Brucella spp. são bactérias gram-negativas, intracelulares facultativas que são patogênicas para muitas espécies de mamíferos causando a brucelose, uma zoonose difundida mundialmente. Por isso a busca de alternativas de controle mais eficientes se faz necessário como o desenvolvimento de novas cepas que possam ser testadas como potenciais imunógenos. Neste estudo realizou-se a deleção do gene virB10 da cepa S2308 de Brucella abortus gerando uma cepa knockout provavelmente incapaz de produzir a proteína nativa correspondente. O gene virB10 faz parte de um operon que codifica para um sistema de secreção do tipo IV, essencial para a sobrevivência intracelular e multiplicação da bactéria em células hospedeiras. A deleção foi realizada pela construção do plasmídeo suicida pBlue:virB10:kan e eletroporação deste em células eletrocompetentes de B. abortus S2308, ocorrendo a troca do gene selvagem pelo gene interrompido, com o gene de resistência a canamicina, por recombinação homóloga dupla. Camundongos BALB/c foram inoculados com as cepas S19, RB-51, ΔvirB10 de B. abortus e B. abortus S2308 selvagem; os resultados demonstraram que camundongos BALB/c inoculados com S19 e camundongos BALB/c inoculados com S2308 apresentaram queda mais rápida de linha de tendência, quando comparadas aos demais grupos, para recuperação bacteriana (RB) e peso esplênico (PE) respectivamente. Os grupos que receberam ΔvirB10 S2308 de B. abortus e RB-51 demonstraram comportamento semelhante para ambas as características. Na sexta semana após a inoculação, os resultados para RB (log de UFC ± desvio padrão) e PE (peso esplênico ± desvio padrão), respectivamente, mostraram: grupos inoculados com as cepas S2308 (4,44±1,97 e 0,44±0,11), S19 (1,83±2,54 e 0,31±0,04), RB-51 (0,00±0,00 e 0,20±0,01) e ΔvirB10 S2308 (1,43±1,25 e 0,19±0,03). Considerado o clearance bacteriano, todos os grupos diferiram estatisticamente do grupo que recebeu S2308 (p<0,0001), o grupo inoculado com ΔvirB10 S2308 de B. abortus foi semelhante ao grupo S19 (p=0,4302) e diferente do grupo RB-51 (p=0,0063). A avaliação da persistência revelou que o gene virB10 é essencial para a manutenção da virulência da bactéria. Os resultados obtidos possibilitarão que outras pesquisas sejam realizadas avaliando o potencial imunogênico desta cepa mutante.

Brucella spp. are intracellular facultative gram-negative bacteria which are pathogenic for many species of mammals, causing brucellosis, a worldwide spread zoonosis. Therefore the search for more efficient alternatives of control, as the development of new potential immunogens is necessary. In this study, we knockouted virB10 from Brucella abortus S2308 strain, generating a mutant strain probably incapable to produce the corresponding native protein. The gene virB10 is part of an operon that codifies for type IV secretion system, which is essential for the intracellular survival and multiplication of the bacteria in host cells. The knockout was carried through by the construction of the suicidal plasmid pBlue: virB10: kan and eletroporation in eletrocompetent cells of B. abortus S2308, leading to the exchange of the wild gene for the interrupted gene, containing the gene of resistance to kanamycin, for double homologous recombination. BALB/c mice were inoculated with S19, RB-51, ΔvirB10 strains of B. abortus and S2308 wild strain; the results demonstrated that the BALB/c mice inoculated with S19 and BALB/c mice inoculated with S2308 presented faster fall of trend line, when compared with the too much groups, for bacterial recovery (BR) and esplenic weight (EW) respectively. The groups that received ΔvirB10 S2308 B. abortus and RB-51 demonstrated similar behavior for both the characteristics. In the sixth week postinoculation, the results for BR (log UFC ± standart deviations) and EW (esplenic weight ± standart deviations), respectively, showed: groups inoculated with strains S2308 (4,44±1,97 and 0,44±0,11), S19 (1,83±2,54 and 0,31±0,04), RB-51 (0,00±0,00 and 0,20±0,01) and ΔvirB10 S2308 (1,43±1,25 and 0,19±0,03). Considered the bacterial clearance, all the groups differed statistical from the group that received S2308 (p<0,0001), the group inoculated with ΔvirB10 S2308 B. abortus was similar to the S19 group (p=0,4302) and different of group RB-51 (p=0,0063). The evaluation of the persistence of the strains showed that virB10 is essential for the maintenance of the virulence. These results support other studies concerning the immunogenic potential of this mutant strain.

No presente trabalho, foi estudada a extração de substâncias húmicas (SH) de horizontes A de dois solos do Rio Grande do Sul (Latossolo Roxo (LR), e Brunizém vértico (B)) e de um lodo orgânico (LO), oriundo da fabricação de celulose, empregando-se dois métodos: (1) as SH foram extraídas com solução de NaOH 0,5 mol L-1, após tratamento prévio com HCl 0,5 mol L-1; (2) foi introduzida a extração com solução de pirofosfato de sódio 0,15 mol L-1 (pH 7) antes da etapa alcalina. Em cada etapa, os teores de SH, de ácidos fúlvicos (AF) e de ácidos húmicos (AH) foram determinados por métodos espectroscópicos e gravimétricos e, no método 2, os teores de Fe, Al, Si e Ca foram medidos nos extratos por absorção atômica. A composição elementar de ácidos húmicos foi determinada, e sua estrutura e características químicas foram avaliadas a partir de razões C/N, (atômicas) H/C e O/C e a partir de dados de espectroscopia Ultravioleta/Visível (UV/Vis). No LR, o método 1 extraiu maior quantidade de SH, enquanto, no método 2, a etapa com pirofosfato extraiu apenas AF. Em contrapartida, no solo B, o método 2 foi mais eficiente, verificando-se maior rendimento na etapa com pirofosfato. A partir desses resultados, infere-se que as SH, no LR, interagem principalmente por meio de reação de trocas de ligantes e de pontes de hidrogênio e, no solo B, a interação por meio de pontes de cátions é um mecanismo importante. Os AH extraídos com NaOH apresentaram valores mais elevados para a razão H/C e valores inferiores para a razão O/C do que os extraídos com pirofosfato, indicando que o extrator neutro solubilizou SH de caráter aromático e grau de oxigenação superiores.

The extraction of humic substances (HS) from A-horizons of two soils from Rio Grande do Sul (Oxisol, LR, and Mollisol, BZ) and from an organic sludge (LO) was investigated, employing two methods: (1) the HS were extracted with 0.5 mol L-1 NaOH, after treating the sample with 0.5 mol L-1 HCl; (2) the extraction with 0.15 mol L-1 sodium pyrophosphate solution (pH 7) was introduced before the alkaline and after the acid treatments. In each step, the contents of HS, fulvic acids (FA) and humic acids (HA) were determined by spectroscopic and gravimetric methods, and the contents of co-extracted Fe, Al, Si and Ca in the extracts of method 2 were measured by atomic absorption. The elemental composition of HA was determined and their chemical structure and characteristics were evaluated from the C/N, H/C and O/C ratios and from UV/Vis spectroscopy data. In the Oxisol, method 1 extracted a greater amount of HS, and in method 2 the pyrophosphate step extracted only AF. On the other hand, method 2 was more efficient in the Mollisol, and the greatest yield was obtained in the pyrophosphate step. These results suggest that in the Oxisol, the HS interact mainly through ligand exchange reactions and hydrogen bonding, while in the Mollisol, cation bridges are also an important mechanism. The NaOH-extracted HA showed higher H/C and lower O/C ratios than the pyrophosphate-extracted ones, indicating that the neutral solution solubilized HS with higher aromatic character and oxygenation grade.