine vaccinia, an emerging zoonotic disease with potential health issues for dairy herds and humans. VACV may occasionally infect other species, including horses. In this sense, an outbreak of VACV disease in horses was described in Pelotas, RS, in 2008, where a co-infection with two VACV strains (named Pelotas Virus 1 [P1V] and Pelotas Virus 2 [P2V]) was detected. Considering the rare occurrence of VACV infection in horses, the objective of this study was to investigate the susceptibility and pathogenesis of VACV infection in this species. Six adult horses were inoculated with VACV P1V or P2V (106.3TCID50/ml) through scarification of the nasolabial surface and monitored for virological and clinical aspects during 28 days. Four inoculated horses (4/6) developed mild lesions in the site of inoculation. Ulcers and scabs restricted to inoculated areas were observed between days 2 and 8 post-inoculation (pi). Microscopically there were acanthosis, ballooning degeneration of the stratum spinosum, necrosis and loss of the epidermis. Infiltration of neutrophils, macrophages and lymphocytes were observed in the dermis. Intracytoplasmic eosinophilic inclusions were infrequently observed in degenerate keratinocytes from adjacent necrotic areas. Virus shedding was detected between days 4 and 8 pi by PCR and virus isolation (infectious virus) from the lesions of one horse inoculated with P2V. No neutralizing antibodies were detected in inoculated animals at day 28 pi. In summary, inoculation of horses with VACV P1V and P2V isolates resulted in a low level of replication and at low frequency, with mild cutaneous lesions, when compared with the course of infection of other susceptible species to VACV. Therefore, horses possibly have a low potential for viral maintenance and transmission to other species, albeit being susceptible to VACV infection.

RESUMO: Este estudo investigou a sensibilidade do isolamento viral (VI) em células de neuroblastoma murino (N2A) e células de rim de hamster (BHK-21) como um teste confirmatório para o diagnóstico de raiva bovina. Quarenta e oito amostras de cérebro de bovinos com suspeita de raiva foram inicialmente submetidas aos testes diagnósticos de rotina, imunofluorescência direta (FAT) e inoculação intracerebral em camundongos (MIT). Subsequentemente, essas amostras foram submetidas a três protocolos de VI em cada linhagem celular: uma única passagem de 24h ou 72h (T1, T2), ou três passagens de 48h (T3). Os testes FAT e MIT combinados detectaram 32/48 amostras positivas, das quais o MIT detectou 32 e a FAT 31. O tempo médio requerido para o resultado final no MIT foi 12,3 dias (8-21 dias). O teste de VI em células BHK-21 obteve resultados positivos em 100% das amostras em 72h (T2), e em 96,9% após três passagens de 48h (T3). O teste de VI em células N2A forneceu resultado positivo em 100% em 72h (T2), e em 30 das 32 amostras após três passagens de 48h (T3). Sensibilidade, especificidade, valores preditivos positivos e negativos foram de 100% tanto em N2A quanto em BHK-21 após 72h de incubação (T2). Além disso, o valor Kappa foi excelente em ambas as células (k=1). Uma única passagem de 24h (T1) em ambas as linhagens celulares não apresentou resultados satisfatórios, detectando menos de 40% das amostras positivas. Esses resultados indicam que o isolamento viral em ambas as linhagens celulares, especialmente em BHK-21 - que multiplica mais rápido e é de mais fácil manutenção - representa uma alternativa adequada para a substituição do MIT como um teste confirmatório para o diagnóstico da raiva em amostras de bovinos, fornecendo resultados confiáveis em tempo reduzido.

ABSTRACT: This study investigated the suitability of virus isolation (VI) in mouse neuroblastoma cells (N2A) and baby hamster kidney cells (BHK-21) as a confirmatory test for diagnosis of bovine rabies. Fourty-eight brain samples from cattle suspected of rabies were initially submitted to fluorescent antibody test (FAT) and mouse inoculation test (MIT) for routine diagnostic. Subsequently, these specimens were submitted to three protocols of VI in each cell line: a single 24h or 72h passage (T1, T2), or three 48h passages (T3). The FAT and MIT combined detected 32/48 positive samples, from which MIT detected 32 and FAT 31. The average time required for final MIT results was 12.3 days (8 - 21). VI in BHK-21 cells provided definitive, positive results in 100% of the samples in 72h (T2) and in 96.9% after three 48h passages (T3). VI in N2A cells yielded positive results in 100% in 72h (T2) and in 93.7% of samples after three 48h passages (T3). Sensitivity, specificity, positive and negative predictive values were 100% in T2 in N2A and BHK-21 cells, and the Kappa value was excellent in both cells (k=1). A single 24h passage (T1) in both cell lines performed poorly, detecting less than 40% of the positive samples. Taking together, these results indicate that VI in both cell lines, especially in BHK-21 cells that grow faster and are much easier to maintain, does represent an adequate alternative for MIT as a confirmatory test for rabies diagnostic in bovine specimens, yielding reliable results in reduced time.

Este trabalho avaliou a imunogenicidade de vacinas para os herpesvírus bovino 1 e 5 (BoHV-1, BoHV-5) e vírus da diarreia viral bovina 1 e 2 (BVDV-1, BVDV-2), disponíveis no mercado brasileiro. Para isso, novilhos de raças de corte foram alocados em grupos de 10-12 animais e vacinados duas vezes, com intervalo de 30 dias, com cada uma das oito vacinas disponíveis. Amostras de soro coletadas 30 dias após a segunda dose foram submetidas ao teste de virusneutralização (VNT), frente a cepas de BoHV-1, BoHV-5, BVDV-1 e BVDV-2. Com exceção de duas vacinas que induziram soroconversão em 8/10 e 9/10 dos animais, as demais induziram anticorpos neutralizantes contra o BoHV-1 em todos os animais vacinados (títulos médios geométricos [GMTs] entre 1,7 e 4,8). Quatro vacina s induziram anticorpos reagentes com o BoHV-5 em todos os animais (GMTs de 1,0 a 4,2), enquanto três vacinas induziram soroconversão parcial em 5/10, 6/10 e 7/10 animais. Apenas uma vacina induziu resposta sorológica detectável frente ao BVDV-1 em todos os animais vacinados (GMT=6,7). Soroconversão parcial ao BVDV-1 foi detectada em quatro grupos vacinais (6/10, GMT 4,0 6/10, GMT 5,6 e 4/10, GMT 1,8). Uma vacina induziu resposta em apenas um animal (título de 40) e três vacinas não induziram anticorpos detectáveis contra o BVDV-1 em nenhum animal. Atividade neutralizante frente ao BVDV-2 foi detectada apenas em três grupos vacinais, e parcialmente (10/10, GMT 6,5; 5/10, GMT 1,6 e 2/10, GMT 1,0). Cinco vacinas não induziram atividade neutralizante detectável frente ao BVDV-2 em nenhum dos animais imunizados. Esses resultados demonstram que o componente BoHV-1 da maioria das vacinas comerciais possui imunogenicidade adequada. No entanto, o componente BVDV da grande maioria das vacinas não induz resposta neutralizante consistente frente ao BVDV-1 e, principalmente, frente ao BVDV-2. Fica evidente que as estratégias de formulação e/ou produção de vacinas, principalmente com relação ao BVDV, devem ser urgentemente revistas

This study evaluated the immunogenicity of vaccines for bovine herpesvirus 1 and 5 (BoHV-1/5) and viral diarrhea virus 1 and 2 (BVDV-1/2) available in the Brazilian market. Calves were divided into groups (10-12), vaccinated twice with a 30 days interval. Samples collected 30 days after the second dose were submitted to virus neutralization test against BoHV-1, BoHV-5, BVDV-1 and BVDV-2. With the exception of two vaccines that induced seroconversion in 8/10 and 9/10 of the animals, the other induced antibodies against BoHV-1 in all vaccinated animals (geometric mean titers [GMTs] 1.7 and 4.8) and four induced antibodies against BoHV-5 in all animals (GMTs 1.0 to 4.2), whereas three vaccines induced partial seroconversion (5/10, 6/10 and 7/10 animals). Only one vaccine induced antibody response to BVDV-1 in all vaccinated animals (GMT=6.7). Partial seroconversion to BVDV-1 was detected in four vaccine (6/10, GMT 4.0; 6/10, GMT 5.6 and 4/10, GMT 1.8). A vaccine induced response in only one animal and three vaccines did not induce antibodies against BVDV-1 in any animal. Antibodies to BVDV-2 were detected only in three vaccine groups, and partly (10/10, GMT 6.5; 5/10, GMT 1.6 and 2/10, GMT 1.0). Five vaccines did not induce antibodies to BVDV-2 in any of the animals. Results demonstrate that the BoHV-1 component of commercial vaccines seems to have acceptable immunogenicity. However, the BVDV component of most vaccines does not induce consistent response against BVDV-1, especially, to BVDV-2. It is evident that strategies for production of vaccines, particularly to BVDV must be urgently revised

A raiva é uma doença infecciosa do sistema nervoso central de mamíferos causada pelo vírus da raiva (RabV), geralmente, transmitido pela mordedura de animais infectados. No Brasil, os morcegos hematófagos Desmodus rotundus são as principais fontes de infecção do RabV para bovinos e equinos. Este artigo descreve uma investigação epidemiológica e molecular de surtos de raiva ocorridos na região central do Rio Grande do Sul, entre maio e agosto de 2012. Nesse período, 45 casos suspeitos de raiva foram relatados em 22 pequenos rebanhos, localizados dentro de um raio de 4,7km, no município de Pinhal Grande. Desses, 32 amostras foram submetidas para diagnóstico da raiva, sendo que o RabV e/ou antígenos virais foram identificados em 27 amostras. Em um segundo momento, 11 amostras foram submetidas à transcrição reversa/reação em cadeia da polimerase (RT-PCR) para o gene da nucleoproteína (N) do RabV, seguido de sequenciamento nucleotídico e análise filogenética. Sete das 11 amostras apresentaram sequências nucleotídicas idênticas e uma apresentou mutação sinônima, não-codificante, indicando uma provável origem comum dos vírus. Por outro lado, três amostras apresentaram mutações que resultaram em alterações de aminoácidos, sugerindo uma origem diferente do vírus. Esses resultados sugerem que RabV de diferentes origens/linhagens co-circulam na região e foram envolvidos nos surtos descritos. Investigações sobre a circulação de ambos os genótipos em morcegos na região estão em andamento.

Rabies is an infectious disease of the central nervous system of mammals caused by rabies virus (RabV), generally transmitted by the bite of rabid animals. In Brazil, vampire bats Desmodus rotundus are the main reservoirs of RabV for livestock. The present study describes a molecular and epidemiological investigation of outbreaks of bovine rabies occurring in the central region of Rio Grande do Sul state, Brazil, between May and August 2012. In this period, 45 cases suspected of rabies were reported in 22 small herds, located within a 4.7km range, in the county of Pinhal Grande. From these, 32 samples were submitted to rabies diagnosis and RabV and/or viral antigens were identified in 27 samples. Subsequently, 11 brain samples were submitted to reverse transcription/polymerase chain reaction (RT-PCR) for the nucleoprotein gene (N) followed by nucleotide sequencing and phylogenetic analysis. Seven out of 11 samples yielded identical sequences; one presented a synonymous, non-coding mutation, indicating a likely common origin of the virus. However, three other samples presented nucleotide mutations which resulted in amino acid changes, suggesting a different origin of the virus. In summary, these results suggest that RabV strains of different origin/lineages co-circulate in the region and were involved in the outbreaks. Investigations on the circulation of both genotypes in bats in the region are currently underway.