ABSTRACT Introduction: Dengue is the fastest spreading mosquito-borne viral disease worldwide. Despite its high incidence, no effective antiviral treatment or vaccine has been approved for use against this infection. The plant Ageratina havanensis has been widely used in our folk culture and in other countries due to its various biological properties. Objective: Evaluate the antiviral activity of four extracts from Ageratina havanensis and two flavonoids isolated from that plant against the dengue 2 virus. Methods: Primary screening of the antiviral activity of each extract and flavonoid was conducted by viral productivity detection assay, and an evaluation was carried out of the virucidal action of the stem ethanolic extract and the leaf butanolic extract. Results: All the extracts inhibited viral replication by a reduction in the number of lysis plates. However, no evidence was found of a reduced viral infective titer in the virucidal assay. Treatment with sakuranetin achieved viral productivity inhibition values of 61%-91%, whereas 7-methoxyaromadendrin obtained viral reduction values of 64%-86%. Conclusions: The extracts and flavonoids isolated from Ageratina havanensis displayed antiviral activity. The stem ethanolic extract and the leaf butanolic extract do not have a virucidal action against the viral strain used. The paper is the first report about the effect of extracts and compounds isolated from A. havanensis against the dengue virus.

RESUMEN Introducción: El dengue es la enfermedad viral transmitida por mosquitos de más rápida propagación en el mundo. A pesar de la alta incidencia de la enfermedad no existe tratamiento antiviral efectivo ni vacuna aprobada para su uso contra esta infección. La planta Ageratina havanensis ha sido ampliamente utilizada por nuestra cultura popular y en otros países debido a sus diversas propiedades biológicas. Objetivo: Evaluar la actividad antiviral de cuatro extractos provenientes de Ageratina havanensis y dos flavonoides aislados de dicha planta frente al virus dengue 2. Métodos: La pesquisa primaria de actividad antiviral de cada extracto y flavonoide se realizó mediante el ensayo de detección de la productividad vírica, y se evaluó la acción virucida de los extractos etanólico de tallo y butanólico de hoja. Resultados: Todos los extractos inhibieron la replicación viral al evidenciarse disminución del número de placas de lisis, sin embargo, no se evidenció disminución del título infectivo viral en el ensayo virucida. El tratamiento con la sakuranetina mostró valores de inhibición de la productividad viral entre 61-91 %, y para la 7-metoxiaromadendrina se registraron valores de reducción viral entre 64-86 %. Conclusiones: Los extractos y flavonoides aislados de Ageratina havanensis mostraron acción antiviral. Los extractos etanólico de tallo y butanólico de hojas no poseen acción virucida sobre la cepa viral empleada. El presente trabajo constituye el primer informe respecto a la evaluación de extractos y compuestos aislados de A. havanensis frente al virus dengue.

The antiviral activity of Phyllanthus orbicularis, an endemic Cuban plant, against the hepatitis B virus was evaluated in vitro. The ability of the aqueous extract and 2 tannin- and flavonoid-rich chemical fractions (aqueous-acetic and buthanolic) to inhibit the hepatitis B surface antigen (HBsAg) production was determined in PLF/PRC/5 cellas, a human hepatoma cell line that constitutively expresses this antigen. The aqueous extract was effective in inhibiting the HBsAg at 24 and 48 hours of treatment, being the selective index (SI) above 10, with concentration-dependent inhibitory activity. The evaluation of the inhibitory action of the two fractions from the plant proved that both were effective and their selective indexes were also higher than 10. These results indicated the inhibitory activity against HBsAg of the plant and the presence of phenolic compounds that could reduce the antigen production. This may contribute to an in vivo antiviral action. This paper also corroborated the antiviral potential of the aqueous extract from Phyllanthus orbicularis Kunth, in addition to supporting the use of PLC/PRF/5 for future evaluations or trials directed towards assessing the anti-hepatitis B activity of various products. Likewise, it paved the way for the detection of the chemical component(s) responsible for the plant's action against hepatitis B virus.

La actividad antiviral de Phyllanthus orbicularis Kunth, planta endémica de Cuba, frente al virus de la hepatitis B, fue estudiada in vitro. Se determinó la capacidad del extracto acuoso y 2 fracciones químicas ricas en taninos y flavonoides (acético-acuosa y butanólica) para inhibir la producción o bloquear la detección del antígeno de superficie de la hepatitis B (AgsHB) en las células PLC/PRF/5, una línea celular de hepatoma humano que expresa este marcador constitutivamente. El extracto acuoso fue efectivo al inhibir el AgsHB producido a las 24 y 48 h con índices selectivos superiores a 10, con una acción inhibitoria dependiente de la concentración. La evaluación de la actividad de las fracciones obtenidas a partir de esta planta mostró que ambas eran efectivas con índices selectivos superiores a 10. Estos resultados sugieren que existe una actividad inhibitoria del antígeno estudiado y que esta planta posee algunos compuestos fenólicos que podrían actuar sobre el AgsHB y reducir su producción en las células, lo que indica una posible actividad in vivo. Este trabajo corrobora el potencial de acción antiviral del extracto acuoso de P orbicularis, además de avalar el empleo de la línea PLC/PRF/5 para futuras evaluaciones o ensayos encaminados a valorar la actividad antihepatitis B de diferentes productos. De igual forma abre el camino para la determinación de aquel o aquellos componentes químicos responsables de la actividad de la planta frente al virus de la hepatitis B.

The antiviral activity of extracts obtained from Ageratina havanensis (Kunth) R.M.King & H.Rob., Asteraceae, against rabbit vesivirus (RaV) (Caliciviridae) and human herpes simplex viruses type 1 and 2 (HSV-1, HSV-2) (Herpesviridae) were analyzed, and the main metabolites from the most active extract were isolated and characterized. The antiviral properties were investigated by measuring the inhibition of viral-induced cytopathic effect in Vero cells. The strongest inhibitory effects were found for ethyl acetate extract from leaves (SI=5 for RaV and SI=5.4 for HSV-1). The crude ethyl acetate extract was further fractionated by chromatographic methods and the structures of isolated compounds were established through comprehensive spectroscopic analyses, including IR, 2D NMR and MS. Four flavonoids were identified: 5,4'-dihydroxy-7-methoxyflavanone (sakuranetin), 3,5,4'-trihydroxy-7-methoxyflavanone (7-methoxyaromadendrin), 4'-O-β-D-glucosyl-5,3'-dihydroxy-7-methoxyflavanone (4'-O-β-D-glucosyl-7-methoxy-eriodictyol) and 4'-O-β-D-glucosyl-5-hydroxy-7-methoxyflavanone (4'-O-β-D-glucosylsakuranetin). This is the first report on antiviral activity for Ageratina havanensis.

The antiviral properties of plants extracts derived from Calendula officinalis L., Psidium guajava L., Eucaliptus spp. y Phyllanthus orbicularis HBK against the hepatitis B virus were evaluated at subtoxic concentrations in the in vitro PLC/PRF/5 system or Alexander cells, a cell line expressing constitutively the virus surface antigen (AgsHB). The cell viability parameter that was measured by the calculation of the mean cytotoxic concentration values (CC50): Eucalyptus spp. showed a lower toxicity in the cells, followed by Psidium guajava L., Phyllanthus orbicularis, and finally Calendula officinalis that had a much higher toxicity than the previous extracts. Later on, it was studied the behaviour of the production of intracellular and extracellular HBsAg of the cells at different concentrations of the extracts during 48 hours of treatment. The data obtained showed an inhibitory activity in the case of Phyllanthus orbicularis, as well as for the eucaliptus extract. With the guava extract, the activity was lower than in the 2 previous cases, whereas calendula did not show any inhibition to the assayed concentrations, which proves the absence of the activity searched in this extract.

Se evaluaron las propiedades antivirales de los extractos vegetales derivados a partir de las plantas: Calendula officinalis L., Psidium guajava L., Eucaliptos spp. y Phyllanthus orbicularis HBK contra el virus de la hepatitis B. Se llevó a cabo a concentraciones subtóxicas en el sistema in vitro PLC/PRF/5 o células Alexander, línea celular que expresa constitutivamente el antígeno de superficie del virus (AgsHB). El parámetro de viabilidad celular se midió mediante el cálculo de los valores de concentración citotóxica media (CC50): Eucalyptus spp. mostró una menor toxicidad en las células, seguido de Psidium guajava L., Phyllanthus orbicularis, y finalmente Calendula officinalis que tuvo una toxicidad mucho mayor que los extractos anteriores. Posteriormente se estudió el comportamiento de la producción de AgsHB intracelular y extracelular de las células a diferentes concentraciones de los extractos durante 48 h de tratamiento. Los datos obtenidos mostraron actividad inhibitoria en el caso de Phyllanthus orbicularis, así como para el extracto de eucalipto. Con el extracto de guayaba la actividad fue menor que en los 2 casos anteriores, mientras que la caléndula no mostró ninguna inhibición a las concentraciones ensayadas, lo que indica la ausencia de la actividad buscada en este extracto.

The authors studied the inactivation of AgsHB by extracts from 2 harvests of Phyllanthus orbicularis, carried out at different times of the year (March/94 and October/94) in 34 positive sera at this marker. These results were compared with those obtained for the harvest of August/93 to know the influence on harvesting time on the presence of the anti-hepatitis B activity of the plant. All the assayed concentrations (100, 50, and 254 mg/mL) reduced the absorbency values in sera, achieving a statistically significant seroconversion to negatives, excepting what happened for concentrations of 25 and 12,5 mg/mL of the harvest of October/94. The quantity of negative sera was proportional to the concentrations used. There were statistically differences between the harvests of August/93 and October/94. These results suggested that alterations may occur in the presence or concentration of the possible active components of P. orbicularis due to the influence of external factors, such as the climatic conditions.

Se estudió la inactivación del AgsHB por extractos de 2 colectas de Phyllanthus orbicularis realizadas en diferentes épocas del año (Marzo/94 y Octubre/94) en 34 sueros positivos a este marcador, y se compararon estos resultados con los obtenidos para la colecta Agosto/93, con el objetivo de conocer la influencia de la época de colecta en la presencia de la actividad anti-hepatitis B de la planta. Todas las concentraciones ensayadas (100, 50 y 25 mg/mL) disminuyeron los valores de absorbancia en los sueros, y se logró una seroconversión a negativos estadísticamente significativa, con excepción de lo ocurrido para las concentraciones de 25 y 12,5 mg/mL de la colecta Octubre/94. La cantidad de sueros negativos fue proporcional a las concentraciones utilizadas. Se observaron diferencias estadísticas entre las colectas Agosto/93 y Octubre/94. Estos resultados sugirieron que podían ocurrir alteraciones en la presencia o concentración de los posibles componentes activos de P.orbicularis producto de la influencia de factores externos como lo son las condiciones climáticas.

Some species of Phyllantus gendre have showed in vitro and in vivo activity to hepatitis B. In present paper, we assess inactivation capacity on AgsHB from aqueous extract of endemic Phyllanthus orbicularis species. Authors analyze 4 concentrations of extract (100, 50, 25, 12,5 mg/mL) as opposed to 34 positive sera to this marker. All concentrations assayed showed ability to decrease value of optic density in more than 60 % of sera studied, while percent of sera becoming negatives, was of 88,2 %, 97,1 % 50 %, and 8,8 %, respectively. In concentration of 12,5 mg/mL there was not statistically differences with regard to controls; while concentrations of 100 mg/mL and 50 mg/mL, which weren't statistically different each other, were the most effective ones. These results show that aqueous extract of P. orbicularis present one o some compounds, able to inactivate in vitro AgsHB.

Algunas especies del género Phyllanthus han demostrado actividad frente al virus de la hepatitis B in vitro e in vivo. En este trabajo se evalúa la capacidad de inactivación sobre el AgsHB de un extracto acuoso de la especie endémica Phyllanthus orbicularis. Se analizaron 4 concentraciones del extracto (100, 50, 25, 12,5 mg/mL) frente a 34 sueros positivos a este marcador. Todas las concentraciones ensayadas mostraron la capacidad de disminuir el valor de densidad óptica en más del 60 % de los sueros tratados, mientras que el por ciento de sueros que se convirtieron a negativos fue de 88,2 %, 97,1 %, 50 % y 8,8 %, respectivamente. La concentración de 12,5 mg/mL no mostró diferencias estadísticas con respecto al grupo control; mientras que las concentraciones de 100 mg/mL y 50 mg/mL, las cuales no se diferencian estadísticamente entre sí, fueron las más efectivas. Estos resultados muestran que el extracto acuoso de P. orbicularis presenta uno o varios compuestos capaces de inactivar in vitro al AgsHB.

The usefulness of the whole sample taking in filter paper for the detection of anti-HAV IgM is described. 168 serum and filter paper samples were simultaneously compared. No alterations were observed in the specificity of the enzyme-linked immunosorbent assay for the catchment of IgM in the 52 samples of the control group or in the other 116 from patients with clinical suspicion of acute viral hepatitis. A sensitivity, specificity and coincidence of 100 % was obtained on comparing the filter paper with the dilution 1:500 with the serum. The correlation established between the values of optical density of the positive results to anti-HAV IgM, the filter paper at dilution 1:500 and the serum was of 0.895. On applying this type of sample taking in a group of hospitalized patients, 100 % of coindicence with clinical suspicion was attained. Besides, it was proved its usefulnes for the diagnosis of a viral hepatitis outbreak. According to our results, it is recommended the introduction of this type of sample taking in the diagnosis of hepatitis A.

Se describe la utilidad de la toma de muestra total en papel de filtro para la detección de la IgM antivirus de la hepatitis A (VHA). Se compararon simultáneamente 168 muestras de suero y papel de filtro, en las 52 muestras que conformaron el grupo control, no se detectaron alteraciones en la especificidad del ELISA de captura de IGM, y en las 116 restantes, que procedían de pacientes con sospecha clínica de hepatitis viral aguda, se obtuvo una sensibilidad, una especificidad y una coincidencia de 100 % al comparar el papel de filtro con la dilución 1:500 y el suero. La correlación entre los valores de densidad óptica de los resultados positivos a la IgM anti-VHA entre el papel de filtro a la dilución 1:500 y el suero, fue de 0,895. Al aplicar este tipo de colecta de muestra en un grupo de enfermos hospitalizados, se obtuvo 100 % de coincidencia con la sospecha clínica; además, se demostró su utilidad en el diagnóstico de un brote de hepatitis viral. Nuestros resultados recomiendan la introducción de este tipo de recolección de muestras en el diagnóstico de la hepatitis A.