Abstract The objective of this study was to identify Eimeria spp. in alternative poultry production systems (APPS) in the State of São Paulo, Brazil. Fecal samples (168) and DNA extracted from fecal samples obtained in APPS located in different Municipalities in the State of São Paulo (93) were examined by microscopy or genera-specific PCR (ITS-1 locus). Samples positive for Eimeria spp. were examined using Eimeria lata, Eimeria nagambie, and Eimeria zaria species-specific PCR protocols (ITS-2 locus) and another E. lata-specific PCR (candidate IMP1 genomic locus) followed by molecular cloning (E. lata and E. zaria ITS-2 amplicons) and genetic sequencing. All positive DNA samples were also submitted to genera-specific nested PCR (18S rRNA gene) followed by next-generation sequencing to identify Eimeria spp. Eimeria nagambie, E. zaria, and Eimeria sp. were identified by ITS2-targeted species-specific PCRs and genetic sequencing. Next-generation sequencing identified, in order of prevalence: E. nagambie; Eimeria acervulina; Eimeria mivati; Eimeria praecox; Eimeria brunetti; Eimeria mitis; Eimeria sp.; Eimeria maxima; E. zaria, and Eimeria necatrix/tenella. Our results confirmed, for the first time in Brazil, the identification of E. nagambie, E. zaria, and Eimeria spp. ITS-2 and 18S rRNA gene sequences not yet described in Brazil.

Resumo O objetivo deste trabalho foi identificar Eimeria spp. em galinhas domésticas criadas em sistemas de criação alternativos (SCA). Foram utilizadas 93 amostras de DNA e 168 amostras de fezes de galinhas provenientes de SCA, localizados em 17 municípios do estado de São Paulo. As amostras foram examinadas por microscopia ou PCR gênero-específica (locus ITS-1); aquelas positivas foram examinadas por PCRs espécie-específicas para Eimeria lata, Eimeria nagambie e Eimeria zaria (locus ITS-2), seguidas de clonagem (E. lata e E. zaria) e sequenciamento genético, e por outro protocolo de PCR específico para E. lata (locus IMP1). Adicionalmente, as mesmas amostras foram submetidas à nested PCR gênero-específica (gene 18S rRNA), seguida de sequenciamento de nova geração para identificação de Eimeria spp. Eimeria nagambie, E. zaria e Eimeria sp. foram identificadas pela PCR espécie-específica e sequenciamento genético. O sequenciamento de nova geração identificou, em ordem de prevalência: E. nagambie, Eimeria acervulina, Eimeria mivati, Eimeria praecox, Eimeria brunetti, Eimeria mitis, Eimeria sp., Eimeria maxima, E. zaria e Eimeria necatrix/tenella. Os resultados observados confirmaram, pela primeira vez no Brasil, a identificação de E. nagambie, E. zaria e de sequências de Eimeria spp. ainda não descritas no Brasil, referentes aos genes ITS-2 e 18S rRNA.

Resumo O objetivo deste trabalho foi validar um protocolo de nested PCR em tempo real em um tubo (nPCR-TR-1T) seguida de sequenciamento genético para detectar e caracterizar as espécies e genótipos de Cryptosporidium em aves. Um total de 443 amostras de DNA genômico, extraído de amostras fecais de aves, foi analisado pela nPCR-TR-1T e pela nested PCR convencional. Pela nPCR-TR-1T, foi observada positividade para Cryptosporidium spp. de 20,3% (90/443), em contraste com a nested PCR convencional, que apresentou positividade de 8,1% (36/443). O teste de sensibilidade analítica mostrou que a nPCR-TR-1T detecta aproximadamente 0,5 oocisto (2 esporozoítos) por reação. A avaliação da especificidade analítica não revelou amplificação de microrganismos que comumente apresentam amplificação inespecífica com primers utilizados para o diagnóstico de Cryptosporidium spp. O cálculo da repetibilidade evidenciou o mesmo resultado em 27 de 30 amostras (90%). Em relação à reprodutibilidade da nPCR-TR-1T, foi observado o mesmo resultado em 80% (24/30) das amostras examinadas. Foi possível realizar o sequenciamento em todas as 90 amostras amplificadas pela nPCR-TR-1T, com identificação de C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi e Cryptosporidium genótipo I em aves. O sequenciamento dos fragmentos amplificados pela nested PCR convencional foi possível em 10/36 (27,8%) das amostras positivas.

Abstract The aim of this study was to validate a one-tube nested real-time PCR assay followed by genetic sequencing to detect and identify Cryptosporidium species and genotypes in birds. A total of 443 genomic DNA extracted from avian fecal samples were analyzed by one-tube nested real-time PCR and conventional nested PCR. By one-tube nested real-time PCR, 90/443 (20.3%) samples were positive for Cryptosporidium spp. In contrast, 36/443 (8.1%) samples were positive for Cryptosporidium spp. by conventional nested PCR. The analytical sensitivity test showed that one-tube nested real-time PCR detects approximately 0.5 oocyst (2 sporozoites) per reaction. An evaluation of analytical specificity did not reveal amplification of microorganisms that commonly present nonspecific amplification with primers used for the diagnosis of Cryptosporidium spp. The repeatability analysis showed the same result in 27 out of 30 samples (90%). As for the reproducibility of one-tube nested real-time PCR, 24 of the 30 samples examined (80%) showed the same result. All the 90 samples amplified by one-tube real-time nested PCR were successfully sequenced, leading to the identification of C. baileyi, C. galli, C. meleagridis, C. proventriculi, and Cryptosporidium avian genotype I. Genetic sequencing of conventional nested PCR amplicons was successful in 10/36 (27.8%) of positive samples.

Resumo Amostras de solo colhidas em escolas municipais (ensino público/EMEI e privado/EPEI), clubes (CLB), praças públicas (PP), condomínios residenciais (CND) e de fezes de animais do Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) do município de Votuporanga/SP, foram submetidas ao método Baermann para detecção de larvas de helmintos zoonóticos. Foram determinadas as taxas de prevalência dos nematódeos identificados, e os resultados confrontados pelos testes Exato de Fisher e Qui-quadrado. Atendimentos de casos de larvas migrans na população foram levantados em entrevistas realizadas em Unidades de Saúde da Família e em planos de saúde privados. Todos os locais apresentaram positividade para Ancylostoma spp. e, com exceção de EPEIs e de fezes caninas, para Strongyloides spp. Prevalência de Ancylostoma spp. foi verificada em amostras de CNDs (87,50%), EMEIs (74,29%), CLBs (63,64%), PPs (61,76%) e em fezes de cães e gatos do CCZ (64,29% e 42,86%, respectivamente). As prevalências de Strongyloides spp. variaram de 14,29% (gatos/CCZ) a 41,18% (PP). Atendimentos de casos de larva migrans cutânea foram relatados nas entrevistas. Portanto, ressalta-se o risco de frequentadores de áreas de lazer do município, especialmente crianças, de adquirirem infecção por larvas de helmintos, indicando a necessidade da elaboração de propostas de políticas voltadas ao controle dessa importante zoonose.

Abstract Soil samples collected near municipal schools (public/EMEI and private/EPEI schools), clubs (CLB), public squares (PS) and residential condominiums (CND) and samples of animal faeces from the Zoonosis Control Centre (CCZ) of the municipality of Votuporanga/SP were analysed using the Baermann method for the detection of zoonotic helminth larvae. The prevalence rates of the nematode genera identified were determined, and the results were compared using Fisher’s exact and chi-square frequency tests. Information about cases of larvae migrans in the population were collected from the Family Health Units and the private health plans. All sites were positive for Ancylostoma spp. and, with the exception of EPEIs and dog faeces, for Strongyloides spp. The prevalence of Ancylostoma spp. was 87.5% for CND samples, 74.29% for EMIEs, 63.64% for CLB, 61.76% for PS and 64.29% for dog’s and 42.86% for cats at CCZ. The prevalence of Strongyloides spp. ranged from 14.29% (cats/CCZ) to 41.18% (PS). Cases of cutaneous larva migrans were reported during interviews. Thus, from the public health perspective, the risk of individuals that frequent recreational areas in the municipality, especially children, to be infected by helminth larvae is noteworthy, indicating the need to develop policies aimed at controlling this important zoonosis.

RESUMO: O diagnóstico específico e a avaliação da intensidade da infecção helmíntica em aves são fundamentais em estudos de eficácia e determinação de doses de medicamentos direcionados ao seu controle. O presente trabalho avaliou a aplicação e adaptação da metodologia de Mello e Campos, descrita originalmente para diagnóstico parasitológico em cães, na recuperação de escólices de cestódeos parasitos de aves domésticas (Gallus domesticus ). Foram empregadas 52 aves naturalmente infectadas e oriundas de produções rurais, as quais foram submetidas à necropsia parasitológica, adaptando-se a metodologia Mello e Campos. O método consistiu na realização de quatro etapas: conteúdo, imersão, raspado e avaliação. O número de escólices recuperadas por ave variou de 1 a 4.345, e o maior número de escólices foi recuperado do material oriundo da etapa de imersão. As espécies de cestódeos identificadas foram Amoebotaenia cuneata , Choanotaenia infundibulum , Hymenolepis sp., Raillietina tetragona , Raillietina echinobothrida e Raillietina cesticillus . Os resultados foram avaliados estatisticamente, concluindo-se que a metodologia adotada é eficaz para a recuperação de cestódeos de aves, uma vez que possui a etapa de imersão, que permite a recuperação mais eficiente de escólices.

ABSTRACT: The specific diagnosis and evaluation of the intensity of avian helminth infections are essential for efficacy studies and the determination of drug doses targeted to their control. This study evaluated the Mello and Campos method, originally described for parasitological diagnosis in dogs, in the recovery of scolices from cestode parasites of poultry (Gallus domesticus ). A total of 52 naturally infected birds obtained from farms underwent parasitological necropsy using the Mello and Campos method. The method consisted of four steps: content, soaking, scraping and evaluation. The number of scolices recovered per bird ranged from 1 to 4,345, and the highest number of scolices was recovered from material derived from the soaking step. The cestodes species diagnosed were Amoebotaenia cuneata , Choanotaenia infundibulum , Hymenolepis sp., Raillietina tetragona , Raillietina echinobothrida and Raillietina cesticillus . The Mello and Campos method, originally used to test for helminths in dogs, was effective in avian cestode testing because it includes a soaking step, which enables a more efficient recovery of scolices.