Abstract Metarhizium anisopliae is an anamorphic fungus widely studied due to its use as a biological control agent. In Mexico, it is mainly used as an integrated management strategy to control populations of spittlebugs (Hemiptera: Cercopidae) that affect sugarcane fields and cattle pastures. In this study, 13 strains isolated from Aeneolamia spp. (Hemiptera: Cercopidae) from the main areas of sugarcane production of Mexico and 11 reference strains of Metarhizium from different insect hosts and geographic origins were evaluated based on their conidial dimensions, thermotolerance at 15, 25, 30, and 35 ºC, random amplification of polymorphic DNA (RAPD) patterns using a combined analysis with 14 different oligonucleotides and diversity estimators, and a phylogenetic analysis with the ribosomal RNA internal transcribed spacer (ITS) region. All strains used in this study showed typical morphological characteristics corresponding to M. anisopliae and were able to grow at 25 and 30 ºC with restricted growth at low (15 ºC) and high temperatures (35 ºC). Polymorphism analysis clustered all strains from Aeneolamia sp. in one well-defined group with low variability among them. Phylogenetic relationships based on nuclear ribosomal ITS region sequences recovered a subclade within M. anisopliae formed by 10 of the Mexican strains.

Resumen Metarhizium anisopliae es un hongo anamórfico ampliamente estudiado debido a su uso como agente de control biológico. En México se utiliza principalmente como una estrategia de manejo integrado para controlar poblaciones de mosca pinta (Hemiptera: Cercopidae) que afectan los campos de caña de azúcar y pastizales de ganado. Estudios previos muestran evidencia de variabilidad fisiológica y filogenética entre las cepas de Metarhizium anisopliae. En este estudio, 13 cepas aisladas de Aeneolamia spp. (Hemiptera: Cercopidae) que provienen de las principales áreas de producción de caña de azúcar de México y 11 cepas de referencia de Metarhizium de diferentes insectos hospederos y orígenes geográficos, fueron evaluadas en función de sus dimensiones conidiales, su termotolerancia a 15, 25, 30 y 35 ºC, amplificación aleatoria de patrones de ADN polimórfico (RAPD) usando un análisis combinado con 14 oligonucleótidos diferentes, análisis de estimadores de diversidad y un análisis filogenético con la región de los espaciadores internos transcritos (ITS) del gen del ARN ribosómico. Todas las cepas utilizadas en este estudio mostraron características morfológicas típicas correspondientes a M. anisopliae, crecieron a 25 y 30 ºC con restricción a bajas (15 ºC) y altas (35 ºC) temperaturas. El análisis del polimorfismo agrupó todas las cepas de Aeneolamia sp. en un grupo bien definido con baja variabilidad entre ellos. El análisis filogenético evidenció un subclado dentro de M. anisopliae formado por 10 de las cepas mexicanas.

The infection process whereby Isaria fumosorosea colonizes whitefly (Trialeurodes vaporariorum) nymphs was investigated using light and scanning electron microscopy. The fungal growth development index was used to determine pathogenicity of the isolates studied. The ultrastructural findings allowed us to examine the course of colonization of T. vaporariorum by this fungus through the formation of cuticular penetration structures. I. fumosorosea produced structures that resemble appressoria in shape, and isolates cause serious cuticular damage suggesting of enzymatic action. The results of this study suggest isolate EH-506/3 as suitable for whitefly biocontrol.

El proceso de infección por el cual Isaria fumosorosea coloniza a las ninfas de la mosquita blanca (Trialeurodes vaporariorum) fue investigado usando microscopía de luz y electrónica de barrido. El índice de crecimiento y desarrollo fúngico fue usado para determinar la patogenicidad de los aislados estudiados. Los hallazgos ultraestructurales nos permitieron examinar el curso de la colonización de este hongo en T. vaporariorum mediante la formación de estructuras de penetración en la cutícula. Los aislados de I. fumosorosea produjeron estructuras que recuerdan apresorios en su forma y causan serios daños cuticulares en el hospedante que sugieren la acción enzimática. Los resultados de este estudio sugieren que el aislado EH-506/3 es adecuado para el control biológico de la mosquita blanca.

We utilized two-dimensional gel electrophoresis and immunoblotting (2D-immunoblotting) with anti-Sporothrix schenckii antibodies to identify antigenic proteins in cell wall preparations obtained from the mycelial and yeast-like morphologies of the fungus. Results showed that a 70-kDa glycoprotein (Gp70) was the major antigen detected in the cell wall of both morphologies and that a 60-kDa glycoprotein was present only in yeast-like cells. In addition to the Gp70, the wall from filament cells showed four proteins with molecular weights of 48, 55, 66 and 67 kDa, some of which exhibited several isoforms. To our knowledge, this is the first 2D-immunoblotting analysis of the S. schenckii cell wall.

The virulence and thermotolerance of 18 monospore cultures of Metarhizium anisopliae var. anisopliae derived from isolates of the spittlebug (Aeneolamia sp.) in sugarcane were tested. Virulence was determined by the median lethal time (LT50) in Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) pupae and thermotolerance by fungal growth at 25, 30, 35 and 40 °C. Thermotolerance of monospore isolates was studied by the diameter of the fungal colonies at day 14. Virulence results revealed EH-481/1, EH-469/6, EH-476/3, EH-474/6, EH-475/2 y EH-473/4, with a LT50 of 5.19, 5.76, 5.97, 6.04, 6.15 and 6.53 days, respectively. The highest growth of isolates and of reference strain FI-1029, correspond ing to M. anisopliae var. anisopliae, same as the isolates from Mexico, occurred at 25 and 30 °C. Growth at 35 °C was very low, and no growth occurred at 40 °C. Results show the relevance of virulence and thermotolerance studies for strain selection to be used as biological control microbial agents.

Se evaluó la virulencia y termotolerancia de 18 cultivos monospóricos de Metarhizium anisopliae var. anisopliae derivados de aislados originales de la mosca pinta (Aeneolamia sp.), plaga de la caña de azúcar. La virulencia de las diferentes cepas se determinó en pupas de Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae) considerando el Tiempo Letal Medio (TL50) y la termotolerancia durante el crecimiento de los cultivos monospóricos a 25, 30, 35 y 40 °C, considerando el crecimiento radial durante 14 días. De acuerdo con los resultados del TL50 y la mortalidad acumulada, los aislados con mayor virulencia fueron EH-481/1, EH-469/6, EH-476/3, EH-474/6, EH-475/2 y EH-473/4, con TL50 de 5.19, 5.76, 5.97, 6.04, 6.15 y 6.53 días, respectivamente. Los resultados de termotolerancia indicaron que el mayor crecimiento de los cultivos monospóricos y de la cepa de referencia FI-1029 correspondiente a M. anisopliae var. anisopliae fue igual a los aislados de México evaluados a 25 y 30 °C. El crecimiento de los aislados a 35°C fue menor, y a 40°C no hubo crecimiento. Se discute la relevancia de la virulencia y termotolerancia para la selección de cepas de hongos como agentes microbianos para el control biológico.

The production of protease and chitinase activities of isolates of Paecilomyces fumosoroseus and their virulence in whitefly nymphs were evaluated. Enzyme production was tested in 18 fungal isolates, on synthetic liquid medium with colloidal shrimp cuticle and remazol bright blue stained colloidal chitin as substrates for protease and chitinase activity, respectively. The virulence bioassay was carried out in second stage whitefly (Trialeurodes vaporariorum) nymphs in 9 monospore cultures of selected isolates. The virulence was determined by the median lethal concentration (LC50) in whiteflies. Isolates EH-506/3 and EH-511/3 with the highest virulence (LC50 of 1.1 x 10³ and 6.9 x 10³, respectively) also showed the highest protease activity (PU/mL of 39.8 and 14.9, respectively) at 120 h. Chitinases reached maximum activities at the end (264 and 312 h) of thein vitro enzymatic assay. This is the first time that an ample intraspecific variability in protease and chitinase activities as well as in virulence has been reported in a representative sample of P. fumosoroseus strains from Mexico, which suggest that protease activities could be used in the selection of candidates for whiteflies biological control.

Se evaluó la actividad de proteasa y quitinasa y la virulencia en ninfas de mosquita blanca de aislados del hongo entomopatógeno Paecilomyces fumosoroseus. La producción de enzimas se ensayó con 18 aislados fúngicos, en un medio sintético líquido adicionado de cutícula de camarón coloidal y de quitina coloidal teñida con azul brillante de remazol como substratos para proteasa y quitinasa, respectivamente. Los bioensayos de virulencia se realizaron en ninfas de mosquita blanca (Trialeurodes vaporariorum) de segundo estadio, con 9 cultivos monospóricos. La virulencia fue determinada a partir de la concentración letal media (CL50) en mosquita blanca. Los aislados EH-506/3 y EH-511/3 fueron los más virulentos con una CL50 de 1.1 x 10³ y 6.9 x 10³ conidios/mL, respectivamente, con la más alta actividad de proteasa (39.8y 14.9 PU/mL, respectivamente) a las 120 h del experimento. Las actividades de quitinasa alcanzaron sus valores más altos al final (264 y 312 h) del experimento. Se presenta por primera vez, en una muestra representativa de cepas de P. fumosoroseus aisladas en México, una gran variabilidad intraespecífica en las actividades de proteasas y quitinasas y en la virulencia. Se sugiere que la actividad de proteasas podría ser utilizada en la selección de cepas de este hongo para el control biológico de mosquita blanca.

The mycobiota present in natural habitats of Histoplasma capsulatum was determined in samples of bat guano, poultry droppings, and intestinal contents of bats. The following fungi were isolated: 1) from bat guano: the ascomycetes Aphanoascus fulvescens, Gymnascella citrina, Gymnoascus dankaliensis, and Chaetomidium fimeti; the mitosporic fungi Aspergillus flavo-furcatis, A. terreus, A. terreus var. aureus, Penicillium spp., Malbranchea aurantiaca, and Sporothrix sp.; and the yeasts Candida catenulata, C. ciferrii, C. famata var. flareri, C. guilliermondii var. guilliermondii, and Rhodotorula spp. 2) from poultry droppings: the coelomycete Phoma sp.; and the yeasts C. albicans, C. catenulata, C. ciferrii, C. famata var. flareri, C. tropicalis, Cryptococcus albidus, Trichosporon moniliiforme, and Trichosporon spp. 3) from the intestinal contents of insectivorous, hematophagous, nectarivorous, and frugivorous bats: Ch. fimeti; the mitosporic fungi Aspergillus candidus, A. flavo-furcatis, A. sulphureus, A. sydowii, A. terreus, A. versicolor, Aspergillus sp., M. aurantiaca, Gliomastix murorum, and Scopulariopsis sp.; and C. famata var. flareri, C. lipolytica, Cr. albidus, and Trichosporon spp. Most of the species found are first records for these substrata and environments in Mexico. The coexistence with H. capsulatum was demonstrated by high specific antibody titers in ELISA serological method, using sera from BALB/c mice previously inoculated with the supernatant of the different samples studied.

Se determinó la micobiota presente en diferentes hábitats naturales de Histoplasma capsulatum, como guano de murciélago, excretas de aves de corral, y contenido intestinal de murciélagos. Se aislaron: 1) de guano: los ascomicetes Aphanoascus fulvescens, Gymnascella citrina, Gymnoascus dankaliensis, y Chaetomidium fimeti; los hongos mitospóricos Aspergillus flavo-furcatis, A. terreus, A. terreus var. aureus, Penicillium spp., Malbranchea aurantiaca, y Sporothrix sp.; y las levaduras Candida catenulata, C. ciferrii, C. famata var. flareri, C. guilliermondii var. guilliermondii, y Rhodotorula spp. 2) de excretas: el celomicete Phoma sp.; y las levaduras C. albicans, C. catenulata, C. ciferrii, C. famata var. flareri, C. tropicalis, Cryptococcus albidus, Trichosporon moniliiforme, and Trichosporon spp. 3) del contenido intestinal de murciélagos insectívoros, hematófagos, nectarívoros, y frugívoros : Ch. fimeti; Aspergillus candidus, A. flavo-furcatis, A. sulphureus, A. sydowii, A. terreus, A. versicolor, Aspergillus sp., M. aurantiaca, Gliomastix murorum, Scopulariopsis sp.; y C. famata var. flareri, C. lipolytica, Cr. albidus, y Trichosporon spp. La mayoría de las especies son primeros registros para estos sustratos y ambientes en México. Su coexistencia con H. capsulatum se demostró en la prueba serológica de ELISA, por la presencia de altos títulos de anticuerpos específicos en el suero de ratones BALB/c previamente inoculados con el sobrenadante de las muestras estudiadas.