RESUMO Os objetivos do presente estudo foram avaliar in vitro se oócitos bovinos e células epiteliais de oviduto provenientes de abatedouros para uso em fertilização in vitro podem ser infectados com o herpesvírus bovino tipo 1; analisar se o tratamento com tripsina padronizado pelo International Embryo Transfer Society é eficiente para inativar o herpesvírus bovino tipo 1; estudar morfologicamente a interação vírus e oócito pela microscopia óptica. Neste estudo, as células Madin Darby Bovine Kidney (MDBK), que foram cocultivadas com oócitos maturados in vitro e expostos ao herpesvírus bovino tipo 1, apresentaram efeito citopático. A reação em cadeia da polimerase aninhada ao sobrenadante foi positiva para o herpesvírus bovino tipo 1, sugerindo que o efeito citopático observado na monocamada MDBK foi em função da replicação do vírus, mas não devido a qualquer toxicidade da cultura. Também foram mostrados efeito citopático e reação em cadeia da polimerase aninhada positivos em células MDBK cocultivadas com oócitos maturados in vitro isentos de vírus, porém que foram cocultivados em células epiteliais uterinas previamente infectadas com herpesvírus bovino tipo 1, que se lavou ou não com tripsina, demonstrando uma contaminação pelo vírus do oócito. Quando foi avaliada a eficácia de lavagem com a tripsina, foi possível notar que este tratamento não foi capaz de eliminar o herpesvírus bovino tipo 1 dos oócitos, e não foi observada qualquer diferença morfológica nos oócitos infectados.

The aims of this study were to assess in vitro if bovine oocytes and oviductal epithelial cells from slaughterhouses for in vitro fertilization use may be infected with bovine herpesvirus 1; to analyze whether the treatment with trypsin according to the International Embryo Transfer Society guideline is efficient to inactivate the bovine herpesvirus 1; to morphologically study the virus-oocyte interaction through optical microscopy. In this study, Madin Darby Bovine Kidney (MDBK) cells that were co-cultured with oocytes matured in vitro and exposed to bovine herpesvirus 1 showed a cytopathic effect. The nested polymerase chain reaction for the supernatant was positive for the bovine herpesvirus 1, thus suggesting that the cytopathic effect observed in the MDBK monolayer was seen due to virus replication and not because of any culture toxicity. It was also observed cytopathic effect and positive nested polymerase chain reaction in MDBK cells co-cultured with in vitro maturated oocytes free of virus, but that were co-cultured in uterine epithelial cells pre-infected with bovine herpesvirus 1 and washed or not with trypsin, demonstrating an oocyte contamination by the virus. When trypsin-washing efficacy was evaluated, we could observe that the trypsin treatment was not able to eliminate the bovine herpesvirus 1 of the oocytes, and it was not observed any morphological difference in the infected oocytes.

Leptin, thyroglobulin and diacylglycerol O-acyltransferase play important roles in fat metabolism. Fat deposition has an influence on meat quality and consumers' choice. The aim of this study was to determine allele and genotype frequencies of polymorphisms of the bovine genes, which encode leptin (LEP), thyroglobulin (TG) and diacylglycerol O-acyltransferase (DGAT1). A further objective was to establish the effects of these polymorphisms on meat characteristics. We genotyped 147 animals belonging to the Nelore (Bos indicus), Canchim (5/8 Bos taurus + 3/8 Bos indicus), Rubia Gallega X Nelore (1/2 Bos taurus + 1/2 Bos indicus), Brangus Three-way cross (9/16 Bos taurus + 7/16 Bos indicus) and Braunvieh Three-way cross (3/4 Bos taurus + 1/4 Bos indicus) breeds. Backfat thickness, total lipids, marbling score, ribeye area and shear force were fitted, using the General Linear Model (GLM) procedure of the SAS software. The least square means of genotypes and genetic groups were compared using Tukey's test. Allele frequencies vary among the genetic groups, depending on Bos indicus versus Bos taurus influence. The LEP polymorphism segregates in pure Bos indicus Nelore animals, which is a new finding. The T allele of TG is fixed in Nelore, and DGAT1 segregates in all groups, but the frequency of allele A is lower in Nelore animals. The results showed no association between the genotypes and traits studied, but a genetic group effect on these traits was found. So, the genetic background remains relevant for fat deposition and meat tenderness, but the gene markers developed for Bos taurus may be insufficient for Bos indicus.

A inativação de leptospiras em misturas de sêmen, obtidas através de vagina artificial, de três touros holandeses, foi estudada. A concentração espermática foi ajustada em diluidor gema-citrato utilizando os seguintes tratamentos: A (controle; sem antibióticos); B (penicilina, 1000 UI/mL - estreptomicina, 1000 µg/mL); C (amoxicilina, 1000 µg/mL); D (ceftiofur sódico, 1000 µg/mL); E (amoxicilina 1000 µg/mL - ceftiofur sódico 1000 µg/mL). Leptospiras (2,0x10(6) leptospiras/mL) foram adicionadas ao sêmen diluído. A recuperação das leptospiras foi obtida em meio EMJH modificado semi-sólido, com e sem antibióticos. As médias da porcentagem de motilidade progressiva e a de motilidade individual progressiva dos espermatozóides não foram afetadas pelos antibióticos nas concentrações usadas. Penicilina-estreptomicina apresentou os melhores resultados na inativação das leptospiras (97.1%). Amoxicilina, ceftiofur sódico e suas combinações, nas concentrações estudadas, apresentaram resultados insatisfatórios: 59.29%; 32.5% e 60.36% de inativação, sendo menos efetivos na inativação das leptospiras do que penicilina-estreptomicina.

Inactivation of leptospires in pools of semen from three Holstein Friesian bulls, collected in an artificial vagina, was investigated. Spermatic concentration was adjusted in egg yolk citrate extender, submitted to the following treatments: A (control; without antibiotics); B (penicillin, 1,000 UI/mL - streptomycin, 1,000 µg/mL); C (amoxicillin, 1,000 µg/mL); D (ceptiofur sodium, 1,000 µg/mL); E (amoxicillin 1,000 µg/mL - ceptiofur sodium 1,000 µg/mL). Leptospires (2.0 x 10(6) leptospires/mL) were added into the diluted semen. Recovery of leptospires was obtained in modified EMJH semi-solid medium with and without antibiotics. The antibiotics in the concentrations used did not affect means of percentage of progressive motility and individual progressive motility of spermatozoids. Penicillin-streptomycin presented the best results in leptospire inactivation (97.1%). Amoxicillin, ceptiofur sodium and their combination at the concentrations studied presented poor results: 59.29%; 32.5% and 60.36% of inactivation, being less effective in leptospire inactivation than penicillin-streptomycin.

O objetivo deste estudo foi avaliar os protocolos de capacitação espermática in vitro com 100 mg/ml de heparina e 5 mM de cálcio ionóforo e correlacionar a capacitação com a fertilidade in vivo. A capacitação espermática foi avaliada pela coloração com iodeto de propídio e diacetato de carboxifluoresceína e pela coloração tripla com vermelho congo, vermelho neutro e giemsa. Os espermatozóides foram avaliados quanto a viabilidade (vivos ou mortos) e a qualidade do acrossomo (lesados ou íntegros), sendo caracterizados como capacitados (vivos e lesados), não capacitados (vivos e íntegros) e mortos (lesados ou íntegros). A heparina apresentou 64,54% e 39,16% e o cálcio ionóforo 36,41% e 18,11% de espermatozóides capacitados, respectivamente, pela epifluorescência e coloração tripla. Os touros foram divididos em três grupos de fertilidade, sendo o Grupo A <63%, o Grupo B entre 63 e 68% e o Grupo C >68%. Nos três grupos houve diferença significativa (p<0,01) em relação aos espermatozóides capacitados dos tratamentos com heparina e cálcio ionóforo, tanto na epifluorescência quanto na coloração tripla. Não houve diferença estatística significativa (p>0,01) para os espermatozóides capacitados, não capacitados e mortos entre os grupos A, B e C, tanto na epifluorescência quanto na coloração tripla para ambos capacitores (heparina e cálcio ionóforo). Não houve correlação entre os espermatozóides capacitados in vitro e a taxa de fertilidade a campo. A heparina apresentou melhor taxa de espermatozóides capacitados e a epifluorescência mostrou-se mais eficiente na detecção da capacitação espermática (p<0,01).

The aim of this particular study was to test in vitro sperm capacitation protocols, using heparin (100mg/ml) and calcium ionophore (5mM). Propidium iodide and carboxifluorescein diacetate (IP/CFDA) in a fluorescence microscope as well as triple stain (congo red, neutral red and Giemsa) in Phase contrast microscope were used as staining. The spermatozoa were classified according to its viability (alive or dead) and acrossome integrity (damaged or intact). They were considered as follows: capacitated (alive and damaged); non capacitated (alive and not damaged) and dead (damaged or intact). The heparin group showed a ratio of 64.54% and 39.16% of capacitated spermatozoa in IP/CFDA and triple stain, respectively. In the calcium group, 36.41% and 18.11% of spermatozoa were capacitated in IP/CFDA and triple stain, respectively. Bulls were divided into 3 groups according to their fertility rates as follows: Group A < 63%, Group B from 63 to 68% and Group C > 68%. For all three groups there was significant differences (p<0.01), regarding capacitated spermatozoa with heparin and calcium ionophore in both stains IP/CFDA and triple stain. On the other hand, there was no significant differences (p>0.01), when observed capacitated, non capacitated and dead spermatozoa among groups A and B; A and C; B and C, using heparin and calcium ionophore in both stains. No correlation was seen between capacitation and fertility rates. Therefore heparin treatment showed better sperm capacitation rates than calcium ionophore. The IP/CFDA technique showed itself as being a better method to evaluate sperm capacitation than the triple stain (p<0.01).

Este trabalho avaliou o desenvolvimento in vitro e in vivo de mórulas de camundongos congeladas por diferentes métodos. A congelação lenta foi realizada em 1,5M de etileno glicol (EG) sendo os embriões resfriados a 0,5; 0,7; 1,0 e 1,2ºC/minuto. Na vitrificação, as mórulas foram equilibradas por 3 minutos em 20% de EG e vitrificadas em solução contendo 40% de EG, 18% de ficol e 10,26% de sacarose após 60 segundos de exposição. A congelação rápida em vapor de nitrogênio foi realizada em solução contendo 3M de EG + 0,3M de sacarose após 2 ou 5 minutos de exposição. Os embriões dos três métodos foram descongelados pela exposição das palhetas ao ar por 10 segundos e imersão em água a 25ºC por 20 segundos. Todos os embriões descongelados foram cultivados in vitro por 72 horas para avaliação da sobrevivência in vitro. Para avaliação da sobrevivência in vivo, mórulas congeladas e não congeladas (controle) foram transferidas para receptoras. O desenvolvimento in vitro nas velocidades de 0,5; 0,7; 1,0 e 1,2ºC/minuto foi, respectivamente, 72,3; 79,6; 76,5 e 84,8%. Não houve diferença estatística entre as velocidades de 0,7; 1,0 e 1,2ºC/minuto (p > 0,01). O desenvolvimento in vitro das mórulas congeladas por vitrificação e pelo método rápido (84,5 e 74,3%, respectivamente) foi semelhante ao método lento. In vivo, a taxa de implantação e o número de fetos vivos não diferiram estatisticamente entre os grupos lento a 1,2ºC/minute, vitrificação e rápido.

The in vitro and in vivo development of mouse morulae after cryopreservation through different methods was examined. The slow-freezing involved an equilibration in 1.5M ethylene glycol (EG) and cooled at 0.5; 0.7; 1.0 or 1.2ºC/minute. The vitrification involved a 3 minutes equilibration in 20% EG and 60 seconds in solution containing 40% EG, 18% ficoll and 10.26% sucrose. The quick-freezing involved an equilibration in 3M EG + 0.3M sucrose for 5 minutes and 2 minutes in nitrogen vapor. In all three methods the straws were thawed in air for 10 seconds and in water at 25ºC for 20 seconds and the embryos cultured in vitro for 72 hours to estimate blastocyst rate. To assess viability in vivo, frozen morulae as well as fresh embryos were transferred into recipients. The in vitro development rates with 0.5, 0.7; 1.0 and 1.2ºC/minute were, respectively, 72.3; 79.6; 76.5 and 84.8%. There was no significant difference among the cooling rates of 0.7; 1.0 and 1.2ºC/minute (p > 0.01). The in vitro survival rates of vitrification and quick-freezing (84.5 and 74.3%, respectively) were similar to the slow-freezing. In vivo, the implantation rate and number of fetuses from embryos frozen through slow-freezing at 1.2ºC/minute, vitrification and quick-freezing were not significantly different.

Este trabalho avaliou a eficácia do ultra-som no diagnóstico precoce de prenhez e nas avaliações das mortalidades embrionárias e fetais e dos sexos de fetos em dois grupos de vacas zebuínas. Os animais que não retornaram ao estro aos 21 dias da Inseminação Artificial (G1) ou aos 14 dias da Transferência de Embriões (G2B) foram examinados aos 25 dias de gestação para o diagnóstico precoce de prenhez, aos 45 dias para avaliação das perdas embrionárias entre 26 e 45 dias e aos 60 dias para avaliações das perdas fetais entre 45 e 60 dias e dos sexos de fetos. O Grupo G2A foi examinado por palpação retal aos 45 dias para diagnóstico de prenhez e aos 60 dias para avaliações das perdas fetais e dos sexos de fetos. As taxas de prenhez foram, respectivamente, 94,6%, 88,1% e 83,4% aos 25, 45 e 60 dias de gestação. As taxas de perdas embrionárias e fetais e de abortos foram, respectivamente, 4,6%, 4,7% e 1,2%. As taxas de acertos do diagnóstico precoce de gestação e dos sexos de fetos foram 88,5% e 90,7%, respectivamente. A ultra-sonografia mostrou-se eficaz no diagnóstico precoce de prenhez aos 25 dias, nas avaliações das perdas embrionárias aos 45 dias e fetais aos 60 dias e no diagnóstico do sexo de fetos a partir dos 60 dias de gestação. Os exames ultra-sonográficos não causaram perdas gestacionais nos animais Bos indicus ou Bos indicus X Bos taurus.

This study analysed the efficiency of early pregnancy diagnosis and embryo and fetal mortality and sexing evaluation by ultrasound in two groups of zebu cows submitted to artificial insemination (G1) or embryo transfer (G2 = G2A and G2B). The animals that not returned to estrus at 21th day after artificial insemination (G1) and 14th day after embryo transfer (G2B) were examinated at 25th day of gestation for early pregnancy diagnosis, at 45th day for embryo mortality between 25th and 45th and at 60th days for fetal mortality between 45th and 60th days and sexing evaluation. The animals from group G2A were examinated by retal palpation at 45th day for gestation diagnosis and at 60th day for fetal mortality between 45th and 60th days and sexing evaluation. The pregnancy rates were 94.6%, 88.1% and 83.4%, respectively, to 25, 45 and 60 days of pregnancy. The embryo and fetal mortality and abortion rates were, respectively, 4.6%, 4.7% and 1.2%. The accurate early pregnancy diagnosis and fetal sexing were, respectively, 88.5% and 90.7%. The ultrasound was efficient to evaluate early pregnancy (25th day), embryo mortality (25th to 45th days), fetal mortality (45th to 60th days) and sexing (60th day). The detection of early pregnancy can be applied to establish the stages of highest embryo and fetal mortality rates in zebu cattle. This study revealed that embryo and fetal mortality rates in Bos indicus were not caused by ultrasound examination.

O corpo lúteo (CL) é a glândula produtora de progesterona (P4), hormônio cuja secreção contínua é essencial para o início e a manutenção da gestação em fêmeas eqüinas, e, conseqüentemente, para a aplicabilidade de inúmeras biotécnicas de reprodução. Considerando-se a importância do CL para a manutenção de uma gestação normal e suas características anatomofisiológicas, objetivou-se determinar por ultra-sonografia (US) o tamanho e a morfoecogenicidade (ME) do CL em receptoras de embriões eqüinos desde a ovulação (D0) até nove dias após (D9), bem como os níveis plasmáticos de P4 produzida no mesmo período. Para tanto, 57 éguas receptoras de um programa de transferência de embriões foram examinadas diariamente por US transretal desde a primeira detecção dos sinais de estro até o D9. A cada exame, os CL foram mensurados e sua ME registrada segundo escore de 1 a 6 (1=anecóico; 6=hiperecóico). Amostras de sangue foram colhidas diariamente e a P4 dosada por radioimunoensaio. O diagnóstico de gestação foi realizado por US aos 13 e 25 dias após a ovulação. Houve uma tendência de os corpos lúteos apresentarem ME crescente (de 1 a 5) desde o dia da ovulação até o D9. Os níveis de P4 foram < 2,16 ng/ml até o D3, com conseqüente elevação e manutenção em níveis de diestro entre D4 e D9 (3,41 a 4,33 ng/ml). O tamanho luteínico não diferiu, com exceção das médias extremas durante o período (D2 = 31,54 mm versus D8 = 25,95mm; p < 0,05). Assim, o aumento da ME média dos CLs avaliados por US é acompanhado por aumento na concentração plasmática de P4 em receptoras de embriões, mas este evento parece não ser dependente do tamanho da glândula luteínica. Não existe diferença na ME, no tamanho dos corpos lúteos, nem nos níveis de P4 circulante do D0 ao D9 em receptoras de embriões eqüinos que se tornaram gestantes ou não após a transferência de embriões.

Corpus luteum (CL) synthesizes progesterone (P4), which has a major function in maintenance of pregnancy in equine females and also enables the application of biotechnologies of reproduction. Considering the importance of the CL and its anatomical and physiological features to achieve normal pregnancy, our aims were to determine the size and morphoechogenicity (ME), as well as plasma P4 concentrations of corpus luteum from recipient mares for nine days after ovulation (D0). Therefore, 57 recipient mares were examined daily by transrectal ultrasonography (US) from early signals of estrus to D9. CLs were measured and their ME classified according to a 1 to 6 scale (1=anechogenic; 6=hiperechogenic). Blood samples were collected daily and progesterone concentrations assessed by radioimmunoassay. Pregnancies were checked by US 13 and 25 days after ovulation. Corpus luteum echogenicity had a tendency to increase from D0 to D9. Progesterone concentrations were < 2,16 ng/ml until D3, but there was a significant elevation from D4 to D9 (3,41 to 4,33 ng/ml). There were no differences in CL size, except between D2 (31,54 mm) and D8 (25,95 mm); p < 0,05). Thus, an increase in mean luteal ME is accompanied by an increase in plasmatic P4 concentration, but this event seems independent of luteal size. There were no differences between ME, size and P4 levels from D0 to D9 in recipient mares that became pregnant or not after embryo transfer.

Os resultados das taxas de fertilidade e dos tamanhos das leitegadas foram analisados na granja de suínos da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo no Campus de Pirassununga, durante o período de 4 anos (1992 a 1995), com o objetivo de comparar a inseminação artificial (IA) e a cobertura natural (CN) em diferentes épocas do ano, procurando estudar as influências sazonais sobre os índices reprodutivos. Foram avaliadas 799 coberturas em fêmeas das raças Landrace (L), Large White (LW) e mestiças, sendo 539 de IA e 260 de CN. Reprodutores (L e LW) de comprovada fertilidade foram utilizados tanto para CN quanto para IA. As doses de sêmen apresentavam concentração mínima de 3 bilhões de espermatozóides em volume de 100 ml. As IA foram realizadas às 12 e às 24 horas após reflexo positivo de tolerância ao macho, enquanto as montas foram realizadas no momento e às 24 horas após o diagnóstico do cio. Os índices de fertilidade foram de 72,9% e 75,8% e o número de leitões nascidos de 12,4 e 12,1, respectivamente, para inseminação artificial e monta natural, não mostrando diferença significativa. A estação climática influenciou a taxa de parição (71,2%, 81,4%, 76,9% e 66,4%, para verão, outono, inverno e primavera, respectivamente; p < 0,05), mas não mostrou efeito sobre o tamanho da leitegada. Não houve influência do tipo de cobertura (IA ou CN) e da interação entre estação climática e tipo de cobertura sobre as taxas de parições e os tamanhos das leitegadas. As médias de temperatura máxima e mínima se correlacionaram negativamente com a taxa de parição.

The data of parturition rate and litter size from the herd of the Veterinary School of São Paulo University were analysed during a four years period (1992 to 1995) in order to compare the data from artificial insemination (IA) and natural mating (CN) in different seasons, trying to study the seasonal influences and define which of these methods would be better in order to reach adequate reproductive rates. Data from 799 breeding (539 IA and 260 CN) in Landrace (L), Large White (LW) females and the cross-breed from both were analysed. Boars (L and LW) with known fertility were used either for IA or for CN. The semen doses used had at least 3 billions spermatozoa in 100 ml. The inseminations were performed 12 and 24 hours after the positive back pressure test in response to the boar, and natural mating were performed at the moment of positive back pressure test and 24 hours later. The fertility rates were 72.9% and 75.8% and the litter size was 12.4 and 12.1, for artificial insemination and natural mating, respectively, which were not different. The season influenced the parturition rate (71.2%, 81.4%, 76.9% and 66.4%, for summer, autumn, winter and spring, respectively; p < 0.05) but not the litter size.

O objetivo deste trabalho foi avaliar as taxas de manifestação de sintomas de estro, de resposta superovulatória e de recuperação de embriões em 20 cabras da raça Moxotó em três tratamentos consecutivos, em intervalos de 56 dias. O ciclo estral das fêmeas foi sincronizado com esponjas vaginais contendo 60 mg de acetato de medroxiprogesterona (MGA) durante 11 dias e com 100 mig de cloprostenol (PGF2alfa ) administrado no nono dia. Neste dia, iniciou-se o tratamento superovulatório com 250 UI de FSH-p por cabra, fracionadas em oito doses decrescentes, com intervalo de 12 horas. A repetição do tratamento superovulatório com FSH-p diminuiu a taxa de manifestação de sintomas de estro, porém não afetou a taxa de ovulação e reduziu a taxa de regressão prematura de corpos lúteos. A taxa de recuperação de embriões foi influenciada pela ocorrência de regressão prematura de corpos lúteos e pela ação das repetidas colheitas de embriões sobre o genital. Não foi possível avaliar o efeito das repetidas superovulações sobre a taxa de recuperação de embriões.

The aim of the work was to evaluate the rates of estrous, superovulatory response and embryos recovery in Moxotó goats after three treatments with porcine FSH. Twenty goats were synchronised with medroxyprogesterone acetate sponges (60 mg for 11days) and cloprostenol (l00 mug on ninth day). The animals were superovulated with 250 IU of FSH-p in 8 decreasing doses at intervals of 12 hours. The repetition of superovulatory treatment decreased estrous symptoms, but didn’t affect the ovulation rate and decreased the regressed corpus luteum rate. The embryos recovery was affected by regressed corpus luteum and embryo collection technique.

Embriões de camundongos foram congelados em 10% de glicerol adicionado de várias concentrações de sacarose e/ou 0,1% de geléia real, nas velocidades de 0,3ºC ou 0,5ºC/minuto até -24ºC ou -32ºC e descongelados em água a 22ºC durante 20 segundos. A diluição dos crioprotetores foi realizada em três etapas e o cultivo dos embriões no meio de Whitten em estufa com 5% de CO2, 100% de umidade e 37ºC por 72 horas. O desenvolvimento in vitro até blastocisto variou entre 56,6% e 93,4%, mostrando que 10% de sacarose + 10% de glicerol foi eficiente na congelação. Blastocistos expandidos oriundos de embriões congelados até -24 ou -32ºC à velocidade de 0,3ºC/minuto em soluções contendo 10% de glicerol + 10% de sacarose; 10% de glicerol + 10% de sacarose + 0,1% de geléia real; 10% de glicerol + 0,1% de geléia real ou 10% de glicerol, transferidos para receptoras pseudoprenhes, apresentaram, respectivamente, taxas de fetos viáveis de 28,1% e 13,6%, 48,7% e 31,9%, 28,6% e 13,2%, 20,0% e 42,4%. Embriões congelados até -24ºC ou -32ºC a 0,5ºC/minuto nas soluções de 10% de glicerol + 10% de sacarose ou 10% de glicerol + 10% de sacarose + 0,1% de geléia real apresentaram, respectivamente, taxas de fetos viáveis de 29,0% e 15,3%, 48,8% e 32,0%. Adição de sacarose e de geléia real ao meio de congelação contendo 10% de glicerol proporcionou maiores taxas de fetos viáveis a 0,3ºC e 0,5ºC/minuto e imersão em nitrogênio líquido a -24ºC.

Compacted mouse morulae were frozen at 0.3ºC/min. or 0.5ºC/min. from -6ºC to -24ºC or -32ºC in 10% of glycerol plus different sucrose concentrations with or without 0.1% of honeybee royal jelly. Embryos were thawed in water bath at 22ºC for 20 seconds and cryoprotectant dilution was done in three steps. Embryos were cultured in Whitten’s medium for 24, 48 and 72 hours at 37ºC, 5% of CO2 and 100% of humidity. The in vitro development ranged from 56.6% to 100% after 72 hours. Expanded blastocysts were transferred to pseudopregnant recipients on the third day of the estrous cycle. Viable fetuses rates for embryos frozen to -24 or -32ºC at 0.3ºC/minute in 10% glycerol + 10% sucrose, 10% glycerol + 10% sucrose + 0.1% honeybee royal jelly, 10% glycerol + 0.1% honeybee royal jelly or 10% glycerol were respectively: 28.1% and 13.6%, 48.7% and 31.9%, 28.6% and 13.2%, 20.0% and 42.4%. Viable fetuses for embryos frozen to -24ºC or -32ºC at 0.5ºC/minute in 10% glycerol + 10% sucrose or 10% glycerol + 10% sucrose + 0.1% honeybee royal jelly were respectively 29.0% and 15.3%, 48.8% and 32.0%. We can conclude that addition of 10% sucrose to 10% glycerol was efficient for embryo freezing at 0.3 or 0.5ºC/minute and plunged in liquid nitrogen at -24ºC. The honeybee royal jelly addition provided higher viable fetuses rates when embryos were cooled at 0.3 or 0.5ºC/minute and plunged in liquid nitrogen at -24ºC.

Os efeitos das temperaturas de imersão em nitrogênio líquido e dos métodos de remoção dos crioprotetores foram avaliados em mórulas de camundongos congeladas em etilenoglicol (E), propilenoglicol (P) e glicerol (G). Os embriões foram equilibrados em E (1,5M), P (1,5M) ou G (1,4M) por 10 minutos e envasados em palhetas de 0,25 ml com crioprotetor nas três colunas (E1, P1 G1) ou PBS nas colunas das extremidades (E2, P2). As palhetas foram resfriadas a 0,5ºC/minuto até -25 ou -30ºC e imersas em nitrogênio líquido. A descongelação dos embriões foi feita em água a 22ºC por 20 segundos. O crioprotetor dos embriões congelados em glicerol (Gl) foi removido em 3 etapas, dos congelados em etilenoglicol e propilenoglicol com crioprotetor nas 3 colunas (El e Pl) removido diretamente em PBS e dos congelados em etilenoglicol e propilenoglicol com PBS nas colunas das extremidades (E2, P2), após mistura das três colunas dentro da palheta, em PBS. Não houve influência da temperatura de imersão sobre o desenvolvimento embrionário in vitro, observando maior taxa (p < 0,0001) para El (69,2%) que para E2 (60,3%), Gl (51,9%) e a combinação P1 e P2 (46,9%). Para o desenvolvimento in vivo, a taxa de fetos foi menor (p < 0,07) para o grupo E1-25 do que para o Controle; Gl-30ºC; El-30ºC e E2-25ºC. Pode-se concluir que in vitro o melhor crioprotetor foi o etilenoglicol com remoção direta em PBS e que in vivo o etilenoglicol e o glicerol foram semelhantes a -30ºC.

The effects of plunging temperature in liquid nitrogen and cryoprotectant dilution methods were evaluated for compacted mouse morulae frozen in 1.5 M ethylene-glycol (E), 1.5M propylene-glycol (P) or 1.4M glycerol (G). Morulae were equilibrated for 10 minutes in cryoprotectant solution and loaded into 0.25 ml straws with cryoprotectant solution in 3 columns (groups E1, P1, G1) or cryoprotectant in the center and PBS in the lateral columns (E2, P2). Straws were cooled at 0.5ºC/min to -25 or -30ºC and plunged into liquid nitrogen. Straws were thawed in water at 22ºC for 20 seconds. Cryoprotectant was diluted in 3 steps for group G1 and in one step for groups E1 and P1 (direct transfer to PBS + 10% FCS) and E2 and P2 (shaken to mix the 3 columns before transferring to PBS+ 10% FCS). Plunging temperature had no significant effect on the proportion of morulae developed to blastocysts in vitro; this proportion was higher (p < 0.0001) in E1 (69.2%) than in E2 (60.3%), G1 (51.9%) and combined for P1 and P2 (46.9%). In second experiment, the proportion of transferred morulae that developed to viable fetuses was lower (p < 0.07) for E1-25 than for E1-30, G1-30, E2-25 or unfrozen (control) embryos (8.7, 20.0, 20.0, 17.4 and 19.8%, respectively). In conclusion, the ethylene glycol diluted directly in PBS (E1) exhibit the highest rate of in vitro embryos development, but based on in vivo embryos development was more efficacious in plunging temperature at -30ºC (E1-30).

Foram utilizados ejaculados de 6 cães para comparar cinco diluidores no processo de congelação de sêmen. Cada ejaculado foi dividido em 5 partes e adicionadas aos diluidores tris-fructose-ácido cítrico, glicina, lactose, leite desnatado e tris-fructose-ácido cítrico. O sêmen foi diluído a 37°C sem adição de glicerol na proporção 1:1 (fração A) e refrigerado durante 60 minutos até atingir a temperatura de 5ºC, quando foi adicionada a fração dos diluidores contendo glicerol (fração B) na proporção 2:1, atingindo a concentração final de 4% de glicerol. O sêmen diluído permaneceu por 60 minutos em refrigeração para equilíbrio no glicerol, sendo envasado em palhetas de 0,5 ml, mantido por 30 minutos no vapor de nitrogênio e imerso e armazenado em nitrogênio líquido. Foram avaliados a motilidade progressiva retilínea, o vigor e os defeitos espermáticos antes da congelação e após a descongelação do sêmen em água a 37°C. Os resultados mostraram que os diluidores tris-fructose-ácido cítrico e glicina apresentaram as melhores médias de motilidade progressiva retilínea e de vigor espermático após a descongelação. A congelação aumentou a freqüência dos defeitos espermáticos maiores independente do diluidor.

Semen was collected from six stud dogs to compare five extenders in the semen freezing process. Each ejaculate was divided in five parts and added to tris-fructose-citric acid, glicine, lactose, skim milk and tris-fructose-citrate extenders. The semen was diluted at 37°C in extenders without glycerol, in the ratio 1:1 and cooled for 60 minutes to reach a 5°C temperature. Then, extenders with glycerol in the ratio of 2:1 were added to give the final prefreezing concentration of 4% of glycerol. The diluted semen with the cryoprotectant was maintained for a further 60 minutes in refrigeration to equilibrate the spermatozoa in the glycerol and packaged in 0.5 ml plastic straws. The straws were maintained for 30 minutes in vapor, plunged and stored in liquid nitrogen. Sperm morphology was evaluated before and after freezing, whereas progressive motility (%) and velocity of forward progression (0-5) were appraised in different periods of the freezing process. The extender tris-fructose-citric acid showed the best post thaw progressive motility and velocity of forward progression compared to the others extenders. Semen freezing increased major sperm morphological abnormalities, regardless of the extender.

A utilização de sêmen congelado tornou-se extremamente comum na prática da inseminação artificial em cães, estimulando a pesquisa de métodos de congelação e diluidores. Neste estudo foram avaliadas as propriedades criopreservativas do etileno glicol na concentração final de 5%, utilizado em 3 diferentes protocolos de congelação. No Método I, uma parte de sêmen foi adicionada a duas partes de tris-frutose-ácido cítrico, contendo 7,5% de etileno glicol e congelado sem prévia refrigeração. No Método II, uma parte de sêmen foi adicionada a duas partes de tris-frutose-ácido cítrico contendo 7,5% de etileno glicol e resfrigerado até 5ºC por 1 hora antes da congelação. No Método III, uma parte de sêmen foi adicionada a uma parte de tris-frutose-ácido cítrico sem etileno glicol e refrigerado até 5ºC por 1 hora, sendo em seguida adicionada uma parte de tris-frutose-ácido cítrico, previamente refrigerado até 5ºC, contendo 15% de etileno glicol, mantido a 5ºC por mais 1 hora e congelado. Para a congelação em cada método, o sêmen foi envasado em palhetas plásticas de 0,5 ml, colocadas em vapor de nitrogênio a 5 cm da coluna líquida por 20 minutos, mergulhadas no nitrogênio líquido e armazenadas. Todas as amostras foram descongeladas em banho-maria a 37ºC durante 30 segundos e imediatamente avaliadas. O Método III não apresentou decréscimo significante da motilidade retilínea progressiva após a descongelação e apresentou os melhores resultados para o vigor espermático, comparando-se aos demais métodos. Entretanto, os 3 métodos não apresentaram diferença significativa com relação aos defeitos espermáticos pós-descongelação. Os tipos de defeitos mais freqüentemente encontrados foram cabeça solta normal, cauda dobrada, fortemente dobrada e fortemente enrolada. Foi possível concluir que o tempo de equilíbrio maior no diluidor tris-frutose-ácido cítrico seguido pela diluição em etileno glicol antes da congelação parece produzir para os espermatozóides de cães a melhor motilidade retilínea progressiva e vigor após a descongelação.

The use of frozen semen has become increasingly popular in canine artificial insemination, stimulating research to improve freezing methods and extenders. In this study, was compared the final concentration of 5% ethylene glycol used in 3 equilibration protocols. In Method I, one part of semen was added to two parts of tris-fructose-citric acid with 7.5% ethylene glycol (Extender 2) and frozen without cooling. In Method II, one part of semen was added to two parts of tris-fructose-citric acid with 7.5% ethylene glycol (Extender 2) and cooled at 5ºC for 1 hour before freezing. In Method III, one part of semen was added to one part of tris-fructose-citric without ethylene glycol (Extender 1) and cooled at 5ºC for 1 hour. Just after this period, one part of 5ºC cooled tris-fructose-citric acid containing 15% ethylene glycol (Extender 3) was added to the previous extended semen, maintained at 5ºC for one additional hour and frozen. For freezing in each procedure semen was packaged in 0.5 ml plastic straws and placed for 20 minutes in vapor 5 cm above liquid nitrogen and then lowered into the liquid nitrogen and stored. All samples were thawed by immersion for 30 sec in a 37ºC water bath and immediately evaluated. Progressive motility was best after Method III (63%), which was not different from fresh semen (94%) but was better (p< 0.05) than after Method II (25%) or Method I (6%). Forward velocity was again best after Method III (2.9) comparable to fresh semen (4.6) and Method II (2.5), but better (p< 0.05) than Method I (1.7). Morphological abnormalities were lowest after Method III, but were not significantly different from Methods II or I. Most common abnormalities were detached heads and bent, hairpin and coiled tails. It was concluded that slow, step-wise equilibration in tris-fructose-citrate extender followed by extender with ethylene glycol before freezing seems to produce the best progressive motility and forward velocity in frozen-thawed canine spermatozoa.

Zigotos e embriões de 2 células de camundongos F1 (C57/DBA) foram cultivados (controle) e co-cultivados em suspensões de células epiteliais de ovidutos de camundongos (MOEC) e de bovinos (BOEC) até o estádio de blastocistos nos meios CZB, TCM199 e Ménézo B2. Os zigotos que atingiram os estádios de blastocistos expandido e eclodido no CZB foram 44 (38,26%) para o controle, 2 (1,89%) para as MOEC e 8 (6,72%) para as BOEC, sendo que o controle apresentou-se estatisticamente diferente (p<=0,05) em relação às MOEC e às BOEC. Os zigotos cultivados e co-cultivados nos meios TCM199 e B2 não clivaram além de 2 células. Os embriões de 2 células que desenvolveram até blastocistos no CZB foram 46 (43,80%) para o controle, 45 (38,79%) para as MOEC e 37 (29,60%) para as BOEC, sendo que o controle apresentou-se estatisticamente diferente (p<=0,05) em relação às BOEC. No TCM199, o total de blastocistos foi de 52 (48,15%) para o controle, 68 (39,08%) para as MOEC e 64 (48,49%) para as BOEC, não havendo diferença estatística (p>0,05) entre os três grupos. No B2, o total de blastocistos foi de 28 (24,78%) para o controle, 34 (28,10%) para as MOEC e 25 (23,81%) para as BOEC, não havendo diferença estatística (p>0,05) entre os três grupos. Concluiu-se que o bloqueio dos zigotos nos meios TCM199 e B2 pode estar relacionado à presença da glicose e que o oviduto não é espécie-específico quanto a sua capacidade em promover o desenvolvimento de embriões de camundongos.

Mouse embryos were cultured and co-cultured in mouse (MOEC) and bovine (BOEC) oviduct epithelial cells suspension. Embryos were co-cultured from one cell and two-cell stage to blastocyst stage. Cell culture (MOEC and BOEC) was made at a 100 µl drop under oil. Embryos were recovered 24-26 hours in the case of zygotes and 46-48 hours in the case of 2 cell embryos after hCG injection. Total embryos were randomly split into 3 groups: control (cultured), MOEC and BOEC (co-cultured) with CZB, TCM199 and B2 mediums. In CZB group, 44 zygotes (38.26%) from the control achieved blastocyst stage (expanded or hatched), being statistically different (p<=0.05) from MOEC (1.89%) and BOEC (6.72%). Co-culture with zygotes in TCM199 and B2 didn’t pass 2 cell block. Two cell embryos cultured in CZB achieved blastocyst stage at a rate of 43.80% for the control, 38.79% for MOEC and 29.60% for BOEC group. Statistical difference (p<=0.05) appears from the control with BOEC groups. In TCM 199 medium, total of blastocyst were 48.15% for the control, 39.08% for MOEC and 48.49% for the BOEC groups, having no statistical difference among groups. This study allowed concluding that zygote block in TCM199 and B2 medium may be related to the presence of glucose. And that mouse embryos development is not species-specific.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a influência do folículo dominante nas fases de crescimento, estática e de regressão sobre a resposta superovulatória em 18 ciclos estrais de 9 novilhas da raça Nelore. Avaliaram-se os ovários entre o dia 6 e o dia 10 do ciclo estral pela técnica de ultra-sonografia, medindo-se o diâmetro do maior folículo e contando-se o número de folículos subordinados. Os animais foram superovulados com 400 ou 500 UI de FSH/LH, iniciando-se no dia 10 do ciclo estral, em subdoses decrescentes, por 4 dias consecutivos. Aplicou-se PGF2alfa concomitante com a quinta subdose de FSH/LH e realizaram-se inseminações artificiais às l2 horas e às 24 horas após o início dos sintomas de estro. Os embriões foram colhidos no dia 6,5 após a primeira inseminação artificial, obtendo-se 3,00; 3,83 e 10,17 embriões, respectivamente, nas fases de crescimento, estática e regressão. Observaram-se melhores resultados quanto ao número de embriões quando o folículo dominante se encontrava em fase de regressão.

The aim of this study was to evaluate the influence of the dominant follicle during it’s growing, static and regression phases on the superovulatory response in 18 estral cycles of nelore heifers. The follicular development was monitored by ultrasound from Day 6 to Day 10 (Day 0=estrus) of the oestrus cycle, when the diameter of the largest follicle was measured and the number of subordinate follicles counted. The animals where superovulated with 400 or 500IU of FSH/LH twice daily for 4 days begining on day 10 of the oestrus cycle I was injected PGF2alpha concomitantly with the fifth dose of FSH/LH. Artificial insemination was done 12 and 24 hours after the begining of the estrus. Embryos were recovered on day 6.5 after the first insemination. If a dominant follicle was present before superovulation, it was observed subordinate follicles atretic and low response to superovulatory treatment. The best result of transferable and total embryos was observed when the dominant follicle was in regression phase (3.67 and 10.17) at the beginning of the superovulatory treatment.