ABSTRACT Introduction: Within the Trypanosomatidae family, there are two genera of medical importance for their role as human pathogens, Trypanosoma and Leishmania. Within these genera are species and subspecies that cause leishmaniasis, American Trypanosomiasis and Human African Trypanosomiasis. Objective. In this study, we investigated the phylogenetic relationships of the genus Leishmania and Trypanosoma using the cytoplasmic hsp70 gene and we discussed the implications for species definitions, evolution and taxonomy of these genera. Methods: The hsp70 gene from 44 strains from 11 Leishmania species and 41 strains from 9 Trypanosoma species from different geographical origins were sequenced. The sequences obtained were aligned with the sequences previously published in the databases. The MEGA program was used for the construction of different phylogenetic trees based on distance and character parameters. The support of the monophyletic groups was determined by the "boostrap" method. Results: For the first time, the cytoplasmic hsp70 gene was used in phylogenetic studies of the Leishmania and Trypanosoma genus and, with the results obtained, it was demonstrated that it is convenient to use it as a molecular marker for molecular methods design for detection, identification and differentiation of Leishmania and Trypanosoma species and lineages. Evidence is provided that supports the hypothesis that the genus Leishmania originated in South America (“New World”), thus contributing to the general discussion about the origin of this genus. Conclusion: This study actively contributed to discussing the implications of this analysis for the taxonomic framework for the Leishmania and Trypanosoma genera.

RESUMEN Introducción: Dentro de la familia Trypanosomatidae hay dos géneros de importancia médica por su papel como patógenos humanos, Trypanosoma y Leishmania. Dentro de estos géneros se encuentran especies y subespecies causantes de la leishmaniasis, la tripanosomiasis americana y la tripanosomiasis africana humana. Objetivos: En este estudio investigamos las relaciones filogenéticas de los géneros Leishmania y Trypanosoma utilizando la secuencia del gen hsp70 citoplasmática y discutimos las implicaciones para las definiciones de especies, la evolución y la taxonomía de estos géneros. Métodos: Se secuenció el gen de la HSP70 de 44 cepas de 11 especies de Leishmania y 41 cepas de 9 especies de Trypanosoma de diferentes orígenes geográficos. Las secuencias obtenidas se alinearon con las secuencias publicadas previamente en las bases de datos. El programa MEGA se utilizó para la construcción de distintos árboles filogenéticos basados en parámetros de distancia y caracteres. El soporte de los grupos monofiléticos se determinó por el método de boostrap. Resultados: En el presente trabajo se utilizó por primera vez el gen de la hps70 citoplasmática para estudios filogenéticos de los géneros Leishmania y Trypanosoma y con ello se demostró la utilidad de utilizarlo como marcador molecular en el diseño de métodos para la detección, identificación y diferenciación de especies y linajes de Leishmania y Trypanosoma. Los resultados proporcionan evidencias que soportan la hipótesis de que el género Leishmania es originario del “nuevo mundo”. Conclusiones: Los resultados de los estudios, basados en el análisis filogenético del gen que codifica las hps70, contribuyeron a la discusión sobre de un marco general de consenso taxonómico para los géneros Leishmania y Trypanosoma.

INTRODUCTION: leishmaniosis has been regarded by the World Health Organization as one of the most important tropical diseases. It is very difficult to control such parasitosis because there are not vaccines, and therapy is generally toxic and unsatisfactory. It is of vital importance to set prompt diagnostic method along with identification of the parasite in order to select the suitable treatment and to design the most convenient control measures. Recently, the advances in molecular biology have made it possible to characterize Leishmania species by different methods. The random amplified polymorphic DNA technique is a simple method to detect the genetic polymorphic DNA. OBJECTIVE: to standardize the random amplified polymorphic DNA technique for its use in New World Leishmania species typing. METHODS: by using 5 pmol primer concentration, 75 ng of template DNA, 2 mM of magnesium chloride and 2 U of polymerase DNA Taq in 25µL reaction, two reproducible amplification patters were obtained. The optimized random amplified polymorphic DNA technique served to determine the genetic differences among ten reference strains of Leishmania, with 6 sets of randomly designed conventional primers. The UP GMA method-based grouping strategy determined the phylogenetic relation among the studied species. RESULTS: OPA primers -3, 4 and 8 allowed distinguishing the ten reference strains of Leishmania under study. Two well defined genetic groups including species of Leishmania and Viannia subgenres were obtained; these 2 subgenres showed genetic differences. CONCLUSIONS: in this way, our laboratory has the optimized random amplified polymorphic DNA for the identification of Leishmania species.

INTRODUCCIÓN: la leishmaniosis ha sido clasificada por la Organización Mundial de la Salud como una de las enfermedades tropicales más importantes. El control de esta parasitosis es muy difícil, porque no existen vacunas y el tratamiento es tóxico e insatisfactorio. Es de crucial importancia establecer un método de diagnóstico oportuno junto a la identificación del parásito, lo cual incide en la selección del tratamiento adecuado y en el diseño de las medidas de control apropiadas. Recientemente, los avances en biología molecular han permitido la caracterización de especies de Leishmania por diferentes métodos. La técnica de ADN polimórfico amplificado al azar es una técnica simple para detectar el polimorfismo genético del ADN. OBJETIVO: estandarizar la técnica de ADN polimórfico amplificado al azar para su utilización en la tipificación de especies de Leishmania del Nuevo Mundo. MÉTODOS: empleando una concentración de cebador de 5 pmol, 75 ng de ADN molde, 2 mM de cloruro de magnesio y 2 U de Taq ADN polimerasa en 25 mL de reacción, se obtuvieron patrones de amplificación reproducibles. La técnica optimizada de ADN polimórfico amplificado al azar se empleó para determinar las diferencias genéticas entre 10 cepas de referencia de Leishmania, con la utilización de 6 juegos de cebadores comerciales diseñados al azar. La relación filogenética entre las especies estudiadas se determinó utilizando la estrategia de agrupaciones mediante el método de UPGMA. RESULTADOS: los cebadores OPA 3, 4 y 8 permitieron diferenciar las 10 cepas de referencia de Leishmania estudiadas. Se obtuvieron 2 grupos genéticos bien definidos donde se agrupan las especies del subgénero Leishmania y Viannia, respectivamente; los 2 subgéneros mostraron diferencias genéticas. CONCLUSIONES: de esta forma se cuenta en el laboratorio con la técnica del ADN polimórfico amplificado al azar optimizada para la identificación de especies de Leishmania.

The infective capacity of Leishmania amazonensis promastigotes was evaluated after they were treated with a series of 10 thiadiazine derivatives. The parasites were incubated for 24 hours with 1 or 0,1 mg/ml of each compound and then, peritoneal macrophages from BALB/c mice were infected in cultures. All the compounds managed to reduce the infective capacity of parasites by more than 50%. T10 product exhibited the highest effect since it reduced infection by 92,8%.

Se evaluó la capacidad infectiva de promastigotes de Leishmania amazonensis al ser tratados con una serie de 10 derivados de la tiadiazina. Los parásitos fueron incubados durante 24 h con 1 o 0,1 mg/mL de cada compuesto y posteriormente, se infectaron macrófagos peritoneales de ratones BALB/c en cultivos. Todos los compuestos causaron una reducción de la capacidad infectiva de los parásitos mayor que 50 %. El producto T1O fue el que causó un mayor efecto, disminuyendo la infección en 92,8 % de infección.

The antiprotozoan activity of the essential oil extracted from Artemisa abrotanum, Chenopodium ambrosioides, Pinus caribaea, Piper aduncum and Piper auritum, was evaluated. The evaluated oils did not show activity against L. amozonensis; however, the oil extracted from C. ambrosoides showed a promising activity against Trichomonas vaginalis with a minimum inhibitory concentration of 25 mg/mL.

Se evaluó la actividad antiprotozoaria del aceite esencial extraído de Artemisia abrotanum, Chenopodium ambrosioides, Pinus caribaea, Piper aduncum y Piper auritum. Los aceites evaluados no mostraron actividad contra L. amazonensis; sin embargo, frente a Trichomonas vaginalis el aceite extraído de C. ambrosioides mostró una actividad promisoria con una concentración mínima inhibitoria de 25 mg/mL.

A genomic library of Leishaminia amazonensis was built through a pcDNA3 vector, with expression promoter in eukaryot cells, to contribute to the application of immunization technology with nucleic acids in leishmaniasis. To show the expression genomic library in the muscles of mice immunized with it, the indirect immunofluoresce technique was used. A mix of sera with high antileishmania titers from an area where L.braziliensis infection is predominant was used as primary antibody. A library of 80% recombinant clones was obtained. Antigen determinant expression was confirmed in immunized BALB/c mice´s muscles, according to the results of immunofluorescence testing.

Se construyó una biblioteca genómica de Leishmania amazonensis mediante el vector pcDNA3, con promotor de expresión en células eucariotas, con el objetivo de contribuir a la aplicación de la tecnología de inmunización con ácidos nucleicos en la leishmaniosis. Para demostrar la expresión de la genoteca en el músculo de ratones inmunizados con esta, se realizó la técnica de inmunofluorescencia indirecta. Como anticuerpo primario se utilizó una mezcla de sueros con alto título antileishmania, de una zona donde predomina la infección con L. braziliensis. Se obtuvo una biblioteca con 80 % de clones recombinantes. Se demostró la expresión de determinantes antigénicos en el músculo de ratones BALB/c inmunizados, según resultados de la inmunofluorescencia.

An expression genomic library of Trypanosoma cruzi was built by using plasmid pc DNA3 as a vector. This library served to immunize by intramuscular administration BALB/c inbred mice. A positive control group to which T.cruzi soluble antigens were administered and other group which was given the same plasmid used for the building of the genomic library were included in this study; another group was not immunized. Blood was extracted from the retrorbital plexus of all the mice two weeks after the third vaccination so as to study the specific antibody response to soluble parasite anigens through the Western Blot technique. The antibody response was shown in animals immunized with the expression genomic library and with soluble parasite antigens.

Se construyó una biblioteca genómica de expresión de Trypanosoma cruzi con la utilización como vector el plásmido pcDNA3, con la cual se inmunizaron ratones de la línea isogénica BALB/c por vía intramuscular. Se empleó un grupo control positivo al que se le administraron antígenos solubles de T. cruzi y otro grupo que recibió el plásmido utilizado para la construcción de la biblioteca genómica; un grupo no recibió inmunización. A todos los animales se les extrajo sangre del plexo retrorbital 2 semanas posteriores a la tercera inmunización, para estudiar la respuesta de anticuerpos específicos contra los antígenos solubles del parásito mediante la técnica de western blot. Se obtuvo una respuesta de anticuerpos en los animales inmunizados con la biblioteca genómica de expresión y con antígenos solubles del parásito.

A study of Plasmodium vinckei peterri sporogony was performed by experimental infection of Anopheles stephensi with gametocytes from infected mice. The study includes the description of the ookinete, complete evolution of oocysts and their final transformation to sporozoites. These were later used for intravenous infection of new mice, in order to study the exoerythrocytic schizogony. The morphology of exoerythrocytic schizonts was similar to that of other species of the same group. The minimal duration of the hepatic cycle was found to be of 61 hours. These data, along with other related to the hematic cycle characteristics, help to complete the information on the species, which can be recommended as a model for the study of human malaria.

Por medio de la infección experimental de Anopheles stephensi, a partir de ratones portadores de gametocitos de Plasmodium vinckei petteri, se realizó el estudio morfológico de la esporogonia, que comprende: la descripción del ooquineto, la evolución completa de los ooquistes y su transformación final en esporozoitos. Estos fueron empleados más tarde para infectar por via intravenosa nuevos ratones, a los que se realizó biopsias sucesivas, para el estudio de los esquizontes exoeritrocíticos, cuya morfología no difere de la de otras especies del grupo. Se determinó la duración mínima del ciclo hepático, que resultó ser de 61 horas. Estos datos, junto a otros que refieren las características del ciclo hemático, ayudan a completar la información que se tiene sobre la especie, que la hacen recomendable para su utilización como modelo experimental en el estudio de la malaria humana.