RESUMO Com frequência, infecções virais são associadas a problemas da reprodução em rebanhos de bovinos de corte e leite de todo o mundo. Este estudo teve como objetivo avaliar variáveis de manejo que possam constituir fatores de risco da infecção por BoHV-1 e/ou por BVDV em rebanhos leiteiros com histórico de problemas da reprodução em vacas mestiças em manejo extensivo e sem histórico de vacinação prévia para o controle de IBR e BVD. Anticorpos neutralizantes anti-BoHV-1, anti-BVDV e para ambos os vírus simultaneamente foram identificados em 62,5% (165/264), 45,1% (119/264) e 31,4% (83/264), respectivamente, das amostras analisadas. Os fatores de risco associados à infecção por BoHV-1 foram rebanhos com número total de fêmeas superior a 100, presença de ordenha mecânica, não utilização de inseminação artificial na reprodução e a compra infrequente de animais. Para BVDV, os fatores de risco foram aptidão mista (leite/corte) do rebanho, presença de ordenha mecânica, ausência de quarentena para os animais recém-adquiridos, presença de piquete de parição e a não utilização de inseminação artificial. Para a infecção simultânea (BoHV-1/BVDV), a presença de ordenha mecânica aumentou o risco em 3,36 vezes, e o uso de inseminação artificial reduziu em 56% o risco de infecção nos rebanhos avaliados.

ABSTRACT Viral infections are frequently associated with reproductive problems in dairy and beef cattle worldwide. The aim of this study was to verify managerial practices that may constitute risk factors associated with infection by BoHV-1 and/or BVDV in dairy herds with a history of reproductive disease in extensively reared dairy cows without a previous history of vaccination against IBR and BVD. Neutralizing antibodies anti-BoHV-1, anti-BVDV or both were detected in 62.5% (165/264), 45.1% (119/264), and 31.4% (83/264), respectively, in the samples analyzed. The risk factors associated with infection by BoHV-1 were herds with more than 100 cows, the presence of mechanical milking, the non-utilization of artificial insemination, and the infrequent acquisition of animals. Risk factors associated with BVDV were dual-purpose herds (milk and beef), these include the utilization of mechanical milking, absence of quarantine for newly acquired animals, the presence of picket calving, and the absence of artificial insemination. For simultaneous infections by both viruses (BoHV-1 and BVDV) the use of mechanical milking increased the chance of infection 3.36-fold while the use of artificial insemination reduced the risk of infection by 56% in these herds.

RESUMO A meningoencefalite por herpesvírus bovino-5 (BoHV-5) é uma doença neurológica importante no rebanho bovino brasileiro. Este estudo tem por objetivo verificar a presença do DNA de BoHV-5 em bovinos diagnosticados com meningoencefalite na Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, entre os anos de 1980 e 2009. Foram revisados os arquivos do Serviço de Clínica de Grandes Animais e da Patologia Animal em busca dos dados clínicos e epidemiológicos de bovinos com sinais neurológicos. Excluídos os casos de raiva, foram encontrados 115 casos de bovinos com sinais neurológicos, que foram necropsiados. O exame histopatológico realizado nos tecidos encefálicos desses animais constatou lesões de meningoencefalite não supurativa em 28 animais. Destes, em 15 (54%) casos foi identificada a presença do DNA de BoHV-5 por meio de PCR realizada em amostras de tecido encefálico fixadas em formalina e incluídas em parafina (FFPE). O alvo da PCR foi um fragmento de 159 pb do gene da glicoproteína C do BoHV-5. O caso mais antigo identificado neste estudo foi de 1988. A PCR apresentou-se como boa ferramenta para o diagnóstico do DNA de BoHV-5 extraído de tecidos FFPE, possibilitando estudos retrospectivos e diagnóstico de amostras com mais de 20 anos de armazenamento.

ABSTRACT Meningoencephalitis caused by Bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) is an important neurological disease that affects Brazilian cattle herds. The present study investigated the presence of BoHV-5 DNA in cattle diagnosed with meningoencephalitis at Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia, UNESP - Univ Estadual Paulista from 1980 to 2009. The records obtained from the Large Animal Internal Medicine Service and the Animal Pathology Service were reviewed to identify clinical and epidemiological data from cattle with neurological signs. Excluding rabies cases, we found 115 cases of cattle with neurological signs that had been necropsied. Non-suppurative meningoencephalitis was diagnosed in 28 animals of the 115 initially selected based on histopathological examination of brain tissues. Of these 28 animals, 15 (54%) were positive for BoHV-5 DNA by polymerase chain reaction (PCR) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) brain samples. PCR target was 159-bp fragment from the BoHV-5 glycoprotein C gene. The oldest case identified in the present study was from 1988. PCR was a good tool for the diagnosis of BoHV-5 DNA extracted from FFPE tissues, allowing retrospective studies of samples stored for more than 20 years.

The diagnosis of bovine herpesvirus 5 (BoHV-5) encephalitis is confirmed after death by laboratory methods applied to brain fragments. Alternative methods to confirm ante-mortem diagnosis are important because the disease is not always lethal. The aim of this study was to investigate whether the presence of the virus genome in the cerebrospinal fluid (CSF) detected by polymerase chain reaction (PCR) might be admitted as a method for ante-mortem diagnosis. CSF samples were taken from 14 animals suffering from BoHV-5 encephalitis, diagnosed by characteristic histopathological lesions in the brain and by identification of the virus genome by PCR in different portions of the brain. Virus DNA was detected in the CSF of 21.42% (3/14) of the evaluated animals. Ante-mortem detection of the virus genome in the CSF showed low sensitivity to confirm the diagnosis. The diagnosis is confirmed by a positive result but a negative one does not discard the disease.

RESUMO A presença do ácido nucleico (RNA) do vírus da cinomose canina (CDV) foi avaliada por meio da amplificação parcial do gene N pela técnica RT-PCR realizada em urina de cães provenientes de Uberlândia, Minas Gerais, que apresentavam sinais clínicos sugestivos de cinomose. Das 33 amostras de urina avaliadas, o CDV foi identificado em 45,5%. Em cinco cães que morreram espontaneamente, além da excreção do CDV na urina, foram observadas alterações histopatológicas associadas à infecção por esse vírus. Análises estatísticas demonstraram que a idade, gênero, raça e o sistema orgânico comprometido dos cães avaliados não exerceram influência no diagnóstico da cinomose canina. Mioclonia e incoordenação motora foram as manifestações neurológicas que apresentaram frequência de ocorrência significativa (P<0,05). Uma associação direta foi observada entre a presença de ceratoconjuntivite e a identificação de virúria pelo CDV. Esses achados sugerem que a excreção do CDV pela urina em cães com sinais clínicos compatíveis com cinomose pode não ser relacionada com a idade do animal, e que animais sintomáticos podem apresentar manifestações clínicas atribuídas ao CDV, porém sem a caracterização de virúria por RT-PCR. Adicionalmente, análises filogenéticas sugerem que várias cepas de CDV podem estar circulando em populações caninas de áreas urbanas no Brasil.

This study investigated the occurrence of canine distemper virus (CDV) by evaluating the presence of viral RNA within urine samples of dogs from Uberlândia, MG, with clinical manifestations suggestive of infection by CDV by targeting the CDV N gene. Of the clinical samples collected ( n =33), CDV viruria was detected in 45.5%. Five dogs died spontaneously; all had characteristic CDV-associated histopathological alterations and demonstrated CDV viruria. Statistical analyses revealed that the age, gender, breed, or the organ system of the dog affected had no influence on the occurrence of canine distemper. Myoclonus and motor incoordination were the most significant neurological manifestations observed. A direct association was observed between keratoconjunctivitis and dogs with CDV viruria. These findings suggest that CDV viruria in symptomatic dogs might not be age related, and that symptomatic dogs can demonstrate clinical manifestations attributed to CDV without viruria identified by RT-PCR. Additionally, the results of the sequence identities analysed have suggested that all Brazilian wild-type strains of CDV currently identified are closely related and probably originated from the same lineage of CDV. Nevertheless, phylogenetic analyses suggest that there are different clusters of wild-type strains of CDV circulating within urban canine populations in Brazil.

Resumo:Sarcoides são tumores fibroblásticos, considerados os tumores de pele mais comuns em pele de equinos e que raramente apresentam regressão espontânea. Papilomavírus bovino (BPV) tipos 1 e 2 são relacionados com a patogenia do sarcoide e, provavelmente, o BPV tipo 13 (BPV13), recentemente descrito, também pode estar associado com a formação dessa lesão. Neste estudo, 20 amostras de lesões cutâneas, sendo 12 constituídas por tecidos frescos e 8 amostras de tecido fixado em formalina e embebido em parafina, provenientes de 15 cavalos foram utilizadas para a identificação do DNA de BPV. A análise histopatológica (HE) confirmou todas as lesões como sarcoide. Para a amplificação do DNA de papilomavírus (PV) foram realizadas três reações de PCR. Como triagem, os primers IFNR2/IDNT2 foram utilizados para amplificar um fragmento da ORF L1 do PV. O segundo par de primersutilizado é complementar a sequência dos genes E5 e L2 de BPVs 1, 2 e 13. O terceiro par de primers(FAP59/FAP64) utilizado tem o gene L1 como alvo. A primeira e a segunda PCRs permitiram amplificar produtos em todas as amostras avaliadas. Entretanto, na terceira reação, na qual foram utilizados os primers FAP, foi possível amplificar produtos com tamanho molecular esperado somente nas amostras constituídas por tecidos frescos. O sequenciamento de nucleotídeos e as análises filogenéticas realizadas nos fragmentos E5L2 resultaram na identificação de BPV1, 2 e 13 em 14 (70%), 2 (10%) e em 4 (20%) amostras de sarcoides, respectivamente. As amostras de sarcoides de um dos animais continha somente o DNA de BPV1. Entretanto, nas amostras provenientes do segundo cavalo foi possível identificar o DNA de três tipos de Deltapapillomavirus bovino (BPV1, 2 e 13) em lesões distintas. Este estudo ratifica a presença do DNA de BPV1, 2 e 13 em lesões de sarcoides em equinos, além de identificar três tipos de BPVs em um mesmo animal e descrever pela primeira vez no Brasil a presença de BPV1 e 2 nesse tipo de lesão.

Abstract:Sarcoids are fibroblastic lesions, which are considered as the most common skin tumors of horses; spontaneous regression rarely occurs. The bovine papillomavirus (BPV) types 1 and 2 may be involved in the pathogenesis of sarcoids, and probably the recently described BPV type (BPV13) might be associated with the pathogenesis of this lesion. This study characterized the DNA of BPVs in sarcoids from 15 horses from Brazil by analyzing 20 cutaneous lesions (12 recently collected; 8 from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissues). Histopathology confirmed the proliferative lesions as sarcoids. Three PCRs were performed to amplify papillomavirus (PV) DNA. For screening, the primers IFNR2/IDNT2 were used to amplify a fragment of the PV L1 ORF. The second primer set was complementary to a common sequence of the E5L2 genomic region of BPV1, 2, and 13. The third primer pair (FAP59/FAP64) targeted a fragment of the PVs L1 ORF. The screening and E5L2 PCRs yielded amplicons in all samples evaluated. The FAP amplicons identified BPV1, 2, and 13 only from fresh tissue samples. The phylogenetic analyses of E5L2 resulted in the identification of BPV1, 2, and 13 in 14 (70%), 2 (10%), and 4 (20%) sarcoids, respectively. Two horses demonstrated multiple lesions: the sarcoids of one of these contained only BPV1 DNA and those of the other contained three types of bovine Deltapapillomavirus (BPV1, 2, and 13). This study confirmed the presence of BPV1, 2, and 13 DNA in equine sarcoids. Moreover, these findings represent the first description of three types of BPV diagnosed in the same horse, as well as the first confirmation of BPV1 and 2 in horses from Brazil.

O papilomavírus oral canino (COPV), também denominado Papillomavirus canino tipo 1 (CPV1), tem a capacidade de induzir papilomas na mucosa da cavidade oral e também em pele de cães. A classificação dos tipos de papilomavírus (PV) é baseada na proteína L1 do capsídeo e na sequência de nucleotídeos que a codifica. Atualmente são descritos 14 tipos de CPV, no entanto, ainda faltam estudos moleculares relacionados à identificação dos tipos de CPV no Brasil. O objetivo deste estudo foi investigar a presença de PV em fragmentos de papilomas obtidos de quatro cães sem raça definida, provenientes de Londrina/PR, região sul do Brasil, e definir o tipo viral por meio da análise da sequência parcial de nucleotídeos do gene L1. Sete lesões cutâneas foram cirurgicamente removidas e processadas para a caracterização histopatológica e molecular. O exame histopatológico confirmou as lesões como papilomas. Foi realizada reação em cadeia de polimerase (PCR), utilizando os primers FAP59 FAP64 para a amplificação parcial do gene L1, seguida por análise das sequências dos produtos amplificados, que confirmou a presença do CPV1 em todas as amostras avaliadas. Este estudo representa a primeira identificação do DNA de CPV1 associado com papilomatose canina no Brasil.

Canine oral papillomavirus (COPV), also known as Canine Papillomavirus type 1 (CPV1), induces papillomas at the mucous membranes of the oral cavity and at the haired skin of dogs. The classification of Papillomavirus (PV) types is based on the L1 capsid protein and nucleotide sequence; so far, 14 CPV types have been described in several countries, but the molecular characterization of CPV in Brazil is lacking. This study investigated the presence of the PV in seven papillomas from four mixed breed dogs from Londrina/PR, Southern Brazil, by partial sequencing of the L1 gene. Seven exophytic cutaneous lesions were surgically removed and processed for histopathological and molecular characterization. Histopathology confirmed the lesions as viral papillomas due to typical histological features. Polymerase Chain Reaction (PCR) assay using the FAP59 and FAP64 primers targeted the L1 gene followed by sequence analysis of the amplicons identified CPV1 in all evaluated papilloma samples. This study represents the first description of CPV1 DNA associated with canine papillomatosis in Brazil.

This study describes the clinical, histopathological, and virological characterization of teat papillomatosis from Brazilian dairy cattle herds. Four types of bovine papillomavirus were identified (BPV6, 7, 9, and 10); one of these (BPV7) is being detected for the first time in Brazilian cattle.

A infecção pelo vírus da diarreia viral bovina (BVDV) foi avaliada em um rebanho bovino leiteiro de alta produção com histórico de problemas reprodutivos e de vacinação regular contra o BVDV. A identificação do vírus foi realizada por RT-PCR em soro sanguíneo e o perfil sorológico por vírus-neutralização. Inicialmente, 100% (n=692) dos animais do rebanho foram avaliados com relação à presença de infecção ativa pelo BVDV por meio da RT-PCR. Quatro meses após, todos os animais positivos (n=29) na primeira avaliação foram avaliados novamente pela RT-PCR, assim como todos os animais que nasceram (n=72) e os que apresentaram problemas reprodutivos (n=36) no intervalo entre a primeira e a segunda colheita de sangue. Os resultados finais do estudo possibilitaram identificar 27 animais transitoriamente infectados e três animais persistentemente infectados (PI). A sorologia, realizada apenas nos animais positivos na primeira avaliação pela RT-PCR e nas vacas que apresentaram problemas reprodutivos entre a primeira e a segunda RT-PCR, demonstrou grande flutuação nos títulos de anticorpos neutralizantes, além de soroconversão na maioria dos animais. Foram identificados aumentos nos títulos de anticorpos neutralizantes que variaram entre 3 e 8 log2, indicando infecção ativa no rebanho. A circulação viral no rebanho avaliado foi responsável pela expressão de sinais clínicos da esfera reprodutiva em animais com baixo título de anticorpos e consequente falha na proteção fetal. Os resultados demonstram que o controle da infecção pelo BVDV apenas por meio da vacinação regular em rebanhos com animais PI pode não ser eficaz na profilaxia dessa virose.

The profile of bovine viral diarrhea virus (BVDV) infection was studies in a high production dairy herd selected based on a history of reproductive failures and regular vaccination against BVDV. Virus identification was performed by RT-PCR and serological profile was determined by virus-neutralization (VN). Initially, 100% (n=692) of the animals in the herd were monitored for identification of an active infection by RT-PCR in sera. Four months later, all positive animals (n=29) were retested by RT-PCR, along with newly born animals (n=72), or those that had reproductive failures (n=36) in the interval. The RT-PCR assay identified 27 transiently infected animals and three persistently infected (PI). Serology performed only in positive animals in the first RT-PCR and in cows with reproductive failures between the first and second RT-PCR analysis, showed large variation VN antibody titers and seroconversion in most animals. Increases in VN titers were demonstrated, with variation between 3 and 8 log2, indicating virus circulation within the herd. Virus circulation in the vaccinated herd evaluated in this study was likely responsible for reproductive failures observed in cows with low VN titers and for fetal infections. These results demonstrate that control of BVDV infection by regular vaccination in dairy cattle herds with PI animals represents a great challenge for the prophylaxis of this infection.

O presente estudo relata a ocorrência de co-infecção entre o vírus da cinomose canina (CDV) e Toxoplama gondii em cães com sinais neurológicos. Amostras de soro e tecido nervoso (pos-mortem) de 21 cães, suspeitos de cinomose canina foram analisadas pela Reação de Imunofluorecência indireta (RIFI) para pesquisa de anticorpos contra T. gondii e N. caninum e por RT-PCR para CDV. Dezessete (80,9%) cães foram positivos para o CDV pela RT-PCR e 8 (38,1%) foram positivos para anticorpos contra T. gondii. Sete cães (41,1%) apresentaram-se positivos para ambos agentes, caracterizando processo de co-infecção. Somente 1 (4,7%) cão foi soropositivo para N. caninum (RIFI=100), entretanto este mesmo animal foi positivo para T. gondii (RIFI=4096) e para CDV (RT-PCR).

Group B rotaviruses (RV-B) were first identified in piglet feces, being later associated with diarrhea in humans, cattle, lambs, and rats. In human beings, the virus was only described in China, India, and Bangladesh, especially infecting adults. Only a few studies concerning molecular analysis of the RV-B NSP2 gene have been conducted, and porcine RV-B has not been characterized. In the present study, three porcine wild-type RV-B strains from piglet stool samples collected from Brazilian pig herds were used for analysis. PAGE results were inconclusive for those samples, but specific amplicons of the RV-B NSP2 gene (segment 8) were obtained in a semi-nested PCR assay. The three porcine RV-B strains showed the highest nucleotide identity with the human WH1 strain and the alignments with other published sequences resulted in three groups of strains divided according to host species. The group of human strains showed 92.4 to 99.7% nucleotide identity while the porcine strains of the Brazilian RV-B group showed 90.4 to 91.8% identity to each other. The identity of the Brazilian porcine RV-B strains with outer sequences consisting of group A and C rotaviruses was only 35.3 to 38.8%. A dendrogram was also constructed to group the strains into clusters according to host species: human, rat, and a distinct third cluster consisting exclusively of the Brazilian porcine RV-B strains. This is the first study of the porcine RV-B NSP2 gene that contributes to the partial characterization of this virus and demonstrates the relationship among RV-B strains from different host species.

A relação entre Helicobacter spp. e a presença de alterações histológicas na pars esophagea de suínos foi avaliada em 67 estômagos de animais em idade de abate. Para a identificação das helicobactérias, utilizou-se a técnica da PCR com primers específicos para o gênero Helicobacter. As alterações histológicas foram identificadas e classificadas como ulceração, erosão, degeneração epitelial, alongamento de papilas, hiperplasia, paraqueratose, intensidade do infiltrado inflamatório e aumento do número de folículos linfoides. As alterações mais frequentemente encontradas na pars esophagea foram a degeneração epitelial e o alongamento de papilas, observadas em 83,5% (n=56) das amostras analisadas. Em 77,5% (n=52) das amostras, observou-se paraqueratose e em 61,1% (n=41) hiperplasia epitelial. Quarenta e sete (70,1%) foram positivas na PCR para Helicobacter spp. Nessas amostras a erosão foi a lesão mais observada (40,2%), seguida de ulceração da mucosa (11,9%). Em 58,2% das amostras positivas na PCR, não foram observadas ulcerações de mucosa. Observou-se associação significativa (P=0,003) entre a presença de Helicobacter spp. e a degeneração epitelial da pars esophagea de suínos em idade de abate.

The association between histological findings of gastric mucosa in pigs at slaughtering age and the presence of Helicobacter spp., identified by PCR, assay was investigated. Stomachs from 67 pigs were examined. Histological changes of pars esophagea were identified and classified as gastric ulcers, erosion, degeneration, distortion of papils, hyperplasia, paraqueratosis, and number of lymphoid follicles. Microscopic analysis revealed the most frequent alteration: 83.5% (n= 56) stomachs with epithelial degeneration and distortion of papils. Paraqueratosis of pars esophagea was observed in 77.5% (n=52) of the samples and epithelial hyperplasia in 61% (n=41). Forty-seven (70.1%) pigs were positive to Helycobacter spp. by PCR. Erosion of pars esophagea and ulceration were the most frequent findings in Helicobacter spp. PCR-positive pigs, occurring, respectively, in 40.2% and 11.9%. The frequency of animals without ulceration and Helicobacter spp. PCR-positive was 58.2%. It was observed a significant association (P=0.003) between Helicobacter spp. and epithelial degeneration of gastric mucosa in pigs at slaughtering age.

Bovine coronavirus (BCoV) causes severe diarrhea in newborn calves, is associated with winter dysentery in adult cattle and respiratory infections in calves and feedlot cattle. The BCoV S protein plays a fundamental role in viral attachment and entry into the host cell, and is cleaved into two subunits termed S1 (amino terminal) and S2 (carboxy terminal). The present study describes a strategy for the sequencing of the BCoV S1 gene directly from fecal diarrheic specimens that were previously identified as BCoV positive by RT-PCR assay for N gene detection. A consensus sequence of 2681 nucleotides was obtained through direct sequencing of seven overlapping PCR fragments of the S gene. The samples did not undergo cell culture passage prior to PCR amplification and sequencing. The structural analysis was based on the genomic differences between Brazilian strains and other known BCoV from different geographical regions. The phylogenetic analysis of the entire S1 gene showed that the BCoV Brazilian strains were more distant from the Mebus strain (97.8% identity for nucleotides and 96.8% identity for amino acids) and more similar to the BCoV-ENT strain (98.7% for nucleotides and 98.7% for amino acids). Based on the phylogenetic analysis of the hypervariable region of the S1 subunit, these strains clustered with the American (BCoV-ENT, 182NS) and Canadian (BCQ20, BCQ2070, BCQ9, BCQ571, BCQ1523) calf diarrhea and the Canadian winter dysentery (BCQ7373, BCQ2590) strains, but clustered on a separate branch of the Korean and respiratory BCoV strains. The BCoV strains of the present study were not clustered in the same branch of previously published Brazilian strains (AY606193, AY606194). These data agree with the genealogical construction and suggest that at least two different BCoV strains are circulating in Brazil.

Utilizou-se a técnica da RT-PCR para a detecção da região 5' UTR do genoma do vírus da diarréia viral bovina (BVDV) em pools de soros sangüíneos provenientes de um rebanho, constituído por 226 animais, que apresentava distúrbios da reprodução. A partir das amostras individuais de soro e de acordo com a categoria dos animais e o número de animais por categoria foram formados 10 pools (A a J) de soros. A primeira avaliação revelou a amplificação de um produto com 290pb nas reações referentes aos grupos D (35 vacas) e H (25 bezerros lactentes) que, após o desmembramento em amostras individuais, resultou na identificação de 11 vacas lactantes e 12 bezerros em amamentação positivos. Para a identificação de animais persistentemente infectados (PI) entre os 23 positivos na primeira avaliação, realizou-se a segunda colheita de soros sangüíneos, três meses após. A RT-PCR das amostras individuais de soro revelou resultado positivo em cinco bezerros. Em dois, foi possível isolar o BVDV em cultivo de células MDBK. A especificidade das reações da RT-PCR foi confirmada pelo seqüenciamento dos produtos amplificados a partir do soro de uma vaca com infecção aguda, de um bezerro PI e das duas amostras do BVDV isoladas em cultivo celular. A utilização da RT-PCR em pools de soros sangüíneos demonstrou ser uma estratégia rápida de diagnóstico etiológico e de baixo custo tanto para a detecção de infecção aguda quanto de animais PI.

The 5' untranslated region of the bovine viral diarrhea virus (BVDV) genome was detected by RT-PCR assay in pools of blood sera samples collected from a cattle herd (n=226 animals) with reproductive failures. Based on the classes of animal and the number of animals per class, the individual blood serum samples were distributed in 10 sera pools (A to J). During the first evaluation a 290bp amplicon was amplified in reactions from groups D (35 cows) and H (25 sucking calves). The individual analysis of serum from groups D and H resulted in positive reactions in serum samples from 11 cows and 12 calves. For the identification of persistently infected (PI) animals, three months after the first examination, blood serum samples from 23 positive animals were reevaluated by RT-PCR, resulting in five positive calves. In two of these calves the BVDV was isolated in MDBK cell culture. The specificity of RT-PCR amplicons from one cow with acute infection, one PI calf, and two wild type BVDV strains isolated in cell culture were confirmed by nucleotide sequencing. The use of RT-PCR in pools of blood sera proved to be a quick and low cost strategy for the etiological diagnosis of the acute infection as well as to detect PI animals thereby favoring the implementation of control and prophylaxis measures.

Urine and leucocytes were comparatively evaluated as clinical samples for ante mortem detection of the canine distemper virus (CDV) by a reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) assay. One hundred and eighty eight dogs with clinical symptoms of distemper, were distributed in three groups. The group A was constituted of 93 dogs with systemic signs of distemper; the group B by 11 dogs with neurological signs, and the group C by 84 dogs that presented simultaneously systemic and neurological signs. In 66.5% (125/188) of the dogs was amplified an amplicon with 287 base pair of the CDV nucleoprotein gene. In 60.8% (76/125) of the animals the CDV was detected simultaneously in the urine and leucocytes, and in 39.2% (49/125) of the dogs just a type of clinical sample (urine: n=37; leucocytes: n=12) was positive. These results demonstrate that the different forms of clinical distemper disease can hinder the choice of only one type of clinical sample to carry out the ante mortem etiological diagnosis of CDV infection, and false-negative results can be generated.

Fragmentos com 721 pares de bases do gene da hemaglutinina (H) do vírus da cinomose canina (CDV), amplificados pela RT-PCR a partir de três estirpes vacinais (Snyder Hill, Onderstepoort e Rockborn) e de 27 amostras de campo, provenientes de cães com cinomose, foram clivados com as endonucleases Hinf I and Rsa I. A seleção das enzimas foi realizada por meio de análises in silico de seqüências do CDV depositadas em bases públicas de dados. Tanto as estirpes vacinais quanto as amostras selvagens do CDV apresentaram com a enzima Hinf I o mesmo perfil de restrição, confirmando a identidade do fragmento amplificado pela RT-PCR, uma vez que todas as estirpes com seqüências disponíveis (GenBank) têm sítios de restrição para essa enzima nas mesmas posições. O perfil de restrição das estirpes vacinais Snyder Hill e Onderstepoort, que diferem entre si, foi confirmado com a enzima Rsa I que também clivou a estirpe Rockborn nas mesmas posições que a estirpe Snyder Hill. Todas as 27 amostras de campo do CDV apresentaram com a enzima Rsa I o mesmo perfil de restrição, indicando conservar os mesmos sítios de restrição para essa enzima. O perfil das amostras de campo foi diferente daquele obtido nas três estirpes vacinais. Os perfis de restrição do gene que codifica a hemaglutinina do CDV, gerados pela enzima Rsa I, sugerem diferenças moleculares entre as estirpes vacinais e as selvagens circulantes na região norte do estado do Paraná e abrem a perspectiva da elaboração de análises moleculares comparativas mais complexas, como o seqüenciamento de todo o gene H, de estirpes do CDV identificadas em diferentes regiões brasileiras.

The restriction fragment length polymorphism (RFLP) assay of a 721 bp fragment from hemagglutinin (H) gene of canine distemper virus (CDV) amplified by RT-PCR was analyzed with Hinf I and Rsa I enzymes. Clinical samples from 27 dogs with natural canine distemper infection, and three vaccine (Snyder Hill, Onderstepoort and Rockborn) CDV strains were analyzed. All RT-PCR amplified product from CDV wild-type and vaccine-strains had the same RFLP pattern with Hinf I enzyme showing the amplicon specificity. The RFLP pattern for CDV vaccine-strains generated with Rsa I enzyme was the expected by in silico analysis. All 27 wild-type CDV strains present the same Rsa I enzyme RFLP pattern that was different from vaccine-strains pattern, suggesting molecular differences between vaccine-strains and wild-type of CDV from dogs population in North region of Paraná State/Brazil. These results open the perspectives of the accomplishment of comparative molecular analysis, such as sequencing of the whole gene H, of CDV wild-type strains identified in different Brazilian regions.