Resumo: A osteoporose é uma doença multifatorial, de alta prevalência e que tem um grande impacto na qualidade de vida, principalmente porque os efeitos sobre a estrutura do osso aumentam o risco de fraturas, que podem ser muito debilitantes. Com base na observação de que pacientes com depressão têm menor densidade mineral óssea que indivíduos saudáveis, muitos estudos têm indicado que o estresse pode ser um fator agravante para a perda óssea. Este estudo avalia o efeito de um protocolo de estresse moderado crônico (EMC) em parâmetros de avaliação óssea em ratos machos e fêmeas. Cinco animais de cada sexo, com cinco meses de idade, foram submetidos a um cronograma de aplicação de estressores durante 28 dias. Os estressores incluídos foram: frio, calor, contenção, inclinação da gaiola, isolamento, iluminação durante a noite e privação de água e ração. Cinco animais de cada sexo foram mantidos com um mínimo de intervenção como grupo controle. Os animais foram pesador no início e no final do período, e após eutanásia tiveram seus ossos coletados. Fêmur, tíbia e vértebra lombar foram analisados por densitometria óssea. Testes biomecânicos foram realizados na cabeça e na diáfise do fêmur. Volume trabecular ósseo foi obtido a partir de análise histomorfométricas da cabeça do fêmur e do corpo vertebral, bem como medidas da seção transversal diáfise femoral. Nem todos os parâmetros avaliados sofreram efeito do protocolo de EMC. No entanto, a densidade mineral óssea da tíbia e da vértebra L4 e a razão osso cortical/medula da seção transversal da diáfise femoral foram menores nas fêmeas submetidas ao protocolo. Entre os ratos machos, as diferenças foram significativas no volume trabecular ósseo da cabeça femoral e na carga máxima obtida no teste biomecânico. Assim, confirma-se que o protocolo de EMC pode afetar o equilíbrio da homeostase óssea em ratos, o que pode contribuir para o estabelecimento de osteopenia ou osteoporose.

Abstract: Osteoporosis is a multifactorial disease of high prevalence and has great impact on quality of life, because the effects on bone structure increase the risk of fractures, what may be very debilitating. Based on the observation that patients with depression have lower bone mineral density than healthy individuals, many studies have indicated that stress could be an aggravating factor for bone loss. This study evaluates the effect of a protocol of chronic mild stress (CMS) on parameters of bone assessment in male and female rats. Five 5-monh-old rats of each sex underwent a schedule of stressor application for 28 days. Stressors included cold, heat, restraint, cage tilt, isolation, overnight illumination, and water and food deprivation. Five rats of each sex were kept under minimum intervention as control group. The animals were weighed at beginning and end of the period, and after euthanasia had their bones harvested. Femur, tibia and lumbar vertebrae were analyzed by bone densitometry. Biomechanical tests were performed in femoral head and diaphysis. Trabecular bone volume was obtained from histomorphometric analysis of femoral head and vertebral body, as well as of femoral midshaft cross-sectional measures. Not all parameters analyzed showed effect of CMS. However, tibial and L4 vertebral bone mineral density and cross-sectional cortical/medullar ratio of femoral shaft were lower in female rats submitted to the CMS protocol. Among male rats, the differences were significant for femoral trabecular bone volume and maximum load obtained by biomechanical test. Thus, it could be confirmed that CMS can affect the balance of bone homeostasis in rats, what may contribute to the establishment of osteopenia or osteoporosis.

Dez bezerros machos, da raça Jersey, com 1 ano de idade com baços "in situ", sorológica e parasitologicamente livres de Babesia, foram mantidos em baias individuais no isolamento a prova de artrópodes do Depto de Veterinária desde o nascimento e ao longo de toda a experimentação. Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos. Cinco animais (grupo A) foram inoculados por via intravenosa com 6,6 x10(7) hemácias parasitados com amostra patogênica de Babesia bovis (BboUFV - 1 7ª passagem) , para a determinação subseqüente "ex vivo" da expressão de moléculas de adesão . Cinco animais não inoculados (Grupo B ) foram utilizados como controlo negativo . A expressão de moléculas de adesão ICAM - 1, VCAM , PECAM - 1, E - selectina e trombospondina ( TSP ) foi medida em células endoteliais da veia umbilical de bovinos (BUVECs). As células endoteliais estimuladas com um pool de plasma proveniente de animais infectados com BboUFV - 1 7ª passagem tinham uma imunocoloração muito mais intensa de ICAM - 1 , VCAM , PECAM - 1 de E - selectina e de TSP , em comparação com as células que não receberam o estímulo . Os resultados sugerem que as citocinas pró-inflamatórias liberados na fase aguda da babesiose pode estar envolvida na expressão de moléculas de adesão , implicando , assim, elas na fisiopatologia da babesiose causada por B. bovis.

Ten male, 12-month-old Jersey with intact spleens, serologically and parasitologically free from Babesia were housed individually in an arthropod-free isolation system from birth and throughout entire experiment. The animals were randomly divided into two groups. Five animals (group A) were intravenously inoculated with 6.6 X10(7) red blood cells parasitized with pathogenic sample of Babesia bovis (passage 7 BboUFV-1), for the subsequent "ex vivo" determination of the expression of adhesion molecules. Five non-inoculated animals (group B) were used as the negative control. The expression of the adhesion molecules ICAM-1, VCAM, PECAM-1 E-selectin and thrombospondin (TSP) was measured in bovine umbilical vein endothelial cells (BUVECs). The endothelial cells stimulated with a pool of plasma from animals infected with the BboUFV-1 7th passage sample had a much more intense immunostaining of ICAM-1, VCAM, PECAM-1 E-selectin and TSP, compared to the cells which did not received the stimulus. The results suggest that proinflammatory cytokines released in the acute phase of babesiosis may be involved in the expression of adhesion molecules thereby implicating them in the pathophysiology of babesiosis caused by B. bovis.

A neosporose é reconhecida como uma das maiores causas de aborto e perdas neonatais em bovinos de leite e corte em todo o mundo. Nos últimos anos esta doença tem atraído o interesse de pesquisadores com foco na epidemiologia e métodos eficazes de diagnóstico desta doença. No presente estudo objetivou-se desenvolver e padronizar um teste Dot-ELISA para o diagnóstico sorológico de Neospora caninum com um peptídeo recombinate como antígeno, visando o desenvolvimento de um kit para diagnóstico a campo. O peptídeo recombinante (rNcGRA1) foi desenhado com base na metodologia de genética reversa de epítopos antigênicos originados de uma proteína de grânulos densos de N. caninum, e sintetizado pela GenScript (USA). Produzido mediante o processo fermentativo em leveduras Pichia pastoris KM71. Para a padronização do Dot-ELISA, membranas de nitrocelulose de 0.22µm foram sensibilizadas com 1µL do antígeno e posteriormente os soros foram diluídos em solução de lavagem e incubados durante 1 hora. A revelação foi feita mediante a adição de Proteína G marcada com peroxidase por 30 minutos, seguido da solução reveladora a base de 3,3’-Diaminobenzidine (DAB). Logo após a padronização foram testados 44 soros bovinos diagnosticados por imunofluorescência indireta (RIFI), obtendo-se uma concordância nos resultados do teste de 95,5% e uma sensibilidade e especificidade de 100% e 92% respectivamente. Quanto ao Kit para diagnóstico a campo na Plataforma Tecnológica RapidFlow-Through Miriad®, o peptídeo rNcGRA1 apresentou marcações visíveis ao reagir com os soros positivos, e não apresentou marcações usando os soros negativos. Este estudo é o primeiro a utilizar peptídeos recombinantes e mostrar-se eficiente para o diagnóstico sorológico de bovinos naturalmente infetados por N. caninum.

Neosporosis is recognized as a major cause of abortion and neonatal loss in cattle worldwide, both for dairy cattle and beef cattle. In recent years this disease has attracted the interest of researchers and studying the epidemiology and effective methods of diagnosis of this disease. The present study aimed to develop and standardize on a Dot-ELISA for the serological diagnosis of Neospora caninum by using recombinant peptide as antigen for the development of a diagnostic kit used on the field. The recombinant antigen (rNcGRA1) was designed based on the method of reverse genetics derived antigenic epitopes of dense granules protein of N. caninum and synthesized by GenScript (USA). It was produced by the fermentation in yeasts Pichiapastoris KM71. The serological technique was used for the Dot-ELISA detection of IgG specific for N. caninum in which 0.22μm nitrocellulose membranes were sensitized with 1μL of antigen and subsequently the plasmas were diluted in a washing solution and incubated for 1 hour. The results will revealed by the addition of Protein G labeled with peroxidasse for 30 minutes, followed by the developing solution based on 3,3’-Diaminobenzidine (DAB). Soon after standardization tested 44 bovine plasmas were diagnosed by indirect immunofluorescence assay (IFA), agreeing with the results on a 95.5% and a sensitivity and specificity of 100% and 92% respectively. In regard to the diagnostic kit for the Technology Platform Rapid Flow-Through Miriad®, the peptide presented rNcGRA1 visible markings to react with positive plasma, and showed no markings using the negative plasma. This study is the first to use recombinant peptides and prove to be efficient for the serological diagnosis of cattle naturally infected.

A dependência exclusiva de compostos químicos para o controle de Rhipicephalus (Boophilus) microplus tornou-se uma das maiores preocupações científicas e econômicas dos últimos anos, e como consequência, estão sendo realizadas pesquisas para o desenvolvimento de vacinas. O objetivo deste trabalho foi avaliar a resposta de linfonodos de bovinos imunizados a campo com o peptídeo rSBm7462 anti R. (B.) microplus. Foram utilizados 14 bovinos mestiços (Bos taurus x Bos indicus), com idades entre 4-10 meses, mantidos em duas propriedades rurais do norte do estado de Minas Gerais. Os animais receberam três imunizações do peptídeo rSBm7462, aplicados por via subcutânea, com intervalo de 30 dias. Após 15 dias de cada imunização, os linfonodos pré-escapulares foram coletados e fixados por 18 horas em formol. Posteriormente, foram incluídos em Paraplast e as amostras foram coradas pela técnica hematoxilina-eosina (HE) para a observação de eventos celulares. Para a identificação do antígeno nos linfonodos dos animais imunizados, foi realizada a técnica de imuno-histoquímica (IHQ) com o método peroxidase-anti-peroxidase (PAP). A resposta de linfonodos dos bovinos inoculados foi avaliada pelas análises de formação de centros germinais (CG), hiperplasia de cordões medulares (CM) e a presença do antígeno rSBm7462 em células PAP+, demonstrando que o peptídeo recombinante rSBm7462 induz uma resposta imune adaptativa T-dependente, caracterizada nos tecidos linfóides secundários pela formação de estruturas que conferem afinidade e memória imunológica.

Exclusive chemicals dependence for the control of Rhipicephalus (Boophilus) microplus has become one of the largest scientific and economical concerns in recent years, and as a result, research to vaccine development are being undertaken. The objective of this study was evaluating the lymph nodes response of cattle immunized at field with the rSBm7462 anti-R. (B.) microplus peptide. Fourteen crossbred cattle (Bos taurus x Bos indicus), aged 4-10 months, were used. The animals were maintained on two farms in the north of Minas Gerais state and received three immunizations with the peptide rSBm7462 applied subcutaneously at 30-day intervals. Pre-scapular lymph nodes were collected surgically 15 days after each immunization and fixed in formalin for 18 hours, then, they were embedded in Paraplast subsequently and the samples were stained with Hematoxylin-Eosin (HE) technique for cellular events observation. On the other hand, in order to antigens identifying in immunized animals lymph nodes, the immunohistochemistry (IHC) with peroxidase-anti peroxidase (PAP) method was performed. Lymph node response of cattle inoculated was evaluated by analysis of germinal centers (GC) formation, medullary cords hyperplasia (MC) and antigen rSBm7462 presence in PAP+ cells. This study shows that the recombinant peptide rSBm7462 induces a T-dependent adaptive immune response characterized on secondary lymphoid tissues by structure formation for affinity and immunological memory.

Foram utilizados 36 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, machos, com peso médio de 3,5kg e idade entre cinco e seis meses para avaliação da coleta, do preparo e da técnica de aplicação do auto-enxerto percutâneo de medula óssea (MO). Em 20 coelhos anestesiados, uma agulha para punção de MO foi inserida na crista ilíaca, sendo a medula aspirada com auxílio de seringa de 20m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> heparinizada. As 20 amostras obtidas foram preparadas de duas maneiras, utilizando-se 10 amostras em cada procedimento: 1) medula integral: após a coleta de 1m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif">, a amostra foi homogeneizada e, em casos de presença de coágulo, ela foi descartada; 2) medula centrifugada: após a coleta de 2m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> a medula foi centrifugada por 10 minutos, sendo o sobrenadante removido e 1m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> do sedimento homogeneizado. Em ambos os procedimentos, as amostras foram submetidas à contagem de células nucleadas. Nos 16 coelhos restantes, para permitir a avaliação da técnica de aplicação da MO, foi criada, cirurgicamente, uma falha óssea em ambos os rádios, pela remoção de um segmento osteoperiosteal com 1,0cm de comprimento, localizado a três centímetros da articulação rádio-carpo-ulnar. Após cinco dias da realização das falhas ósseas, os 16 coelhos foram separados em dois grupos iguais (I e II), sendo novamente anestesiados e preparados para a enxertia. No grupo I, cada animal recebeu 1,0m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> de medula integral, imediatamente após a coleta, em um dos rádios (tratamento) e 1,0m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> de solução salina fisiológica no rádio contralateral (controle). No grupo II, cada animal recebeu 1,0m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> de medula concentrada em um dos rádios (tratamento) e 1,0m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> de solução salina fisiológica no rádio contralateral (controle). Em função da característica física da medula, a coleta das amostras constituiu-se em procedimento simples, envolvendo trauma mínimo. Foi necessária prévia heparinização da seringa de coleta, o que não impediu a osteogenicidade das células. Com relação ao preparo das amostras, observou-se ampla variação individual na contagem celular nos dois procedimentos. A concentração da medula por centrifugação não interferiu negativamente no seu potencial osteogênico. A aplicação por via percutânea mostrou-se um método simples, com mínimo trauma aos tecidos, não introduzindo tecido desvitalizado e, desta forma, reduzindo o risco de infecção e de interferência na reparação óssea. A avaliação radiográficados membros operados, realizadas no dia da enxertia e uma semana após, demonstrou a eficiência da aplicação da MO e sua atuação na formação de osso.

Thirty six White New Zealand male rabbits, that weighed 3.5kg, aged between 5 and 6 months were used for studying the harvesting, processing and percutaneous administration of bone marrow autograft. In 20 anesthetized rabbits, a needle for bone marrow collection was inserted in the iliac crest and marrow was aspirated with a 20 ml heparinized syringe. The 20 samples were processed in 2 ways, 10 samples each way: 1) whole marrow: after 1-ml-harvest the sample was homogenized and in the case of coagulation, the sample was discarded; 2) centrifuged marrow: after 2-ml-harvest, the marrow was centrifuged for 10 minutes, then the supernatant was discarded and 1m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> of the sediment was homogenized. In both proceedings the samples were submitted to nucleated cell count. In order to evaluate the percutaneous administration of the bone marrow, in the 16 remaining rabbits an 1-cm osteal-periosteal segmental osteotomy in both radii was produced. Five days after surgery, the 16 rabbits were set apart in groups I and II, anesthetized and prepared for grafting. Each animal of group I received 1.0m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> of whole bone marrow in one radius (treatment), immediately after harvesting and 1.0m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> of physiological saline in the contralateral radius (control). In group II each animal received 1.0 of concentrated marrow in one radius (treatment) and 1.0m<img src="http:/img/fbpe/cr/v31n6/a16img01.gif"> of physiological saline solution in the contralateral radius (control). Because of the physical characteristics of medulla, its harvesting was a simple proceeding with minimal trauma. It was necessary to heparinize the syringe, there was no damage to the osteogenic potential of the samples. In relation to sample processing, it was observed wide individual variation of the cellular count in both proceedings. Medullary concentration did not negatively interfere on the osteogenic potential. Percutaneous marrow grafting was a simple method, with no need of surgical approach and no introducing of devitalized tissue, reducing this way risk of infection and interference of bone repair. Radiographic evaluation of the operated limbs demonstrated bone marrow grafting effectiveness in osseous formation.

Os efeitos da eletroestimulação pós-operatória no processo de reparação de falhas osteocondrais induzidas no sulco troclear de 36 coelhos adultos foram avaliados histologicamente. O grupo controle apresentou tecido de granulação típico, com duas semanas de pós-operatório (PO); cartilagem hialina foi observada após quatro e sete semanas de PO e a reconstituição do osso subcondral excisado limitou-se ao fundo da falha, até sete semanas de PO. No grupo I (eletroestimulado diariamente), o tecido de granulação apresentou vascularização exuberante após duas semanas de PO; após sete semanas de PO, o tecido de reparação permaneceu indiferenciado superficialmente, com formação de novo osso subcondral até o nível da junção osteocondral preexistente. No grupo II (eletroestimulado em dias alternados), os animais responderam de duas maneiras: através da reparação com cartilagem hialina e osteogênese reduzida, semelhante ao grupo controle; ou pela formação de tecido indiferenciado e osteogênese intensa, como no grupo I. Concluiu-se que a eletroestimulação pós-operatória realizada impediu a diferenciação tecidual em cartilagem hialina em coelhos. Por outro lado, a ossificação endocondral foi acelerada, observando-se reconstituição do osso subcondral até o nível da junção osteocondral preexistente nos animais tratados com este método. Em face da importância do osso subcondral na manutenção da integridade do tecido de reparação, a eletroestimulação é benéfica na fase inicial (quatro semanas) da reparação de falhas osteocondrais.

The effects of postooperative electrotherapy in the repair of full-thickness osteochondral defects in the troclear groove of 36 adult rabbits were evaluated histologically. In the control group, granulation tissue was present two weeks post-operatively (PO); hyaline cartilage was observed at four and at seven weeks PO; subchondral bone regeneration was limited to the deeper portions of the defects at seven weeks PO. In group I (stimulated daily), granulation tissue presented abundant vascularization at two weeks PO and the repair tissue remained undifferentiated superficially, with formation of new subchondral bone up to the level of the original osteochondral junction, at seven weeks PO. The animals in group II (stimulated every other day), responded in two ways: through repair with hyaline cartilage, with reduced osteogenesis, similar to control group; or undifferentiated tissue, with an intense osteogenesis, as in group I. The postoperative electrical stimulation inhibited the tissue differentiation into hialine cartilage. On the other hand, endochondral ossification was accelerated, with complete regeneration of subchondral bone, in treated animals. In view of the importance of the subchondral bone for the integrity of the repair tissue, electrical stimulation is benefic in the initial fase (four weeks) of osteochondral defects repair.