O presente trabalho teve como objetivos determinar a influência de células ovarianas no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais, avaliar a viabilidade das células ovarianas em monocamada e a influência do soro na manutenção de folículos pré-antrais in vitro. Folículos pré-antrais (FPs) e células ovarianas foram isolados de ovários de fetos bovinos, com idade entre 6 e 8 meses de gestação, oriundos de matadouro. Células ovarianas em monocamada foram cultivadas em meio TCM-199, e a viabilidade celular, após o cultivo na presença ou ausência de FSH, foi determinada com o corante vital azul de tripan. FPs foram distribuidos em quatro tratamentos e cultivados em TCM-199 modificado, contendo soro de novilho castrado (SNC), SNC em monocamada de células ovarianas (MCO), MCO com FSH ou meio definido com álcool polivinílico (PVA) como macromolécula. A viabilidade celular não foi afetada em conseqüência da presença ou ausência de FSH. No entanto, houve um incremento significativo no tamanho dos FPs cultivados na presença de SNC, MCO e FSH (P<0,05), o que não foi observado nos demais tratamentos. A adição de FSH ao meio de cultivo não influencia a viabilidade de células ovarianas ao longo de 20 dias. Folículos pré-antrais, com área superficial entre 4000 e 8000mim², mas não folículos com área superficial superiores a 8000mim², crescem in vitro na presença de células ovarianas, independentemente da presença de FSH.

The aim of the present work was to determine the influence of ovarian cells in the in vitro development of preantral follicles (PF). The viability of monolayer ovarian cells and the effect of the serum in the survive of in vitro PF was also investigated. Ovarian cells and PF were isolated from ovaries of bovine fetus between 6 and 8 months of pregnancy, obtained in a slaughterhouse. Monolayer of ovarian cells were cultured in a modified TCM-199 in the presence and absence of FSH and its viability after incubation was determined with Trypan Blue. PFs were divided in four different treatments, cultured in modified TCM-199, containing serum of castrated steer (SCS), SCS in monolayer of ovarian cells (MOC), MOC with FSH or a defined medium with polyvinyl alcohol (PVA) as macromolecule. The cellular viability was not affected by the presence or absence of FSH. However, PFs had a significant development (P<0.05) when cultivated in the presence of SNC, MCO and FSH, which was not observed in the other treatments. With these results, it was possible to conclude that FSH does not influence the viability of the ovarian cells when cultured in a monolayer for 20 days. Preantral follicles, measuring between 4000 and 8000mum² but not with size greater than 8000mum², grow on ovarian cells in vitro, independently of FSH.

O objetivo do presente estudo foi de avaliar a amplitude da variação de pH em meios de maturação e de cultivo embrionário, com diferentes concentrações do tampão HEPES. Inicialmente, foi determinado o efeito de diferentes concentrações de HEPES (0, 12,5 e 25,0mM) na variação do pH dos meios de maturação (TCM-199 modificado) e desenvolvimento embrionário (KSOM modificado) em meio ambiente, à temperatura de 25ºC, e na estufa, em uma atmosfera de 5% de CO2 em ar a 39ºC. Em um segundo experimento, os oócitos foram maturados em TCM-199 modificado sem HEPES (142 oócitos) ou com 25,0mM de HEPES (137 oócitos) e foi avaliado índice de blastocisto. O meio Fert-TALP foi utilizado para a fecundação, sendo que os embriões foram co-cultivados com células epiteliais de oviduto (CEO) em KSOM modificado com 10% de SFB. Um terceiro experimento foi delineado para determinar a importância da presença do HEPES no meio de cultivo embrionário sobre o desenvolvimento de embriões bovinos in vitro. Para isso, após a retirada do cumulus, os zigotos foram divididos ao acaso e co-cultivados com CEO em KSOM modificado (com 10% de SFB) sem HEPES (grupo controle; n = 95) ou com 25,0mM de HEPES (grupo HEPES; n = 92). Foram mantidos em cultivo somente os embriões com duas ou mais células, sendo considerados desenvolvidos os que atingiram o estádio de blastocisto expandido (Bx), 7 e 9 dias após inseminação. O cultivo dos oócitos e embriões, em ambos os experimentos, foi efetuado em estufa a 39ºC, com uma atmosfera contendo 5% de CO2 e umidade saturada. Os resultados mostram que os meios contendo 25,0mM de HEPES foram mais eficientes em minimizar a variação do pH que os meios com 12,5mM ou sem HEPES. Além disso, a adição de HEPES ao meio de maturação aumentou os índices de Bl sobre o total de oócitos e sobre o total de clivados (21,9% e 42,86%) com relação ao controle (10,56 e 16,67%; p<0,05). Na determinação da importância do HEPES no desenvolvimento embrionário, o grupo HEPES apresentou índices superiores de Bx (45,65%) em relação ao controle (11,58%; p<0,01). A uniformidade dos resultados foi um dos aspectos positivos observados quando o HEPES estava presente no meio de cultivo embrionário. Portanto, o uso do HEPES, durante a maturação e o cultivo embrionário, é recomendável para o aumento da produção de embriões in vitro com maior repetibilidade.

The aim of the present study was to evaluate the range of pH changes in maturation and embryo development media, buffered with different HEPES concentrations. Initially, the effect of different concentrations of HEPES (0, 12.5 and 25.0mM) on the variation of pH in the maturation (modified TCM-199) and embryonic development (modified KSOM) media was evaluated at room temperature (25ºC) and in an atmosphere of 5% CO2 in air at 39ºC. In another experiment, the effect of HEPES on in vitro oocyte maturation was determined. Oocytes were maturated in TCM-199 modified either with 25.0mM of HEPES (HEPES group; n = 137) or without HEPES (control group; n = 142), performing 7 replicates and evaluating the rate of blastocyst. In this study, the medium used for fertilization was Fert-TALP while for embryo development was KSOM with 10% of fetal bovine serum with monolayer of oviduct epithelial cells. A third experiment was designed to determine the effect of HEPES on embryo development. The zygotes were divided in two groups and co-incubated with oviduct epithelial cells in modified KSOM with 10% of fetal bovine serum without HEPES (n = 95) or with 25.0mM of HEPES (n = 92). For this experiment, it was used embryos with two or more cells and the embryo development was considered from cleavage to expanded blastocyst (Bx), 7 and 9 days after insemination. The oocytes and embryos were incubated at temperature of 39ºC, an atmosphere containing 5% CO2 in air and saturated humidity. The media with 25.0mM of HEPES were more efficient in minimizing the range of pH than those with 12.5mM or without HEPES. To determine the effect of HEPES during in vitro oocyte maturation, the percentage of Bl considered either the total number of oocytes or the total number of cleavages was higher in the HEPES group (21.9% or 42.9%, respectively) than those obtained in the control group (10.56% or 16.67%, respectively). When HEPES was added to embryo culture medium, the percentage of Bx (45.65%) was higher than that obtained in medium without HEPES (11.58%; p<0.01). The variability between replicates was lower when HEPES was present in embryo development medium, comparing to the medium without HEPES. Therefore, HEPES is an important compound to be present in media for oocyte maturation and embryo development, increasing the in vitro production of bovine embryos.

Este trabalho foi conduzido com o objetivo de avaliar o sêmen ovino criopreservado com etileno glicol em relação ao glicerol, quanto à motilidade progressiva e vigor e, especialmente, quanto à integridade das membranas plasmática, nuclear e mitocondrial. Foram utilizados ejaculados de sêmen provenientes de dois carneiros da raça Ile-de-France, com padrões mínimos de volume (0,5ml), turbilhonamento (2 de 0-5), motilidade progressiva (65%), vigor (3 de 0-5), aspecto (cremoso fino, 3x10(6) espermatozóides/mm3) e células normais (80%). Um total de 25 pools foi dividido em duas alíquotas, as quais foram, posteriormente, congeladas com etileno glicol a 0,5M ou glicerol a 0,72M em pellets. Os parâmetros utilizados, para avaliar o desempenho dos crioprotetores, foram a motilidade progressiva, vigor espermático e integridade do acrossomo e das membranas plasmáticas dos espermatozóides. A motilidade e vigor foram aferidos no sêmen fresco, resfriado, descongelado, mantido a 38°C por 5 horas de incubação (TTL- teste de termorresistência lento) e à temperatura de 45°C por 30 minutos (TTR- teste de termorresistência rápido). Não houve diferença entre o etileno glicol e o glicerol para a avaliação da morfologia do acrossomo, motilidade progressiva e vigor. As células espermáticas criopreservadas com etileno glicol apresentaram maior integridade das membranas plasmática, nuclear e mitocondrial do espermatozóide. O etileno glicol é mais eficiente do que o glicerol para preservar a integridade das membranas espermáticas na congelação de sêmen ovino.

The aim of the present experiment was to evaluate the effect of ethylene glycol, in relation to glycerol, as a cryoprotective agent for preserving ovine spermatic cells. The semen had to present a minimal quality to be used, regarding volume (0.5 ml), wave motion (score of 2, from 0 to 5), percentage of progressively motile spermatozoa (65%), rate of progressive motility (score of 3, from 0 to 5), sperm cell concentration (3x10(6) cells/mm³) and normal sperm morphology (80%). Each pool of semen from ejaculates of two rams was divided into two equal subsamples. One subsample was frozen with ethylene glycol and the other with glycerol. The parameters used to evaluate the semen were sperm motility, vigor, acrossome status and membrane integrity. Sperm motility was evaluated in fresh semen, cooled semen, frozen semen, after 5 hours at 38°C or after 30 minutes at 45°C. No difference was observed between ethylene glycol and glycerol for acrossome status and sperm motility. The sperm cells that were preserved with ethylene glycol showed more integrity of the plasmatic, nuclear and mitochondrial membranes. From the viewpoint of cell membrane integrity, it can be concluded that ethylene glycol gives higher protection to the sperm cell than glycerol.

A formação de pró-núcleos, clivagem e perfil protéico foram avaliados após a ativação da proteína quinase C (PQ-C) durante a maturação de complexos cumulus-oócito (CCOs) bovinos. Visando a determinar estes efeitos da PQ-C, 1936 CCOs foram distribuídos aleatoriamente em 4 tratamentos, sendo maturados na presença de PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, ativador da PQ-C), de 4alfa-PDD (100nM de 4alfa-phorbol 12,13-didecanoetate, forbol éster que não ativa a PQ-C; controle forbol éster), de SVE (10% de soro de vaca em estro, controle positivo) e de um controle negativo constituído pelo meio de maturação básico para os demais tratamentos, com exceção do SVE, onde não foi adicionado o álcool polivinílico (PVA). Os CCOs foram mantidos na presença de PMA por 1, 4 e 7 horas, sendo após, transferidos para o meio básico de maturação até que se completassem 24 horas de cultivo. A estimulação da PQ-C, por esses períodos, não alterou a formação de pró-núcleos, porém, diminuiu a percentagem de clivagem dos zigotos. Os resultados do grupo 4alfa-PDD comprovam que as alterações ocorridas no grupo PMA são devido à ativação da PQ-C e não ação direta do forbol éster na célula. A análise da composição protéica demonstrou uma banda de proteína adicional no grupo SVE ao redor de 74 kilo Daltons (kDa). Os resultados desse estudo, quando associados aos dados preliminares de Western blot, indicam a importância da PQ-C na regulação da maturação, fecundação e clivagem de embriões bovinos.

In the present study the pronucleus formation, cleavage and protein profile after protein kinase C (PK-C) activation were evaluated during bovine oocyte maturation. A total number of 1936 bovine cumulus-oocyte complexes (COCs) were randomly distributed in 4 treatments, and matured with PMA (100nM phorbol 12-myristate 13-acetate, PK-C activator), 4alpha-PDD (100nM de 4alpha-phorbol 12,13-didecanoetate, phobol ester that do not bind on PK-C, phorbol ester control), ECS (10% of estrus cow serum, positive control) and in a negative control (basic maturation media for all treatments, except on ECS group where the polyvinyl alcohol was not added). The COCs were kept in presence of PMA for 1, 4 or 7 hours and then transferred to basic maturation media until the 24 hours maturation period was completed. The PK-C stimulation in these periods did not alter the pronucleus formation but caused a decrease in the zygotes cleavage rate. The 4alpha-PDD group results showed that the alterations in PMA group were caused by PK-C activation and not by direct phorbol ester action on the cell. The protein composition analysis showed an additional protein band on ECS group around 74 kilo Daltons (kDa). Altogether, these results with the preliminary Western Blot analysis, indicate an important role of PK-C on bovine oocyte maturation, fertilization and embryo cleavage.