Transformantes de Magnaporthe grisea resistentes a higromicina, obtidos principalmente por procedimentos REMI (Restriction Enzyme-Mediated Integration), foram avaliados quanto à habilidade em causar doença em arroz. A partir de testes de patogenicidade envolvendo 125 transformantes foi possível selecionar cinco mutantes com alterações consistentes na patogênese. Dois desses mutantes, T108 e T93, causaram poucas lesões em folhas de arroz, enquanto o mutante T251 não foi patogênico. A alteração na patogenicidade de T108 foi acompanhada pela menor capacidade de desenvolvimento in vitro. Quando inoculado em plantas de arroz, o mutante T41 apresentou agressividade reduzida, caracterizada por lesões arredondadas de tamanho limitado. Por sua vez, o período de incubação para o mutante T72 foi maior que o do isolado selvagem. Além disso, atraso considerável na germinação de conídios e formação de apressórios foi detectado em T72. Todos os mutantes cresceram em meio mínimo, indicando que as mutações não foram associadas à auxotrofia. Os mutantes T93 e T251 apresentam fenótipos semelhantes quando em cultura, caracterizados pela pigmentação marrom.

Hygromycin-resistant transformants of Magnaporthe grisea, generated mainly by REMI (Restriction Enzyme-Mediated Integration), were screened for their ability to infect rice plants. Out of 125 transformants five showed changes in pathogenicity. The T108 and T93 mutants caused few lesions in rice leaves, while the T251 mutant was non-pathogenic. The alteration in pathogenicity of T108 was accompanied by reduced development in culture. The T41 mutant caused small and limited round lesions. The incubation period of the T72 mutant was longer than that of the wild type. Furthermore, late germination and appresorium formation was detected in the T72 mutant. All mutants grew in minimum medium, suggesting that there were no auxotrophic-associated mutations. The T93 and T251 mutants presented similar phenotypes in culture, characterized by a brown-pigmented colony.

A análise de sequências de transcriptase reversa (RT) é uma etapa importante para descobrir a presença de elementos transponíveis e investigar o seu papel na geração de variabilidade genética em C. perniciosa. Seqüências putativas de TR foram analisadas no genoma do fitopatógeno C. perniciosa, o agente causal da doença vassoura-de-bruxa no cacau. Um fragmento de 394 pb foi amplificado a partir do DNA genômico de diferentes isolados de C. perniciosa, pertencentes aos biótipos C, L e S e a distintas áreas geográficas. A clivagem dos produtos de PCR com diferentes enzimas de restrição e sequenciamento de vários fragmentos de TR indicou a presença de diferentes seqüências mostrando eventos de transição G:C para A:T. A análise por hibridização revelou alto número de sinais sugerindo a presença de cópias de TR com diferentes perfis entre os isolados dos biótipos C, S e L. As comparações de seqüências dos peptídeos preditos indicam uma relação próxima com a proteína TR de retrotransposons-LTR da família gypsy.

Reverse transcriptase (RT) sequence analysis is an important technique used to detect the presence of transposable elements in a genome. Putative RT sequences were analyzed in the genome of the pathogenic fungus C. perniciosa, the causal agent of witches' broom disease of cocoa. A 394 bp fragment was amplified from genomic DNA of different isolates of C. perniciosa belonging to C-, L-, and S-biotypes and collected from various geographical areas. The cleavage of PCR products with restriction enzymes and the sequencing of various RT fragments indicated the presence of several sequences showing transition events (G:C to A:T). Southern blot analysis revealed high copy numbers of RT signals, forming different patterns among C-, S-, and L-biotype isolates. Sequence comparisons of the predicted RT peptide indicate a close relationship with the RT protein from thegypsy family of LTR-retrotransposons. The possible role of these retrotransposons in generating genetic variability in the homothallic C. perniciosa is discussed.

O gene Sw-5 do tomateiro confere resistência a várias espécies de tospovírus e codifica uma proteína contendo domínios de ligação a nucleotídeos e repetições ricas em leucina. Tomateiros com Sw-5 exibem reações necróticas nas folhas inoculadas com tospovírus. Estas reações e a estrutura da proteína Sw-5 indicam que a resistência ocorre por meio do reconhecimento do patógeno e desencadeamento da resposta de hipersensibilidade. A capacidade de Sw-5 de conferir resistência a tospovírus em tabaco selvagem (Nicotiana benthamiana Domin.) foi avaliada em plantas transgênicas. Uma construção com a seqüência aberta de leitura de Sw-5 e sua região 3’ não-traduzida sob controle do promotor 35S do CaMV foi utilizada para transformação de N. benthamiana via Agrobacterium tumefaciens. Plantas de progênies R1 foram inoculadas com um isolado de tospovírus e avaliadas quanto à ocorrência de reação de hipersensibilidade e resistência à infecção sistêmica. Em uma progênie com segregação 3:1 (resistente:suscetível), foi selecionada uma planta homozigota e sua progênie avaliada quanto ao espectro da resistência a tospovírus. Plantas com o transgene exibiram resposta de hipersensibilidade 48 h após a inoculação, sendo resistentes à infecção sistêmica. O fenótipo da resistência foi dependente do isolado viral e um isolado de Tomato chlorotic spot virus (TCSV) causou necrose sistêmica em todas as plantas inoculadas, enquanto que isolados de Groundnut ringspot virus (GRSV) e um isolado relacionado a Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) ficaram restritos ao sítio de infecção. Comparações do espectro da resistência obtido neste trabalho com aquele observado em outros membros da família Solanaceae indicam que as vias de transdução de sinais e as respostas de defesa ativadas por Sw-5 são conservadas dentro desta família e polimorfismos genéticos nas vias de transdução de sinais ou em componentes das respostas de defesa podem resultar em diferentes níveis de resistência.

The tomato gene Sw-5 confers resistance against tospovirus species and codes for a nucleotide binding site and leucine rich protein. Tomatoes with the Sw-5 gene develop a necrotic reaction when mechanically inoculated with tospoviruses. The necrotic lesions on inoculated leaves of the resistant plants and the structure of the protein codified by Sw-5 suggests that the resistance depends on recognition of the pathogen and activation of hypersensitive response (HR). The capacity of the Sw-5 to confer resistance in wild tobacco (Nicotiana benthamiana) was evaluated in transgenic plants transformed by Agrobacterium tumefaciens. The Sw-5 ORF and its own 3' UTR region were placed under 35S promoter control. Plants of R1 progenies were inoculated with tospovirus and evaluated for local and systemic symptoms. In one progeny with 3:1 (resistant:susceptible) segregation ratio a homozygous plant was selected and the resistance spectrum of its progeny was evaluated. Transgenic plants showed hypersensitive response 48 h after inoculations and were resistant to tospovirus infection. The resistance was isolate-specific and a Tomato chlorotic spot virus (TCSV) isolate caused systemic necrosis in the transformed plants, while Groundnut ringspot virus (GRSV) isolates and one Chrysanthemum stem necrosis virus (CSNV) related isolate was restricted to the inoculation site. Comparisons of the resistance spectrum with that observed in other members of the Solanaceae suggest that the signal transduction pathways and resistance responses triggered by Sw-5 are conserved in Solanaceae, and the genetic polymorphism in the signal transduction pathways or defense response components may result in different resistance levels.

Visando explorar a mutagênese insercional em Magnaporthe grisea, foram avaliadas a transformação dos protoplastos obtidos após adequação do protocolo e a eficiência da integração de pAN7-1 no genoma do ascomiceto na presença da enzima de restrição Hind III. Os protoplastos de M. grisea I-22 foram prontamente transformados para a resistência à higromicina. Quando o vetor linearizado com Hind III foi usado para transformar o fungo na presença de Hind III, a eficiência de transformação foi 1,1 a 8,1 vezes superior ao tratamento sem a adição da enzima. No geral, a melhor concentração de Hind III foi 5 unidades/reação de transformação. Tal concentração promoveu a produção média de 332 transformantes/µg de pAN7-1/10(7) protoplastos. A presença do gene de seleção hph no genoma de 18 indivíduos resistentes à higromicina foi confirmada por PCR.

To investigate insertional mutagenesis in Magnaporthe grisea, we tested the transformation of protoplasts produced after protocol optimization, and analyzed the integration efficiency of pAN7-1 into the M. grisea genome mediated by the restriction endonuclease Hind III. The I-22 protoplasts were readily transformed for hygromycin resistance. When pAN7-1 was linearized with Hind III and used to transform fungal protoplasts in the presence of the corresponding enzyme, the transformation efficiency was increased 1.1 to 8.1-fold. The optimal Hind III concentration for enhanced transformation corresponded to 5 unit/transformation mix. This concentration led to average frequency of 332 transformants/µg de pAN7-1/10(7) protoplasts. The presence of selection gene hph in the 18 transformant genome was confirmed by PCR.

A antracnose foliar causada por Colletotrichum gloeosporioides é importante nas regiões cebolicultoras da América Latina, África e Ásia, mas há poucos estudos relacionados à resistência ao patógeno. Assim, neste trabalho, conduzido em condições de casa de vegetação, avaliaram-se componentes de resistência de oito cultivares e dois acessos de cebola (Allium cepa) a quatro isolados do patógeno, inoculados por atomização de suspensão de inóculo ou deposição de discos de micélio em folhas. Detectaram-se diferenças significativas entre cultivares/acessos, na inoculação por atomização, quanto à freqüência de infecção inicial e à taxa de progresso monocíclico da doença (r g) e, na inoculação com disco de micélio, quanto ao período de incubação e área da lesão. Determinaram-se os coeficientes de correlação (r) dos componentes de resistência estimados na inoculação por atomização. Os valores de r foram 0,98 entre severidade estimada visualmente aos nove dias da inoculação (SEV9) e área abaixo da curva de progresso da doença (AACPD); 0,80 entre SEV9 e severidade estimada por medidor de área foliar (SEV); 0,72 entre SEV9 e r g; 0,64 entre SEV9 e freqüência de infecção aos nove dias da inoculação; 0,81 entre SEV e AACPD e 0,64 entre SEV e r g. Em vista dos valores significativos de r associados a SEV9 e da não necessidade de escala para estimar esse componente, SEV9 é potencialmente útil na avaliação de germoplasma de cebola frente a C. gloeosporioides. Na inoculação por atomização, mais rápida e simples de execução, obtiveram-se maior eficiência de infecção e menor variabilidade de respostas, e deverá ser adotada em estudos futuros.

Despite the importance of onion (Allium cepa) leaf anthracnose caused by Colletotrichum gloeosporioides in Latin America, Africa, and Asia, few studies have focused on host resistance to the pathogen. Therefore, in this study, resistance components of two cultivars and eight accessions of onion to four isolates of C. gloeosporioides were evaluated under greenhouse conditions. Inoculations were performed either by spraying inoculum suspension or by placing a mycelial disc on the leaf. The cultivars and accessions differed significantly regarding initial infection frequency and monocyclic progress rate (r g) with the spray-inoculation, and regarding incubation period and lesion area with the mycelial-disc inoculation. Correlation coefficient (r) values were estimated between the components with the mycelial disk inoculations. Values of r were 0.98 between disease severity visually assessed nine days after inoculation (SEV9) and area under the disease progress curve (AUDPC), 0.80 between SEV9 and disease severity assessed with the leaf area meter (SEV), 0.72 between SEV9 and r g, 0.64 between SEV9 and infection frequency nine days after inoculation, 0.81 between SEV and AUDPC, and 0.64 between SEV and r g. Considering both the significant r values associated with SEV9 and that to estimate SEV9 there is no need of rating diagrams, this component is potentially useful to evaluate onion germplasm against C. gloeosporiodes. The spray inoculation procedure was faster, simpler, and provided higher infection efficiency and lower variability than the mycelial disk inoculation technique. Therefore, this should be the preferred inoculation procedure when assessing onion germplasm.

Vinte isolados virais provenientes de Capsicum spp. foram coletados em Minas Gerais, São Paulo, Espírito Santo e Rio de Janeiro visando definir a etiologia dos mosaicos. Para a caracterização biológica realizou-se teste de gama de hospedeiros e inoculação em cultivares diferenciadoras de pimentão (Capsicum annuum). Dois isolados provenientes de batata (Solanum tuberosum) (PVY N-BR e PVY O-BR) foram utilizados como controles. Os resultados indicaram considerável grau de variabilidade biológica entre os isolados, embora todos tenham sido identificados preliminarmente como Potato virus Y (PVY). A reação das cultivares diferenciadoras classificou os isolados como patótipo 1 ou 1.2 de PVY. Anti-soros foram produzidos a partir de partículas virais purificadas de um isolado fraco e um forte. O uso desses anti-soros em ELISA indireto levou a resultados positivos contra os isolados testados. Os anti-soros reagiram também contra PVY N-BR e PVY O-BR, embora este último tenha apresentado reação mais fraca. Para caracterização molecular, seqüenciaram-se os genes da polimerase (NIb) e da proteína capsidial (cp), e da região 3' não-traduzida (3'NTR) de isolados biologicamente distintos. A análise filogenética confirmou a identidade de seis isolados como Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), um potyvírus descrito recentemente infetando pimentão no Brasil. Esse resultado sugere que o PepYMV pode ser a espécie de potyvírus predominante em Capsicum spp. no Brasil. O fato de isolados de PepYMV apresentarem gama de hospedeiros semelhante à do PVY, e de os dois vírus apresentarem relacionamento sorológico, ressalta a utilidade da análise molecular para a classificação de potyvírus provenientes de Capsicum spp.

Twenty isolates were obtained from Capsicum spp. plants in the states of Minas Gerais, São Paulo, Espírito Santo and Rio de Janeiro. The isolates were biologically characterized using a host range assay and inoculation into a series of differential sweetpepper (Capsicum annuum) cultivars. Two isolates from potato (Solanum tuberosum) (PVY N-BR e PVY O-BR) were used as controls. The isolates displayed a high degree of biological variability, although they were all preliminarly identified as Potato virus Y (PVY). The reaction in the differential cultivars enabled the classification of the isolates as pathotypes 1 or 1.2 of PVY. The production of antiserum was carried out using purified virions of one mild and one severe isolate. Using these antisera in indirect ELISA, positive reactions against all the isolates were observed. The antisera also reacted against PVY N-BR and PVY O-BR, although the latter reacted weakly. For molecular characterization, the polymerase (NIb) and capsid protein (cp) genes and the 3' non-translated region (3'NTR) of biologically distinct isolates were cloned and sequenced. Phylogenetic analysis confirmed the identity of six isolates as Pepper yellow mosaic virus (PepYMV), a potyvirus recently described infecting sweet pepper (Capsicum annuum) in Brazil. This result suggests that PepYMV could be the predominant potyvirus causing mosaic in Capsicum species in Brazil. Since PepYMV isolates have host ranges similar to PVY (including the reaction in differential cultivars), and the two viruses cross-react serologically, the usefulness of the molecular analysis is demonstrated in the identification of potyviruses from Capsicum spp.

A murcha-de-fusário, causada por Fusarium oxysporum f.sp. tracheiphilum, é uma importante doença do caupi (Vigna unguiculata) no Nordeste brasileiro. Foi conduzido um experimento em microparcelas para avaliar a influência da intensidade da murcha-de-fusário nas reduções de rendimento do caupi. O solo acondicionado nas microparcelas foi infestado com a mistura do inóculo de dois isolados do patógeno, obtendo-se diferentes gradiente de densidade, variando de 1,2 x 10² a 5,3 x 10(4) ufc/g. Cinco dias após a infestação, foram plantadas as cultivares BR-17 Gurguéia e IPA-206, classificadas como altamente e moderadamente suscetíveis a F. oxysporum f.sp. tracheiphilum, respectivamente. Na fase de colheita, o rendimento de cada cultivar foi determinado por microparcela, obtendo-se o número de vagens por planta, o peso total de sementes por planta e o peso de 100 sementes. Após a colheita, a severidade da murcha-de-fusário foi avaliada em todas as plantas com o auxílio de uma escala descritiva, sendo calculado o índice de intensidade da doença. Não foram verificadas diferenças significativas (P=0,05) na intensidade de doença e na taxa de redução de rendimento entre as duas cultivares. As reduções no rendimento de sementes variaram de 9,11 a 80,30% e de 8,30 a 86,51% nas cultivares BR-17 Gurguéia e IPA-206, respectivamente. O modelo de regressão linear simples, sem a transformação dos dados, possibilitou o ajuste adequado aos dados na análise da relação entre a intensidade da murcha-de-fusário e as reduções de rendimento das duas cultivares.

Fusarium wilt, caused by Fusarium oxysporum f.sp. tracheiphilum, is an important disease of cowpea (Vigna unguiculata) in Northeastern Brazil. An experiment was carried out in field microplots to evaluate the influence of Fusarium wilt intensity on cowpea yield losses. The soil in microplots was infested with a mixture of two pathogen isolates. A crescent gradient was obtained by adding 1.2 x 10² to 5.3 x 10(4) cfu/g of pathogen-colonized substrate. Five days after the infestation, two cultivars were planted: 'BR-17 Gurguéia' and 'IPA-206', classified as highly and moderately susceptible to F. oxysporum f.sp. tracheiphilum, respectively. At harvest, the yield of the cultivars per microplot was determined through the number of pods per plant, total weight of seeds per plant, and the weight of one hundred of seeds. After harvest, the severity of Fusarium wilt was evaluated in all plants using a descriptive scale and calculating the disease intensity index. Significant differences (P=0,05) were not observed in either disease intensity or yield losses between the two cultivars. Losses in seed yield ranged from 9.11 to 80.30% and from 8.30 to 86.51% in the cultivars BR-17 Gurguéia and IPA-206, respectively. The model of simple linear regression, without data transformation, fitted the data in relation to Fusarium wilt intensity and yield losses of both cultivars.

O cubiu (Solanum sessiliflorum), originário da Amazônia, é um fruto utilizado como alimento, medicamento e cosmético. Em um plantio experimental de cubiu, para a avaliação da sua adaptação nas condições da região Norte do Estado do Rio de Janeiro, observou-se plantas com sintomas de mosaico. Uma planta de cubiu foi coletada e analisada para a identificação do agente etiológico. Após a purificação biológica, o vírus foi inoculado via extrato foliar em uma série de plantas diferenciadoras. Foram observadas lesões locais cloróticas em Chenopodium quinoa, lesões locais necróticas em Gomphrena globosa, mosaico em S. sessiliflorum, necrose foliar e de caule em tomate (Lycopersicon esculentum) 'Rutgers' e mosaico e deformação foliar em Datura stramonium e Physalis floridana. O vírus ocasionou lesões locais necróticas e necrose sistêmica seguida de morte de quatro espécies de Nicotiana. Em cortes ultra-finos de folhas de cubiu foram observadas partículas de formato circular envolvidas por membrana, típicas de tospovírus. A análise em SDS-PAGE da proteína do nucleocapsídeo concentrada a partir de folhas de cubiu revelou uma banda com aproximadamente 28 kDa, valor esperado para tospovírus. Um fragmento de aproximadamente 0,8 bp correspondente ao gene N (proteína do nucleocapsídeo) foi amplificado por RT-PCR, clonado e seqüenciado. Foi constatada homologia de seqüência de aminoácidos de 95% entre a proteína N do isolado do cubiu e de Groundnut ringspot virus (GRSV). Para as demais espécies a homologia foi inferior a 85%. Este é o primeiro relato da ocorrência natural do GRSV (ou qualquer outro vírus) em plantas de cubiu.

The cubiu (Solanum sessiliflorum) fruit, originating in the Amazon basin, is commonly used in that region for food, medicine, and cosmetics. In an experimental culture of cubiu, in order to evaluate its adaptation to conditions in the Northern region of the state of Rio de Janeiro, it was observed plants with mosaic symptoms. A cubiu plant was collected and analyzed to identify the etiological agent. After mechanical passage through a local lesion host, a host range test was performed. The virus induced chlorotic local lesions in Chenopodium quinoa, necrotic local lesions in Gomphrena globosa, mosaic in S. sessiliflorum, leaf and stem necrosis in tomato (Lycopersicon esculentum) 'Rutgers', mosaic and leaf distortion in Datura stramonium and Physalis floridana, and necrotic local lesions followed by systemic necrosis and plant death in four Nicotiana species. Electron microscopic observations of ultra thin sections from infected cubiu leaves showed the presence of spheroidal, membrane-bound particles typical of tospovirus species. Analysis of the nucleocapsid protein from concentrated virus particles indicated the presence of a 28 kDa protein. RT-PCR was performed after total RNA extraction from infected IPA-6 tomato leaves. A fragment of approximately 0,8 kbp corresponding to the N gene was amplified, cloned and sequenced. The N protein from the cubiu isolate was 95% homologous to the Groundnut ringspot virus (GRSV) protein, and no more than 85% homologous to those from Zucchini lethal chlorosis virus (ZLCV) and Chrysanthemun stem necrosis virus (CSNV), Tomato spotted wilt virus (TSWV), and Tomato chlorotic spot virus (TCSV). This is the first report of the occurrence of GRSV (or any other plant virus) in cubiu.

Esta pesquisa foi conduzida em casa de vegetação na Universidade Federal de Viçosa e objetivou estudar a resistência dos acessos CNPH 101, 374 e 402 de Lycopersicon peruvianum a Tuta absoluta e as causas químicas dessa resistência. Os tratamentos foram as espécies de tomateiro Lycopersicon esculentum (cvs. Santa e IPA-5: padrões de suscetibilidade) e os acessos de L. peruvianum. Avaliaram-se o número de ovos / folha, de minas pequenas (comprimento < 0,5 cm) e grandes (comprimento > 0,5 cm) e a percentagem de folíolos minados por T. absoluta. Realizou-se extração hexânica nas folhas, e os extratos obtidos foram submetidos a cromatografia gasosa associada a espectrômetro de massa. Nos acessos de L. peruvianum contataram-se menores taxas de oviposição, percentagens de folíolos minados, números de minas pequenas e grandes de T. absoluta do que nas cultivares IPA-5 e Santa Clara. Foram detectados 69 picos nos cromatogramas do extrato hexânico das folhas com concentração relativa > a 10(6) íons x seg. Verificou-se efeito significativo (p < 0,05) da concentração relativa na intensidade de ataque de T. absoluta somente para os picos 28, 42, 46, 55 e 58. As principais substâncias relacionadas com L. peruvianum foram: ciclobutanol; ácido hexadecanóico; ácido 9-octadecenóico e hexadecano (picos 28, 42, 46 e 55, respectivamente). Já o tetracosano (pico 58) esteve associado com L. esculentum. Todas as substâncias presentes nos extratos hexânicos estiveram associadas com o aumento da suscetibilidade dos tomateiros a T. absoluta.

The resistance of three accessions of Lycopersicon peruvianum (CNPH 101, 374 and 402) to Tuta absoluta (Meyrick) (Lepidoptera: Gelechiidae) and its chemical causes were studied. The trial was carried out in greenhouse in the Universidade Federal de Viçosa, with two susceptible tomato cultivars (Lycopersicon esculentum cvs. Santa Clara and IPA-5) and three accessions of L. peruvianum. The number of eggs per leaf, short leaf mines (length < 0.5 cm), long leaf mines (length > 0.5 cm) and the percentage of mined leaflets by T. absoluta were evaluated. All hexanic extracts were analyzed with a gas chromatography-mass spectrometer (GC-MS). Accessions of L. peruvianum showed lower number of eggs per leaf, percentage of mined leaflets and number of leaf mines (small and big) than the susceptible cultivars (IPA-5 and Santa Clara). The total number of compounds in the chromatograms was 69, with relative concentrations > 10(6) ions x second. The effect between T. absoluta attack and relative concentrations of the compounds showed by the five peaks (28, 42, 46, 55 and 58) was significant (p<0.05). The main substances related with L. peruvianum were: cyclobutanol; hexadecanoic acid; 9-octadecenoic acid and hexadecane (peaks 28, 42, 46 and 55, respectively). Tetracosane (peak 58) was related with L. esculentum. All substances in the leaf extracts were associated with the susceptibility of tomatoes to T. absoluta.