Duas populações naturais de Anopheles darlingi foram analisadas quanto aos padrões de variabilidade genética relacionados ao comportamento hematofágico, cujas coletas foram realizadas no intra, peri e extradomicíio, em dois municípios do Estado do Amazonas: Coari e Manaus. Os resultados evidenciaram amplo número de fragmentos polimórficos, bem como elevada variabilidade genética nessas populações. Na população de Coari, a porcentagem de locos polimórficos (P) e heterozigosidade (He) variou de 77,63% - 84,86% e 0,2851 0,3069, respectivamente, sendo a maior variabilidade genética detectada nas subpopulações do intradomicílio, e a menor nas do peridomicílio. A população de Manaus mostrou variabilidade genética similar a de Coari (P= 75% - 78,94% e He= 0,2732 0,2741), onde também foi detectada maior variabilidade genética no intradomicílio. Os dados de qui-quadrado (x²= 695,89; GL= 304; P < 0,001) e de F ST (F ST= 0,0775 ± 0,0072) foram significativos, indicando uma estruturação micro geográfica, decorrente de alguma redução no fluxo gênico. Esses resultados podem ser interpretados como sendo em resposta à pressão de seleção face aos inseticidas, que permanecem residuais nas paredes dos domicílios.

Two natural populations of Anopheles darlingi, collected in the intra, peri and extra domicile of two townships in the State of Amazonas, Coari and Manaus, were assayed as to their hematophagic behaviour-related genetic variability patterns. Findings revealed a large number of polymorphic fragments as well as high genetic variability in these populations. Polymorphic loci rate (P) and heterozygosity (He) in the Coari population varied between 77.63% - 84.86% and 0.2851 0.3069, respectively, with the highest and lowest genetic variability being detected in the intra- and peri-domicile sub-populations, respectively. The Manaus population showed genetic variability and heterozygosity similar to those in Coari (P= 75% - 78.94% and He= 0.2732 0.2741), where higher genetic variability was detected in the intra-domicile as well. Chi-square data (x²= 695.89; GL= 304; P < 0.001) and F ST (F ST= 0.0775 ± 0.0072) were significant, indicating micro-geographic structuring resulting from some decreased gene flow. These findings point out the selective pressure response to the residual insecticide remaining on household walls after the entire neighbourhood had been sprayed with it during malaria control programs.

INTRODUÇÃO: Análises isoenzimáticas foram realizadas envolvendo espécies dos subgêneros Nyssorhynchus e Anopheles para estimar a variabilidade genética intra e interespecífica. MÉTODOS: Os mosquitos foram capturados em diferentes localidades da região Amazônica. A coleta e a criação dos mosquitos em laboratório foram conforme protocolos específicos. Na análise da variabilidade genética empregou-se a técnica de eletroforese horizontal em géis de amido e amido-agarose com sistemas tampões apropriados. A variação alozímica foi estimada pelo Programa Biosys-1. RESULTADOS: Dos 13 loci, oito foram polimórficos. Anopheles nuneztovari apresentou o maior número de alelos por loco, sendo o menor detectado para Anopheles albitarsis (Macapá). O maior número de loci polimórficos foi detectado em Anopheles marajoara (Maruanum) e o menor, em Anopheles benarrochi (Guayará Mirim). Anopheles darlingi (Macapá) apresentou a maior heterozigosidade (Ho = 0,167 ± 0.071) e a menor (Ho = 0,045 ± 0.019) foi observada em Anopheles intermedius (Pacoval) do subgênero Anopheles. O coeficiente F de Wright evidenciou considerável estruturação genética entre populações de Anopheles darlingi (Fst= 0,110) e entre as populações de Anopheles marajoara (Fst= 0,082). CONCLUSÕES: Considerando todas as espécies estudadas, a distância genética variou de 0,008 a 1,144, onde a maior distância foi entre Anopheles mattogrossensis e Anopheles oswaldoi e a menor, entre as populações de Anopheles benarrochi.

INTRODUCTION: Isoenzymatic analyses were performed involving species of the Nyssorhynchus and Anopheles subgenera in order to estimate the intra and interspecies genetic variability. METHODS: Mosquitoes were caught at different localities in the Amazon region. The collection and rearing of mosquitoes in the laboratory followed specific protocols. For the genetic variability analyses, the technique of horizontal electrophoresis on starch and starch-agarose gel with appropriate buffer systems was used. The alloenzyme variation was estimated using the Biosys-1 software. RESULTS: Out of the 13 loci, eight were polymorphic. Anopheles nuneztovari presented the largest number of alleles per locus, while the smallest number was detected in Anopheles marajoara from Macapá. The largest number of polymorphic loci was found for Anopheles marajoara from Maruanum and the smallest for Anopheles benarrochi (Guayará Mirim). Anopheles darlingi (Macapá) presented the greatest heterozygosity (Ho = 0.167 ± 0.071), while the lowest heterozygosity (Ho = 0.045 ± 0.019) was observed in Anopheles intermedius (Pacoval) of the subgenus Anopheles. Wright's F coefficient revealed considerable genetic structuring between the populations of Anopheles darlingi (Fst = 0.110) and between the populations of Anopheles marajoara (Fst = 0.082). CONCLUSIONS: Considering all the species studied, the genetic distance ranged from 0.008 to 1.114. The greatest distance was between Anopheles mattogrossensis and Anopheles oswaldoi, while the smallest was between the Anopheles benarrochi populations.

Anopheles (Anopheles) intermedius and Anopheles (Ano.) mattogrossensis are Brazilian anopheline species belonging to the scarcely studied Anopheles subgenus. Few studies have been done on the genetic differentiation of these species. Both species have been found infected by Plasmodium and are sympatric with other anopheline species from the Nyssorhynchus subgenus. Eighteen enzymatic loci were analyzed in larval specimens of An. intermedius and An. mattogrossensis aiming to estimate the variability and genetic differentiation between these species. An. mattogrossensis population showed higher genetic variability (P = 44.4 and Ho = 0.081 ± 0.031) than that of An. intermedius (P = 33.3 and Ho = 0.048 ± 0.021). Most analyzed loci showed genotypic frequencies according to Hardy-Weinberg equilibrium, except for LAP1 and LAP2 in An. intermedius, and EST1 and PGM loci in An. mattogrossensis. The genetic distance between these species (D = 0.683) was consistent with the inter-specific values reported for Anopheles subgenus. We verified that the polymorphism and heterozygosity percentile values found in both species and compared to those in the literature, showed no relation between the level of isozyme variability and geographical distribution. The low variability found in these two species is probably more related to the niche they occupy than to their geographic distribution.

An isoenzymatic comparative analysis of the variability and genetics differentiation among Anopheles species was done in populations of An. (Nys.) intermedius and An. (Ano.) mattogrossensis of the Anopheles subgenus, and of An. darlingi, An. albitarsis and An. triannulatus of the Nyssorhynchus subgenus, with the aim of detecting differences between both subgenera and of estimating the degree of genetic intere specific divergence. Samples from Macapá, State of Amapá and Janauari Lake, near Manaus, State of Amazonas, were analyzed for eight isoenzymatic loci. Analysis revealed differences in the average number of alleles per locus (1.6-2.3) and heterozygosity (0.060-0.284). However, the proportion of polymorphic loci was the same for An. (Nys.) darlingi, An. (Nys.) triannulatus and An. (Ano.) mattogrossensis (50%), but differed for An. (Nys.) albitarsis (62.5%) and An. (Ano.) intermedius (25%). Only the IDH1 (P > 0.5) locus in all species studied was in Hardy-Weinberg equilibrium. The fixation index demonstrated elevated genetic structuring among species, based on values of Fst = 0.644 and genetic distance (0.344-0.989). Genetic difference was higher between An. (Nys.) triannulatus and An. (Ano.) intermedius (0.989) and smaller between An. (Nys.) albitarsis sensu lato and An. (Nys.) darlingi (0.344). The data show interspecific genetic divergence which differs from the phylogenetic hypothesis based on morphological characters.

Eighteen enzymatic loci were analysed in Aedes aegypti populations from four neighbourhoods in the city of Manaus. The analyses showed that the Downtown population was the most polymorphic (p = 55.6%) with higher observed and expected mean heterozygosities (Ho = 0.152 ± 0.052; He = 0.174 ± 0.052, respectively). The least variability was detected in the Coroado and Cidade Nova populations, both with polymorphism of 44.4%. The latter population presented the least observed heterozygosity (Ho = 0.109 ± 0.037). Wright's F statistics showed that the mean value of Fis was higher than that of Fst (Fis = 0.164 > Fst = 0.048), and from analysis of molecular variance (AMOVA) it was found that 95.12% of the variability is found within populations indicating a certain intra-population differentiation possibly of the microgeographic structure resulting from some barrier in the random coupling. Although the four populations were similar genetically (D = 0.003 to 0.016), the 4.88% differentiation was significant.

Amostras de populações naturais de Anopheles darlingi foram analisadas para 19 locos, dos quais 12 apresentaram variação, com uma proporção de locos polimórficos de 68,40%. A população de Ariquemes mostrou maior variabilidade, com maior número de alelos por loco (2,26 ± 0,08) e maior polimorfismo (P = 63,15). Levando-se em conta os níveis de heterozigosidade intraloco observados e esperados, os maiores valores foram observados na população de Manaus (Ho = 0,432 ± 0,11; He = 0,375 ± 0,08) e os menores na população de Cachoeira Porteira (Ho = 0,236 ± 0,09; He = 0,290 ± 0,11). Quando analisados pelas estatísticas F de Wright, os resultados mostraram desequilíbrio decorrente de excesso de homozigotos, conforme mostram os valores de Fis > Fst (0,083 > 0,026), denotando uma certa diferenciação intrapopulacional. As quatro populações estudadas foram semelhantes geneticamente, conforme indicam os valores de distância e similaridade. As variações cromossômicas de populações da Amazônia não indicaram diferenciação geográfica, e na região central da bacia amazônica, estas foram altamente polimórficas em relação às marginais, que foram predominantemente monomórficas.

Four natural Amazonian Anopheles darlingi populations were analyzed for 19 loci, 12 of which showed variation, i.e., 68.4% of polymorphic loci. The Ariquemes, Rondônia, population was the most variable, with a large number of alleles per locus (2.26 ± 0.27) and high polymorphism (P = 63.15). The highest values of observed and expected intralocus heterozygosity were observed in the Manaus, Amazonas, population (Ho = 0.432 ± 0.11; He = 0.375 ± 0.08), and the lowest in the Cachoeira Porteira, Pará, population (Ho = 0.236 ± 0.09; He = 0.290 ± 0.11). Wright's F-statistic revealed disequilibrium caused by an excess of homozygotes, as shown by the Fis > Fst values (Fis = 0.083 > 0.026) reflecting intrapopulational differentiation. The four populations studied were genetically similar, as indicated by distance and similarity values. Chromosomal variation of Amazon population also did not indicate geographical differentiation, and populations in the central region of the Amazon Basin showed high polymorphism in relation to the marginal populations, which were mainly monomorphic.

Modificações na expressão gênica foram observadas nos sistemas esterase, leucina aminopeptidase e x-glicerofosfato desidrogenase, durante o desenvolvimento ontogenético de Anopheles albitarsis. A esterase revelou quatro regiões de atividade, sendo a esterase 1 detectada apenas em larvas de 4º estádio velhas e em pupas, as esterases 2 e 4 foram presentes durante todo o desenvolvimento, e a esterase 3 revelou-se praticamente apenas em larvas e raríssimas vezes em pupas. Também foram observadas quatro regiões de atividade na leucina aminopeptidase, durante a ontogenia. As LAP1 c LAP2 foram características de larvas, a LAP3 esteve presente somente em pupas e adultos e a LAP4 foi detectada nos três diferentes estágios. Uma única região foi observada para a x-glicerofosfato desidrogenase e a intensidade de sua atividade cresce à medida que se aproxima o estágio adulto.

Modifications in genetic expression were observed in the esterase, leucine aminopeptidase and x-glycerophosphate dehydrogenase systems during ontogenetic development of Anopheles albitarsis. The esterase revealed four regions of activity. Esterase 1 was detected in 4th stage larvae and in pupae. Esterase 2 and 4 were present during all stages of development and esterase 3 appeared mainly in larvae and rarely in pupae. Four regions of activity were also observed in leucine aminopeptidase during ontogeny. The LAP1 and LAP2 were characteristic of larvae and LAP3 was present only in pupae and adults. LAP4 was detected in all three stages, x-glycerophosphate dehydrogenase presented one activity band whose intensity increased with development.

Foram estudadas populações de Anopheles triannulatusprocedentes da hidrelétrica de Balbina (AM), quanto ao sistema das esterases, usando-se gel de poliacrilamida e como substrato α-naftil propionato A análise eletroforética possibilitou identificar seis zonas de atividade e o mecanismo de herança foi estudado para cinco locique foram polimórficos. Foram detectados dois alelos para as esterases 1, 2 e 4 e três para as esterases 3 e 5, sendo todos de ação codominante. Os dados de frequências gênicas mostraram-se diferentes para os alelos em cada locus.Os valores de qui-quadrados para as frequências genotípicas evidenciaram que a população não está em equilíbrio para todos os loci,sendo as frequências observadas dos homozigotos superiores as esperadas. Esses resultados foram interpretados como decorrentes de alterações ambientais que estão ocorrendo na área em estudo.

The esterase system of populations of Anopheles triannulatus from the Balbina hydroeletric project were studied by polycrilamide gel electrophoresis, using α-naphtyl proprionate as enzyme substrate. The analysis revealed six zones of activity, and the mechanism of inheritance was studied for five polymorphic loci. Two aieles were detected for esterases 1, 2 and 4, and three for esterases 3 and 5, all being co-dominant. Genetic frequency data were different for the aleles at each locus, chisquared values for genotypic frequencies indicated that the population is not in equilibrium for all the loci, as homozygote frequencies were higher than expected. This was interpreted as being the result of environmental changes occuring in the study area.

Dados sobre o grau de incidência e distribuição de espécies Anopheles, em Ariquemes (RO), evidenciaram que a diversidade é maior na periferia da cidade e que Anopheles darlingi é registrada em praticamente todas as localidades de coleta. O inquérito entomológico revelou níveis diferentes de penetração da espécie na área urbana, podendo-se constatar que os Setores 1 e 3 são áreas livres de malária; Setores 2 e 4 mostram riscos na periferia; e a Área Industrial e Setor de Áreas Especiais, Conjunto BNH, Setor 5 e Vila Velha constituem áreas de alto risco da malária. Nestes últimos, os índices de mosquitos por homem/hora foram os mais elevados, observando-se variações no decorrer das amostragens e conforme a localização da área urbana. Medidas de densidade populacional revelaram mudanças estacionais, sendo os menores valores registrados no período de inverno. A transmissão da malária é discutida, considerando-se: 1) o papel da estrutura física da cidade, na época da fundação, 2) os igarapés que margeam a área urbana e suas relações com o ciclo de desenvolvimento dos anofelinos, 3) os padrões comportamentais da atividade de picar das espécies correlacionados a ambientes naturais e às áreas ecologicamente alteradas, e 4) a importância do manuseio ambiental no controle da malária, para redução da densidade populacional. Para conter o processo migratório do vetor é proposto um cinturão de proteção à cidade, constituído de mata não densa, incluindo também proteção biológica para incentivar a zoofilia dos anofelinos. Os resultados de infecção natural, obtidos em áreas de autoctonia da malária, permitem citar A. darlingi como vetor, sendo discutida a possibilidade de que outras espécies estejam envolvidas na transmissão.

Data on the prevalence and distribution of species of Anopheles in Ariquemes (State of Rondonia) show, that the diversity is greater at the periphery of the town and that Anopheles darlingi is recorded at nearly all of the sampling points. The entomological survey revealed different levels of penetration by A. darlingi in to the urban area: Sectors 1 and 3 are free of malaria transmission, Sectors 2 and 4 show risks at the periphery, and the Industrial Sector, Sector of Special Areas, BNH housing estate, Sector 5 and the Old Town are areas of high risk for malaria. These areas had the highest indices of mosquitoes per man-hour, with variations of this index during the sampling period and depending on locality. Measures of population density showed seasonal variation, with the lowest indices during the rainy season. Malaria transmission is discussed in relation to 1) the physical structure of the town at the time it was jounded ; 2) the streams that border the urban area and their relation to the life cycle of the anophelines; 3) biting activity of the species colected in natural environments and areas altered by man; and 4) the importance of environmental management for malaria control by reducing the vector population density. To reduce the penetration of urban areas by mosquitoes from the surrounding countryside, a protective belt around the town is proposed. This belt should be of sparse forest and include alternative hosts to encourage the zoophilic tendencies of the anophelines. Infection rates among anophelines in areas authocthonous for malaria incriminate A. darlingi as a vector. The possibility of transmission by other species is discussed.

São relatados resultados preliminares sobre o polimorfismo protético de populuções naturais de Anopheles darlingi, procedentes de duas localidades da região amazônica-Ariquemes (Rondônia) e Rodovia PA-422 (Pará). Pata as esterases, foi detectada variação para o locus Est-2na população de Ariquemes, enquanto foi monomórfico na população da PA-422, sendo verificados nesta última, apenas indivíduos com o genótipo Est2*F/Est2*F. A freqüência do alelo Est2*F foi estimada em 0,80 na população de Ariquemes, valor este muito maior do que o observado na população da BR-174 (Manaus/Boa Vista), em estudos anteriores, que foi de 0,48. Os resultados para o sistema da leucina aminopeptidase (LAP) sugerem que a enzima é controlada por três loci, aparentemente monomórficos em ambas as populações.

We have, related preliminary results on protein polymorphism in two natural populations of Anopheles darlingi from the Amazon region (Ariquemes, state of Rondonia, and the Highway PA-422, in the state of Para). Fοr the esterases there were observed variations in the locus Est-2in the Ariquemes population, while while locus was onomorphic in the Highway PA-422 population. In the later population we found individuals showing the genotype. Est2*F/Est2*F. The allele frequency Est2*Fhas been estimated at 0,80 in the population of, Ariquemes, this value being much higher than the one related to our previous study on the Highway BR-174 (Manaus/Boa Vista) which was 0,48. The results concerning leucine-aminopeptidases (LAP) suggest that this enzyme is controlled by three apparently monomorphic loci in the both populations.

Resumo Três amostras de populações naturais de Anopheles darlingi foram analisadas quanto às freqüências das inversões, cujas coletas foram obtidas no Km 175 da Rodovia BR-174 (Manaus/Boa Vista). Duas amostras foram coletadas durante o período da estação chuvosa e a terceira no período da estação seca. Os resultados evidenciaram o caráter altamente polimórfico das populações de A. darlingi da Amazônia e também modificações das variantes genéticas, no decorrer das amostragens. Ocorreram variações, em diferentes níveis, nas freqüências das inversões dos três pares de cromossomos e quanto às freqüências de três regiões de despareamento, sendo uma no cromossomo X e duas no cromossomo 2. Foram realizados testes de associação de inversões intra e intercromossômicas e a comparação dos resultados de cada teste, nas três amostras simultaneamente, evidenciou que uma mesma associação não está presente em duas ou três amostragens ao mesmo tempo. Essas modificações, ocorridas nos diferentes períodos, foram interpretadas como decorrentes da reestruturação da composição genética das populações, face às alterações ambientais. Altas freqüências de heterozigotos, com valores próximos ou acima de 50%, foram observadas para a maioria das inversões, porém em níveis diferentes conforme a inversão e o período de amostragem considerados. O número médio de inversões, por individuo, no estado heterozigoto, também se modificou no decorrer dos períodos, sendo os maiores valores registrados durante a estação chuvosa. Esses resultados foram discutidos considerando-se a heterogeneidade das florestas amazônicas e a estratégia adaptativa da espécie. Também é discutida a hipótese de que a constituição cariotípica dos espécimes poderia interferir nos parâmetros da capacidade vetorial da espécie.

Summary Three samples of natural populations of Anopheles darlingi from Km 175 of BR-174 Highway (Manaus/Boa Vista) are here analysed concerning the frequency of the inversions. Two samples were collected during the rainy period and a third one in the dry season. The results showed a highly polymorphic character of the Anopheles darlingi Amazonia populations and also modifications of the genetic variants, during the samplings. There were changes, in different levels, in the frequencies of the inversions of the three pairs of chromosomes and also as to the frequencies of the three asynapsed regions, one being in chromosome X and two in chromosome 2. Tests of intra and interchromo-somic inversion association were male and the checking of the results of each test, in the three samples simultaneously, showed that the same association is not present in two or three samplings at the same time These changes in different periods were seen as result of a rearrangement in the structure of the genetic composition of the populations because of environmental modifications. High frequencies of heterozygotes (near or above 50%) were observed in most of the inversions, but In different levels depending on the inversion and the period of sampling. The mean number of inversions, per individual, in the heterozygote state, also changed during the periods, the highest rate being observed in the rainy season. The results were discussed in relation to the heterogeneity of the Amazonia forests and the species adaptation strategy. The hypothesis the cariotipic constitution of the species could interfere in the parameter of the vector capacity of the species is also discussed.

Resumo Foi analisado o polimorfismo cromossômico de Anopheles darlingi, cuja amostra foi obtida na Rodovia BR-174 (Manaus/Boa Vista). Foram descritas duas novas inversões independentes, estendendo-se para doze o número de rearranjos de A. darlingi. Três regiões de despareamento também foram descritas, sendo uma no cromossomo X e duas no cromossomo 2. Ocorreu uma alta incidência de inversões no estado heterozigoto e o número médio por indivíduo foi elevado (4,13 ± 0.13). As freqüências elevadas e significativas de heterozigotos para a maioria das inversões foram interpretadas como indicativas de uma adaptabilidade maior dos mesmos em relação à heterogeneidade ambiental. Os testes para associação de inversões evidenciaram a ocorrência de uma associação intracromossômica (braços 3R e 3L) e quatro intercromossômicas (cromossomos X - 3 e 2 - 3). Os dados de polimorfismo cromossômico de Anopheles darlingi corroboram a hipótese de que populações centrais da área de distribuição geográfica de uma espécie são mais polimórficas que as populações marginais. As populações de A. darlingi da Amazônia são altamente polimórficas quando comparadas com as populações do sul nas quais foram fixados determinados arranjos com reduzido polimorfismo.

Summary Jhe chromosomic polymorphism of Anopheles darlingi, whose sample was obtained in Highway BR-174 (Manaus/Boa Vista), was here analyzed. Two new independent inversions were described, and the number of rearrangements was raised to twelve. Three asynapsed regions were also described, being one in chromosome X and two in chromosome 2. There was a high occurence of inversions at the heterozygote state and the medium number per individual was high (4,13 ± 0,13). The higher and meaningful frequencies of heterozygote indicated their larger adaptability to the enviromental heterogeneity. The tests for the association of inversions showed the occurrence of an intrachromosomic association (arms 3R and 3D and four interchromosomic ones (chromosomes X-3 and 2-3). The data of the Anopheles darlingi chromosomic polymorphism support the hypothesis that the central populations of a geographic area are more polymorphic than the marginal populations. The A. darlingi populations of Amazônia are highly polymorphic as compared to the southern ones, where certain arrangements with reduce polymorphism were determined.