A mobilidade eletroforética dos ADNs heteroduplexes foi usada para determinar a diversidade genômica entre isolados africanos dos fitoplasmas do amarelecimento letal dos coqueiros que causam as doenças denominadas, Cape St. Paul wilt disease (CSPD, Gana), lethal disease (LD, Tanzânia) e o lethal yellowing (LYM, Moçambique). Eles foram também comparados com o fitoplasma do Caribe que causa o Coconut lethal yellowing (LY). Fragmentos de ADN de 1850 pb, cobrindo a região do 16S rRNA e a região intergênica 16S-23S rRNA, de cada isolado, foram amplificados com os primers universais P1/P7 e submetidos a análise por HMA. Um produto de PCR amplificado a partir de ADN obtido do isolado GH5D, CSPD-Ghana, foi usado como referência e combinado com cada um dos produtos PCR dos outros isolados e submetidos à eletroforese em gel de poliacrilamida. Três grupos de fitoplasmas associados a várias doenças de amarelecimento letal de coqueiros foram identificados por HMAAs amostras de Moçambique (LYM) e Ghana (CSPD) formam um grupo que difere do segundo grupo, LD da Tanzânia. Esses dois grupos são diferentes do terceiro grupo formado pelos isolados do Caribe. Esses resultados foram consistentes com aqueles que demonstraram a diversidade genética para o complexo do LY através de clonagem, seqüenciamento e análises filogenéticas. A técnica de HMA demonstrou ser um método simples e rápido para identificar e estabelecer a diversidade de isolados dentro do grupo das doenças do amarelecimento letal dos coqueiros.

Heteroduplex mobility assay (HMA) was used to determine genomic diversity among African isolates of coconut lethal yellowing phytoplasmas causing Cape St. Paul wilt disease (CSPD, Ghana), lethal disease (LD, Tanzania), and lethal yellowing (LYM, Mozambique). They were also compared to the Caribbean phytoplasma associated with coconut lethal yellowing (LY). A DNA fragment of 1850 bp covering the 16S rRNA gene and 16/23S intergenic spacer region of each isolate was amplified with primers P1 and P7 and subsequently submitted to HMA analysis for sequence variation. A PCR product amplified from GH5D (CSPD isolate) as a reference was combined with each PCR product and electrophoresed on polyacrylamide gels. Three groups of phytoplasmas associated with various coconut lethal yellowing diseases were identified by HMA. The samples from Mozambique (LYM) and Ghana (CSPD) formed one group, which was different from the second group, LD from Tanzania. These two groups were different from the third group of Caribbean isolates. This grouping was consistent with the genetic diversity described in the coconut yellowing-associated phytoplasmas detected after cloning, sequencing, and phylogenetic analyses. The HMA technique described here has the potential to provide a simple and rapid means to identify and to establish the diversity of isolates within the coconut lethal yellowing disease group.

No Laboratório de Quarentena Vegetal da Embrapa Recursos Genéticos e Biotecnologia, foram realizadas análises fitossanitárias em tubérculos de batata, introduzidos no país para pesquisa, procedentes da França. Alguns desses tubérculos, em exame direto sob microscópio estereoscópio, apresentaram lesões deprimidas de aspecto encharcado, coloração marrom-arroxeada, casca amolecida e picnídios negros sobre as lesões. Em lâminas, sob microscópio de luz, foram observadas características morfológicas do fungo Phoma exigua var. foveata, praga exótica e de quarentena A1 para o Brasil. Para o teste de patogenicidade foram utilizados tubérculos sadios de batata inoculados com cultura pura do fungo isolado dos tubérculos sintomáticos. Sintomas de apodrecimento foram observados após 3 dias da inoculação, evoluindo até o 8º dia, quando o fungo foi re-isolado dessas lesões, em BDA, e confirmado o agente etiológico da doença. Os tubérculos apresentando sintomas foram incinerados e aqueles aparentemente sadios foram tratados com fungicida sistêmico, plantados em quarentenário por duas gerações e re-analisados. Após confirmação da sanidade dos tubérculos, os mesmos foram enviados ao requisitante.

Potato tubers from France and introduced to Brazil for research purposes were subjected to phytosanitary analysis at the Quarantine Laboratory of Embrapa Genetic Resources and Biotechnology (Cenargen). Some of the tubers showed sunken, water-soaked, brownish-purple lesions, with soft skin, and black pycnidia were visible in the lesions using a stereomicroscope. Examination of the fungal structures on microscope slides using light microscopy demonstrated that the fungus had the morphology of Phoma exigua var. foveata, an A1 quarantine pest for Brazil. Pathogenicity tests were carried out inoculating healthy potato tubers with a pure culture of the fungus. Rot symptoms were observed 3 days after inoculation and progressed until 8 days. The fungus was re-isolated from the lesions on potato dextrose agar, confirming that the fungus was the etiological agent of the disease. The tubers that were symptomatic were incinerated, and the other healthy-looking tubers were treated with a systemic fungicide, cultivated under quarantine for two generations, and then reanalyzed. After confirming that they were free of the pathogen, the tubers were sent to their destination solicitor.

Ceratocystis fimbriata foi encontrado em tubérculos de inhame (Colocasia esculenta), apresentando lesões escuras, pouco profundas, contendo estruturas de reprodução do fungo, cuja coloração variava do cinza ao negro. As amostras foram coletadas em supermercados, quitandas e varejões nos Estados de São Paulo, Rio de Janeiro, Bahia, Rondônia e Distrito Federal que, na maioria dos casos, comercializavam inhame produzido no Estado de São Paulo. Os sintomas de podridão negra indicam se tratar de uma doença de pós-colheita. Seqüências de rDNA indicam que os isolados de Colocasia sp. pertencem ao clado da America Latina do complexo C. fimbriata, embora esses isolados sejam mais agressivos em pseudo-pecíolos de C. esculenta do que os isolados de Ficus carica e Mangifera indica.

Ceratocystis fimbriata was found sporulating in gray to black discolored areas on edible corms of Colocasia esculenta found in supermarkets in the states of São Paulo, Rio de Janeiro, Bahia, Rondônia and the Distrito Federal. In most cases the corms were grown in the state of São Paulo. The black rot appeared to occur post-harvest. Sequences of rDNA indicated that the Colocasia sp. isolates belong to the Latin American clade of the C. fimbriata complex, but the isolates were more aggressive than isolates from Ficus carica and Mangifera indica, in pseudopetioles of C. esculenta.

Um método foi desenvolvido para a detecção do Apple stem grooving virus (ASGV), baseado na transcrição reversa do RNA viral e na polimerização em cadeia do DNA (RT-PCR), usando os oligonucleotídeos iniciadores ASGV4F-ASGV4R, localizados na região do gene da RNA polimerase, sendo os produtos de amplificação detectados por hibridização "sandwich", em placas de poliestireno, através de reação colorimétrica. A RT-PCR foi realizada com a "Titan™ RT-PCR System", complexo enzimático formado pela AMV, responsável pela transcrição do RNA viral em cDNA e as DNA polimerases PWO e Taq, usadas para a etapa de PCR, utilizando-se para isso extrato bruto de folhas e casca do caule de macieira (Malus domestica). A detecção dos produtos de amplificação RT-PCR foi realizada hibridizando esses produtos com uma sonda de captura marcada com biotina, ligada à placa de ELISA previamente sensibilizada com estreptavidina, e uma sonda de revelação marcada com digoxigenina. O complexo foi detectado utilizando-se um conjugado fosfatase alcalina marcada com anti-DIG. Foi avaliada a sensibilidade desse método utilizando-se uma série de diluições de vírus purificado, tendo sido possível detectar até 400 fg de vírus. A especificidade do método foi demonstrada usando-se os oligonucleotídeos iniciadores ASGV4F-ASGV4R e macieiras de diferentes origens infetadas com ASGV. Não foram reveladas colorimetricamente as amplificações observadas em gel de agarose, quando essas mesmas plantas foram testadas utilizando-se oligonucleotídeos iniciadores para o ASGV escolhidos na região que codifica para capa protéica e amplificações provenientes de material infetado com o Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) e Apple stem pitting virus (ASPV). Esta técnica combina o desempenho da PCR, a especificidade da hibridização molecular e as facilidades do teste de ELISA.

A method to detect Apple stem grooving virus (ASGV) based on reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) was developed using primers ASGV4F-ASGV4R targeting the viral replicase gene, followed by a sandwich hybridisation, in microtiter plates, for colorimetric detection of the PCR products. The RT-PCR was performed with the Titan™ RT-PCR system, using AMV and diluted crude extracts of apple (Malus domestica) leaf or bark for the first strand synthesis and a mixture of Taq and PWO DNA polymerase for the PCR step. The RT-PCR products is hybridised with both a biotin-labelled capture probe linked to a streptavidin-coated microtiter plate and a digoxigenin (DIG)-labelled detection probe. The complex was detected with an anti-DIG conjugate labelled with alkaline phosphatase. When purified ASGV was added to extracts of plant tissue, as little as 400 fg of the virus was detected with this method. The assay with ASGV4F-ASGV4R primers specifically detected the virus in ASGV-infected apple trees from different origins, whereas no signal was observed with amplification products obtained with primers targeting the coat protein region of the ASGV genome or with primers specific for Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV) and Apple stem pitting virus (ASPV). The technique combines the power of PCR to increase the number of copies of the targeted gene, the specificity of DNA hybridization, and the ease of colorimetric detection and sample handling in microplates.