Avaliou-se a técnica de PCR como opção para reduzir o tempo de detecção de Listeria monocytogenes no leite. Para tanto, amostras de leite desnatado esterilizado e de leite cru integral - com baixa, média e alta contagem de microrganismos aeróbios mesófilos - foram inoculadas experimentalmente com diversas concentrações de L. monocytogenes. Os resultados da reação de PCR foram comparados com os da cultura da amostra empregando-se metodologia padronizada tradicional. Não se detectou L. monocytogenes pela reação de PCR quando esta foi realizada a partir do caldo de enriquecimento de Listeria (LEB) após 24 horas de incubação, nem no leite desnatado esterilizado, nem no leite cru integral. Após 48 horas de enriquecimento em LEB, a bactéria foi detectada por PCR nas amostras de leite desnatado esterilizado, com a sensibilidade de 1UFC/mL, mas não nas amostras de leite cru integral. Pela metodologia tradicional, a bactéria foi recuperada de todos os ensaios. Entretanto, nas amostras de leite cru com altas contagens de aeróbios mesófilos, a sensibilidade da metodologia tradicional foi reduzida (a partir de 7UFC/mL). Melhores resultados foram obtidos quando a reação de PCR foi feita utilizando-se DNA obtido diretamente da colônia suspeita em meio sólido (Oxford e Palcam). Foi possível substituir os testes fenotípicos de identificação de L. monocytogenes pela técnica de PCR reduzindo-se o tempo de identificação da bactéria de vários dias para algumas horas.

The polymerase chain reaction (PCR) was used to detect Listeria monocytogenes in inoculated milk samples after selective enrichment. Samples of sterile skim milk and raw whole milk (with low, intermediate, and high counts of aerobic mesophilic microorganisms) were inoculated with several concentrations of L. monocytogenes. The results of PCR assays were compared to the results of culturing the samples using a standardized traditional method for isolation of L. monocytogenes. The pathogen was detected by PCR in Listeria Enrichment Broth (LEB) after 48h-incubation (sensitivity of 1CFU/mL) but not after 24h-incubation from the samples prepared with sterile skim milk. L. monocytogenes was not detected by PCR in LEB after 24 and 48h-incubation from the samples prepared with raw whole milk. Using the traditional method, the pathogen was detected in all experiments. However, sensitivity decreased in raw whole milk with high counts of aerobic mesophilic microorganisms (up to 7CFU/mL). Best results were obtained when PCR was done to identify presumptive L. monocytogenes colonies directly from Palcam and Oxford media, after the enrichment step. This procedure allowed reducing to a few hours the period of several days usually needed to obtain the final identification of L. monocytogenes using phenotypic tests.

Padronizou-se um método de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex para detecção de Escherichia coli O157:H7 e avaliou-se a eficiência da PCR e de um método de cultivo convencional em placas na detecção desse patógeno experimentalmente adicionado em leite estéril e em leite cru com baixa contagem bacteriana total (média de 4,01 x 10³ UFC/ml) e com alta contagem bacteriana (média de 2,10 x 10(6) UFC/ml). Foram padronizadas duas reações de PCR com o uso dos primers: "A" (RfbF; RfbR e FLICh7F/FLICh7R) e "B" (SLT-IF/SLTIR e SLT-IIF/SLT-IIR). A detecção de E. coli O157:H7 (1UFC/ml) a partir do leite estéril e do leite cru com baixa contaminação bacteriana foi possível quando se utilizou o método de contagem em placas e a PCR. A sensibilidade dos dois métodos foi menor quando se testou o leite cru com alta contaminação microbiana, sendo o método convencional mais sensível. Os resultados indicam que a presença de outros microrganismos, em alta quantidade no leite, dificulta a detecção de E. coli O157:H7 pelos métodos utilizados.

This experiment was carried out in order to evaluate the effect of the raw milk bacterial count on the efficiency of a multiplex polymerase chain reaction and a conventional plate count method for detection of Escherichia coli O157:H7. This pathogen was experimentally inoculated into sterile milk, raw milk with low bacterial count (count mean of 4.01 x 10³ cfu/ml) and, raw milk with high bacterial count (mean 2.10 x 10(6) cfu/ml). Two protocols of PCR were standardized using primers "A" (Rfbf and Rfbr and FLICh7F/FLICh7R) and "B" (SLT-IF/SLTIR and SLT-IIF/SLT-IIR). Both conventional plate count and PCR methods were able to detect the presence of E. coli O157:H7 in either sterile milk or raw milk with low bacterial count initially inoculated with 1cfu of E. coli O157:H7 per ml. The sensibility of both methods for high-contaminated raw milk samples was lower, being the conventional approach more sensitive. These results indicate that high bacterial count in raw milk can affect E. coli O157:H7 detection.

Avaliaram-se a qualidade microbiológica do leite obtido mecanicamente e refrigerado durante 48 horas, em 24 rebanhos, e a associação entre a contaminação microbiana e os procedimentos de higienização dos equipamentos de ordenha e armazenamento do leite. Os procedimentos de higiene foram avaliados in loco com auxilio de questionários. Foram realizadas a contagem padrão em placas, a contagem de coliformes totais e a pesquisa de Staphylococcus aureus e Streptococcus agalactiae. No leite de 14 rebanhos, foram pesquisadas Salmonella spp. e Listeria monocytogenes. As médias geométricas da contagem padrão foram <1,0×10(6) UFC/ml em 20 rebanhos, e <7,5×10(5) UFC/ml em 19. Onze rebanhos apresentaram contagem média de <1,0×10(5) UFC/ml. Contagens médias de coliformes >10³ UFC/ml foram verificadas em sete rebanhos. S. aureus e S. agalactiae foram isolados em 22 e 12 dos 24 rebanhos, respectivamente, e não foram encontradas Salmonella spp. e L. monocytogenes. O uso de detergentes alcalino e ácido, mais o de sanitizante foi associado (P<0,05) à contagem padrão <1,0×10(5), e o emprego de apenas um ou de nenhum produto foi associado a contagens >5×10(5) UFC/ml.

The effect of bulk tank and milking machine cleaning procedures (determined from a questionnaire) on bacterial contamination of 48-hour refrigerated milk was examined in 24 herds. Milk samples were analyzed for standard plate count (SPC) and for total coliform, Staphylococcus aureus and Streptococcus agalactiae contamination. Milk samples from 14 herds were cultured for Salmonella and Listeria monocytogenes. Geometrical means of SPC were <1.0×10(6) UFC/ml in 20 herds, <7.5×10(5) UFC/ml in 19 herds and <1.0×10(5) UFC/ml in 11 herds. Geometrical means >10³ UFC/ml of total coliforms were observed in seven herds. S. aureus and S. agalactiae were found in 22 and 12 herds, respectively. Salmonella and L. monocytogenes were not found in any of the samples. The use of alkaline and acid detergents plus sanitizing was associated (P<0.05) with SPC <1.0×10(5), and the use of either alkoline or acid detergent or sanitizing or no chemical product was associated with SPC >5.0×10(5) UFC/ml.