The species Gluconacetobacterdiazotrophicus, Herbaspirillum seropedicae and H. rubrisubalbicans are endophytic N2-fixing [diazotrophic] bacteria which colonise not only roots, but also the aerial tissue of sugar cane. However, the technique most commonly used to quantify the populations of these microbes in plants is by culturing serial dilutions of macerates of plant tissues in N free semi-solid media which are only semi-selective for the species/genera [the Most Probable Number (MPN) Technique] and each culture must be further subjected to several tests to identify the isolates at the species level. The use of species-specific polyclonal antibodies with the indirect ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) can be an alternative which is rapid and specific to quantify these populations of bacteria. This study was performed to investigate the viability of adapting the indirect ELISA technique to quantify individually the populations of these three species of diazotroph within the root and shoot tissues of sugarcane. The results showed that species-specific polyclonal antibodies could be obtained by purifying sera in protein-A columns which removed non-specific immuno-globulins. It was possible to quantify the three bacterial species in the Brazilian sugarcane variety SP 70-1143 in numbers above 10(5) cells per g fresh weight in roots, rhizomes and leaves. The numbers of the different bacterial species evaluated using the ELISA technique were found to be higher than when the same populations were evaluated using the MPN technique, reaching 1400 times greater for G. diazotrophicus and 225 times greater for Herbaspirillum spp. These results constitute the first quantification of Herbaspirillum using immunological techniques.

Além do fornecimento direto de nutrientes por meio da mineralização da matéria orgânica ou pela fixação biológica de N2, as substâncias húmicas e as bactérias diazotróficas endofíticas podem afetar diretamente o metabolismo vegetal, modificando o padrão de crescimento e desenvolvimento das plantas. O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito do uso em conjunto de ácidos húmicos (AH) e Herbaspirilum seropedicae, uma bactéria endofítica fixadora de N2, sobre o crescimento radicular de microtoletes de cana-de-açúcar do cultivar RB 72 454 tratados termicamente ou não. Após o tratamento térmico, os microtoletes foram imersos por 12 h em água (controle), numa solução que continha 20 mg L-1 de C de AH isolados de vermicomposto, H. seropedicae estirpe HRC 54 na concentração de 10(8) mL-1 células e o uso em conjunto de AH + H. seropedicae. Foi observada a promoção significativa do crescimento radicular, com incrementos que variaram de 60 a 118 % no comprimento e de 33 até 233 % na área radicular dos tratamentos em relação às plantas-controle, com efeitos mais pronunciados em plantas tratadas termicamente. Na mesma direção, o efeito positivo da inoculação bacteriana e dos ácidos húmicos sobre a biomassa da parte aérea e das raízes foi significativo em relação ao controle apenas em toletes tratados termicamente. Para toletes não tratados, a inoculação não produziu efeitos significativos, apenas no caso da aplicação isolada de ácidos húmicos. O uso em conjunto ou isolado de AH e bactérias diazotróficas endofíticas não alterou significativamente o tamanho populacional das bactérias no tecido radicular em toletes que não receberam termoterapia. No caso de toletes tratados termicamente, a inoculação, combinada ou não com ácidos húmicos, alterou o tamanho da população das bactérias nas raízes. A análise conjunta dos dados evidencia a importância da termoterapia na expressão dos efeitos benéficos da inoculação de estirpes selecionadas de H. seropedicae, já para ácidos húmicos, as respostas positivas independem da termoterapia. A promoção do crescimento radicular por AH e a fixação biológica de N2 podem representar uma estratégia inovadora para produção sustentada em sistemas agrícolas.

Besides the direct nutritional effect of mineralization of organic matter or by biological nitrogen fixation activity, the humic substances and endophytic diazotrophic bacteria can directly influence plant metabolism, modifying plant growth and development patterns. The purpose of this study was to evaluate the effect of the combined use of humic acid (HA) and Herbaspirillum seropedicae, an endophytic nitrogen-fixing bacteria, on the root growth of seed pieces - heat-treated or not - of the sugarcane variety RB 72 454. After hot water treatment, the cane cuttings were immersed for 12 hours as follows: in water (control plant), in HA solution (20 mg L-1 of C) from vermicompost, in bacterial inoculant of H. seropedicae, strain HRC54 (10(8) cells mL-1), and in a combination of bacteria and HA. Root growth was improved by 60 to 118 % in length and from 33 % to 233 % in surface area on sugarcane plant treatments compared to control, with more pronounced effect in plants under heat treatment. Likewise, the positive effect of the combinded treatment (bacteria inoculation and humic acid) on shoot and root biomass was significant compared to the control with heat-treated cuts. For non-heated seed pieces, bacteria inoculation did not result in a positive plant growth effect, but only in the presence of humic acid. The combined or isolated use of both HA and bacteria did not significantly modify the bacteria population in the root tissue of heat-untreated sugarcane. For heat-treated cuts, bacteria inoculation, combined or not with HA, increased the size of diazotrophic bacteria population on roots. The results highlight the importance of thermotherapy to increase the positive effect of the selected bacteria strain of H. seropedicae. In the case of HA application, plant growth stimulation was not related to thermotherapy. The plant root growth promoting effect induced by both HA and the inoculation of selected nitrogen-fixing bacteria strain could represent an innovative approach to a sustainable sugarcane crop production.

A interação entre plântulas de cana-de-açúcar e H. seropedicae foi investigada pelo uso da técnica de congelamento por alta pressão seguida de criosubstituição. Observações microscópicas evidenciaram diferenças marcantes entre esta técnica e preparações convencionais, especialmente relacionadas a ultraestrutura da bactéria e às estruturas envolvidas na adesão à superfície da parede celular da planta hospedeira.

The interaction between sugar cane plantlets and H. seropedicae was investigated using High Pressure Freezing followed by Freeze Substitution. Microscopical observation showed consistent differences between this approaches when compared with the conventional preparation, specially related to appearance of the bacteria cell and the endophytic attachment to the host cell wall.

O objetivo deste trabalho foi avaliar a localização e o número de bactérias endofíticas em quatro genótipos de cana-de-açúcar e investigar sobre a possível existência de correlação com os resultados apresentados em trabalhos de quantificação da fixação biológica de nitrogênio (FBN). Fez-se um levantamento das bactérias diazotróficas presentes, e quantificou-se a população de Herbaspirillum spp. e Acetobacter diazotrophicus, em genótipos de cana-de-açúcar contrastantes quanto à capacidade de obter N da FBN. De acordo com o levantamento realizado neste trabalho, as bactérias estudadas (Azospirillum lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, Herbaspirillum spp. e Acetobacter diazotrophicus) estavam presentes nos quatro genótipos avaliados e em todas as partes da planta, exceto A. amazonense, que não foi isolado de amostras de folhas. A quantificação das bactérias Herbaspirillum spp. e A. diazotrophicus mostrou não haver diferenças significativas entre os genótipos, e que, geralmente, elas estão presentes em maior número nas raízes. Enquanto Herbaspirillum spp. mantém-se mais estável ao longo do ciclo da cultura, a população de A. diazotrophicus decresce com a aproximação do final do ciclo comercial. Pode-se sugerir que as diferenças entre as taxas de FBN encontradas nos diversos genótipos não é causada por diferenças na presença ou no número das bactérias aqui estudadas.

The objective of this work was to find out the localization and number of endophytic bacteria in four sugar cane genotypes and investigate upon the possible existence of correlation to the results obtained in some studies about quantification of biological nitrogen fixation (BNF). A survey of the diazotrophic bacteria present in sugar cane genotypes differing in their capacity to obtain nitrogen through BNF was performed, and population of Herbaspirillum spp. and Acetobacter diazotrophicus was quantified. The bacteria tested in the survey were Azospirillum lipoferum, A. brasilense, A. amazonense, Herbaspirillum spp. and Acetobacter diazotrophicus. All these bacteria were present in the four genotypes and were found in all parts of the plants, except A. amazonense which was not isolated from leaf samples. The quantification of Herbaspirillum spp. and A. diazotrophicus showed that there were no significant differences among the sugar cane genotypes and, generally, the bacteria were in greater number in roots. While number of Herbaspirillum spp. remained stable during the life-cycle of the culture, the population of A. diazotrophicus suffer a decrease with the approach of the end of the commercial cycle. It is suggested that the differences in the rates of BNF found in sugar cane genotypes are not caused by differences in the presence or the number of the bacterial species studied here.