Ejercicio y restricción alimenticia aumentan el rnam de proteínas del tránsito de Ca2+ miocárdico en ratones

Resúmenes

FUNDAMENTO: Treinamento físico (TF) aumenta a sensibilidade dos hormônios tireoidianos (HT) e a expressão gênica de estruturas moleculares envolvidas no movimento intracelular de cálcio do miocárdio, enquanto a restrição alimentar (RIA) promove efeitos contrários ao TF. OBJETIVO: Avaliar os efeitos da associação TF e RIA sobre os níveis plasmáticos dos HT e a produção de mRNA dos receptores HT e estruturas moleculares do movimento de cálcio do miocárdio de ratos. MÉTODOS: Utilizaram-se ratos Wistar Kyoto divididos em: controle (C, n = 7), RIA (R50, n = 7), exercício físico (EX, n = 7) e exercício físico + RIA (EX50, n = 7). A RIA foi de 50% e o TF foi natação (1 hora/dia, cinco sessões/semana, 12 semanas consecutivas). Avaliaram-se as concentrações séricas de triiodotironina (T3), tiroxina (T4) e hormônio tireotrófico (TSH). O mRNA da bomba de cálcio do retículo sarcoplasmático (SERCA2a), fosfolamban (PLB), trocador Na+/Ca+2 (NCX), canal lento de cálcio (canal-L), rianodina (RYR), calsequestrina (CQS) e receptor de HT (TRα1 e TRβ1) do miocárdio foram avaliados por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real. RESULTADOS: RIA reduziu o T4, TSH e mRNA do TRα1 e aumentou a expressão da PLB, NCX e canal-L. TF aumentou a expressão do TRβ1, canal-L e NCX. A associação TF e RIA reduziu T4 e TSH e aumentou o mRNA do TRβ1, SERCA2a, NCX, PLB e correlação do TRβ1 com a CQS e NCX. CONCLUSÃO: Associação TF e RIA aumentou o mRNA das estruturas moleculares cálcio transiente, porém o eixo HT-receptor não parece participar da transcrição gênica dessas estruturas.

Exercício; restrição calórica; hormônios tireoideanos; miocárdio; proteínas de transporte; calcio

BACKGROUND: Chronic exercise and food restriction (FR) have directionally opposite changes in transcription of molecular structures of calcium handling and thyroid hormone (TH) status. OBJECTIVE: Evaluate the association of chronic exercise and FR on serum thyroid hormones and gene transcription of molecular structures of intracellular calcium transients and thyroid receptors in myocardium of rats. METHODS: Male Wistar Kyoto rats, divided into two groups: control (C, n = 7), FR (R50, n = 7), chronic exercise (EX, n = 7) and chronic exercise + FR (EX50, n = 7). FR was of 50% and exercise was swimming (1 hour/day, 5 days/week, during 12 weeks). Serum concentrations of T3, T4 and TSH were determined. The mRNA gene expression of the sarcoplasmatic reticulum calcium pump (SERCA2a), phospholamban (PLB), Na+/Ca+2 exchanger (NCX), calcium channel L-type (L-channel), ryanodine (RYR), calsequestrin (CQS) and HT receptor (TRα1 and TRβ1) of the myocardium was performed by PCR real-time. RESULTS: FR reduced serum levels of T4 and TSH and TRα1 mRNA and increased the expression of PLB, NCX and L-channel. Exercise increased the TRβ1 receptor, L-channel and NCX. The association of exercise and FR reduced plasma T4 and TSH, TRβ1 mRNA increase, SERCA2a, NCX and PLB, and there was a significant correlation of TRβ1 with CQS and NXC. CONCLUSION: Chronic exercise and food restriction increased the mRNA of transient Ca2+ proteins; however, TH-receptor axis cannot participate in the transcription of mRNA of myocardial calcium transient proteins.

Exercise; caloric restriction; thyroid hormones; myocardium; carrier proteins; calcium

ARTÍCULO ORIGINAL

^IInstituto de Ciências da Saúde - Universidade Federal de Mato Grosso - UFMT, Campus de Sinop, Cuiabá, MT

^IIFaculdade de Medicina - Universidade Estadual Paulista - UNESP, Campus de Botucatu, Botucatu, SP - Brasil

Correspondencia

RESUMEN

FUNDAMENTO: Entrenamiento físico (EF) aumenta la sensibilidad de las hormonas tiroideas (HT) y la expresión génica de estructuras moleculares envueltas en el movimiento intracelular de calcio del miocardio, mientras que la restricción alimenticia (RA) promueve efectos contrarios al EF.

OBJETIVO: Evaluar los efectos de la asociación EF y RA sobre los niveles plasmáticos de los HT y la producción de ARNm de los receptores HT y estructuras moleculares del movimiento de calcio del miocardio de ratones.

MÉTODOS: Se utilizaron ratones Wistar Kyoto divididos en: control (C, n = 7), RA (R₅₀, n = 7), ejercicio físico (EX, n = 7) y ejercicio físico + RA (EX₅₀, n = 7). La RA fue de 50% y el EF fue natación (1 hora/día, cinco sesiones/semana, 12 semanas consecutivas). Se evaluaron las concentraciones séricas de triyodotironina (T₃), tiroxina (T₄) y hormona tireotrófico (TSH). El ARNm de la bomba de calcio del retículo sarcoplasmático (SERCA2a), fosfolamban (PLB), intercambiador Na⁺/Ca⁺² (NCX), canal lento de calcio (canal-L), rianodina (RYR), calsequestrina (CQS) y receptor de HT (TR_α1 y TR_β1) del miocardio fueron evaluados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en tiempo real.

RESULTADOS: RA redujo el T₄, TSH y ARNm del TR_α1 y aumentó la expresión de la PLB, NCX y canal-L. EF aumentó la expresión del TR_β1, canal-L y NCX. La asociación EF y RA redujo T₄ y TSH y aumentó el ARNm del TR_β1, SERCA2a, NCX, PLB y correlación del TR_β1 con la CQS y NCX.

CONCLUSIÓN: Asociación EF y RA aumentó el ARNm de las estructuras moleculares calcio transiente, sin embargo el eje HT-receptor no parece participar de la transcripción génica de esas estructuras.

Palabras clave: Ejercicio, restricción calórica, hormonas tiroideas, miocardio, proteínas de transporte, calcio.

Introducción

Intervenciones como actividad física y restricción alimenticia (RA) han sido frecuentemente utilizadas procurando manutención de la salud o estética corporal. Entre tanto, dependiendo de la intensidad, duración y frecuencia de la RA y de la actividad física, pueden ocurrir daños al organismo^1-7. Investigaciones muestran que esa asociación puede deprimir⁸ o mejorar el desempeño cardíaco^9,10.

Estructuras moleculares presentes en el sarcolema, canal lento de calcio tipo-L (canal-L) y el intercambiador Na⁺/Ca⁺² sodio/potasio (NCX), y presentes en el retículo sarcoplasmático, canal de rianodina, la calsequestrina (CQS), la bomba de calcio del retículo sarcoplasmático (SERCA2a) y la fosfolamban, están envueltas en el movimiento intracelular de calcio y participan en el proceso de contracción y relajación del músculo cardíaco¹¹. Trabajos muestran que la RA promueve reducción de la expresión génica de rianodina¹², de la SERCA2¹³, de canal-L¹⁴, mientras que el entrenamiento físico (EF) aumenta el ARNm de la SERCA2^15-17, de la rianodina^18,19 y del canal-L²⁰. La transcripción de las estructuras moleculares envueltas en el movimiento intracelular de calcio puede ser modulada por las hormonas tiroideas (HT), vía receptores nucleares de HT^21-23. Se sabe que la restricción alimenticia reduce la síntesis y liberación de las hormonas HT¹³ y el ejercicio físico puede aumentar la liberación y/o la sensibilidad de esas hormonas²¹. Entre tanto, la relación entre RA, EF y las hormonas tiroideas no está establecida.

Hay escasa literatura que analiza la relación RA, entrenamiento físico, hormonas tiroideas y transcripción génica de estructuras moleculares del tránsito calcio miocárdico. Katzeff et al¹³ verificaron reducción de los niveles plasmáticos de los hormonas HT y disminución de la expresión génica de SERCA2 de ratones restringidos. Iemitsu et al²² mostraron que el entrenamiento físico aumentó la expresión de receptores TRα₁ y TR_β1 y la transcripción génica de la SERCA2 en el miocardio de ratones añosos.

El objetivo de este trabajo fue evaluar los efectos de la asociación del entrenamiento físico y de la RA sobre las concentraciones plasmáticas de las hormonas tiroideas y el ARNm de los receptores HT, SERCA2a, canal-L, NCX, rianodina, calsequestrina y fosfolamban del miocardio de ratones.

Métodos

Animales y protocolo experimental

En el presente estudio fueron utilizados 28 ratones Wistar-Kyoto (WKY), con 60 días de edad, provenientes del Bioterio del Laboratorio Experimental del Departamento de Clínica Médica de la Facultad de Medicina de Botucatu. Durante la fase experimental, los animales fueron mantenidos en jaulas individuales, en ambiente con temperatura controlada (24 ± 2º C), ciclo claro-oscuro (12:12 h) y alimentados con ración comercial y agua. El proyecto siguió normas establecidas en el Guide for the Care and Use of Laboratory Animals y los Principios Éticos en Experimentación Animal del Colégio Brasileiro de Experimentação Animal (Cobea) siendo aprobado por el Comité de Ética de la Facultad de Medicina de Botucatu - Unesp, bajo protocolo 575/2006.

Los ratones fueron divididos en cuatro grupos: control con ración ad libitum (C); restricción alimenticia de 50% (R₅₀); ejercicio crónico con ración ad libitum (EX); ejercicio crónico con restricción alimenticia de 50% (EX₅₀).

Los animales de los grupos C y EX recibieron ración comercial labina (Purina, Paulina, SP, Brasil) compuesta por 3,76% de grasa, 20,96% de proteína, 52,28% de carbohidrato, 9,60% de cenizas y 13,40% de humedad. Los animales de los grupos R₅₀ y EX₅₀ recibieron la misma ración comercial, sin embargo con una reducción de 50% de la cantidad media consumida por el grupo control. El período de RA fue de 90 días. El consumo de ración fue controlado diariamente y el peso de los animales fue monitoreado semanalmente.

El entrenamiento físico fue natación con sobrecarga de peso de 5% del peso corporal. Para las sesiones de natación, fueron utilizados tanques de fibra de vidrio con las siguientes dimensiones: 100 cm de largo, 80 cm de ancho y 80 cm de altura que contenían agua caliente a (32 ± 1º C), mantenidos en el nivel de 60 cm. La sobrecarga de peso fue realizada por medio de plomadas de pesca envueltas en esparadrapo y fijadas al tórax del ratón por medio de elástico. Fueron mantenidos a lo máximo seis animales por sesión de entrenamiento.

Los animales de los grupos EX y EX₅₀ fueron sometidos a cinco sesiones de natación semanales, durante 12 semanas consecutivas. En la primera, segunda y tercera semana, los animales nadaron durante 30, 45 y 60 minutos, respectivamente, sin carga adicional. A partir de la cuarta semana, las sesiones de natación fueron de 60 minutos y con sobrecarga. Los ratones de esos grupos fueron previamente sometidos a un período de adaptación al agua. Durante una semana, fueron mantenidos durante 15 minutos en el interior del tanque conteniendo agua caliente, cuyo nivel inicial de agua era de 7,0 cm, siendo progresivamente aumentado, en el transcurso de la semana, hasta alcanzar la altura de 60 cm.

Dosaje sérico de T₃, T₄ y TSH

Previamente al sacrificio, los animales fueron mantenidos en ayuno de 12 horas y entonces fueron muertos por decapitación, previamente anestesiados con pentobarbital sódico (0,1 ml/kg) y la sangre fue inmediatamente transferida a tubos de ensayo. Los dosajes de triyodotironina (T₃), tiroxina (T₄) y hormona tireotrófico (TSH) fueron determinados utilizando kit comercial especifico para ratón, panel de tiroides (LINCOplex) en el laboratorio de análisis clínicos de la Gênese, São Paulo - Brasil.

Evaluación de las características generales de los animales

Después de la colecta de sangre, el corazón fue removido, fueron disecados el atrio, el ventrículo derecho y el ventrículo izquierdo que fueron pesados y congelados para análisis de la expresión génica. Las variables morfológicas utilizadas para caracterizar cada grupo de animales fueron: peso corporal inicial (PCI) y final (PCF), peso del ventrículo izquierdo (VI), relación entre el peso del ventrículo izquierdo y el peso corporal final (VI/PCF x 10³), peso del ventrículo derecho (VD), relación entre el peso del ventrículo derecho y el peso corporal final (VD/PCF x 10³).

Evaluación de la expresión génica por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real después de transcripción reversa

Extracción de ARN

Fragmentos del ventrículo izquierdo fueron rápidamente congelados en nitrógeno líquido y almacenados en freezer a -80º C. La muestra congelada fue homogeneizada en aparato Polytron (Ika Ultra Turrax^® T25 Basic, Wilmington, USA) después de adición de 1 ml de TRIzol^® (Invitrogen Brasil, São Paulo) para cada 100 mg de tejido. El TRIzol^®, solución monofásica de fenol y guanidina isotiocianato, tiene como finalidad mantener la integridad del ARN durante la lisis celular que ocurre en el proceso de homogeneización²⁴.

La muestra homogeneizada fue transferida a un tubo e incubada a temperatura ambiente durante 5 minutos, para permitir la completa disociación del complejo núcleo-proteico. En seguida, fue adicionado cloroformo (Merck KGaA, Damstadt, Germany) en la proporción de 0,2 ml/1 ml TRIzol^®; la muestra fue agitada, manualmente, con vigor por 15 segundos e incubada por 3 minutos a temperatura ambiente. Después de esa segunda incubación, el material fue centrifugado (Eppendorf 5804R, Hamburg, Germany), a 14.000 rpm durante 15 minutos a 4º C. En ese proceso la muestra quedó separada en tres fases: a) una inferior, de fenol-cloroformo y de coloración rosada, conteniendo ADN; b) una interfase blanca con proteínas; y c) una fase superior, acuosa, incolora, conteniendo ARN.

La porción de ARN fue transferida a un tubo con 0,5 ml de alcohol isopropílico (Merck KGaA, Damstadt, Germany). La muestra fue agitada manualmente 10 veces por inversión, incubada durante 10 minutos a temperatura ambiente y, posteriormente, centrifugada a 14.000 rpm durante 10 minutos a 4º C. El pellet fue lavado con alcohol etílico 75% (Merck KGaA, Damstadt, Germany) en la proporción de 1 ml/1 ml de TRIzol^® y centrifugado a 7.500 rpm por 5 minutos a 4º C. Después de que se descartó alcohol etílico, el pellet fue secado 10 minutos a temperatura ambiente. El sedimento de ARN fue diluido en 30 µl de agua ultrapura e incubado 10 minutos a 60º C en baño María (Fanem mod 100, São Paulo, Brasil); ese procedimiento tuvo como finalidad inactivar la posible presencia de RNase.

El ARN fue analizado con auxilio de un espectrofotómetro (GeneCuant^® ARN/ADN Calculator, Amersham Pharmacia Biotech, Cambridge, England) por la absorbancia en 260 nm. La pureza del ARN fue constatada por la razón de las absorbancias en 260/280 nm. Las muestras cuyas razones fueron inferiores a 1,6 fueron descartadas por presentar contaminación por proteínas.

Verificación de la integridad del ARN por electroforesis

Muestras de 1,0 µl de ARN total diluidas en 8,0 µl de agua ultrapura y 1,0 µl de colorante (Orange G, Acros Organics, New Jersey, USA), fueron aplicadas en gel de agarosa 1% (0,3 g agarosa, 30 ml de TAE Buffer 1x, 3,0 µl de bromuro de etidio) y sometidas a un voltaje de 60 mV (Power Pac Basic^® Bio-Rad) durante 20 minutos. La integridad del ARN fue constatada por la visualización de las bandas de ARN ribosómico, 28S y 18S, y ausencia de rastros de ARN en el gel. Las muestras que se mostraron íntegras fueron utilizadas como substrato para la transcripción reversa.

Transcripción reversa del ARN (RT)

Las muestras de ARN del músculo cardíaco fueron sometidas a transcripción reversa por la acción de la enzima transcriptasa reversa, utilizando kit SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR^® (Invitrogen, Brasil, Son Paulo). Las muestras utilizadas en el experimento fueron incubadas en un termociclador (Mastercycler Gradient Eppendorf^® Hamburg, Germany). Inicialmente una mezcla conteniendo 1.000 ng/ml de ARN total, 1,0 ml de dNTP mix 10 mM, 1,0 ml de random hexamers (50 ng/ml) y 8,0 ml de H₂O DEPC (dietil pirocarbonato) fue incubada durante 5 minutos a 65º C. A continuación, después de adición de 9,0 ml de una solución conteniendo, 2,0 ml de tampón RT 10x, 4,0 ml de MgCl₂ 25 mM, 2,0ml de DTT 0.1 M y 1,0 ml de inhibidor de RNase, RNaseOUT ^®, la mezcla fue incubada por 2 minutos a 25º C. Después del agregado de 1,0 ml de la enzima SuperScript II^®, se procedió a nueva incubación de 10, 50 y 15 minutos a 25º C, 42º C y 70º C, respectivamente. Después de adición de 1,0 ml de RNase H la solución fue incubada 20 minutos a 37º C.

Para chequear la calidad de la transcripción reversa, fueron empleados los métodos:

1) Control positivo - El kit contiene un ARN transcrito a partir del gen de la cloranfenicol acetiltransferasa y primers controles A y B. Esos primers, en la reacción en cadena de la polimerasa, generan un producto de 500 pares de base (pb);

2) Control negativo - Para comprobar la ausencia de ADN genómico residual una muestra de ARN fue sometida a la reacción de RT, sin embargo la enzima SuperScript II^® fue substituida por 1,0 ml de H₂O DEPC. Ese producto fue utilizado en las reacciones de PCR y la ausencia de ADN genómico residual fue confirmada por la ausencia de productos de amplificación.

Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

Alícuotas de la reacción de RT conteniendo 2,0 µg de cADN fueron adicionadas a una mezcla conteniendo TaqMan^®Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems) y ensayo customizado conteniendo primers "sense" y "anti-sense" y sonda Taqman^® (Applied Biosystems, Foster City, CA,USA) específicos para cada gen, y el volumen completado para 25 ml con agua tratada con DEPC. Las reacciones fueron realizadas por triplicado para cada gen blanco en el Sistema Real Time PCR 7500 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Para cada muestra fue ploteado un gráfico de amplificación mostrando aumento del reporter dye fluorescente (ΔRn) en cada ciclo de la PCR. A partir de ese gráfico, fue determinado el ciclo donde la reacción cruza el umbral de detección (cycle threshold - C_T), basado en la variabilidad de los datos de la baseline obtenidos a partir de los ciclos iniciales de la PCR. Los primers para los genes analizados (cuadro 1) fueron obtenidos por medio del software Primer Expres^® (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), a partir de secuencias publicadas en el GenBank (www.pubmed.con). La cuantificación relativa de cada gen, normalizada por la referencia endógena (ciclofilina), fue realizada de acuerdo con el User Bulletin #2 (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA).

Análisis estadístico

Los resultados experimentales fueron expresados como media ± DE. Las comparaciones entre los grupos fueron realizadas por análisis de varianza (ANOVA) de de los factores, ejercicio y dieta, seguida con el test de Tukey. Las relaciones entre el ARNm de la SERCA2a, PLB, CQS, NCX, canal-L y RYR2 y receptores de las hormonas tiroideas, TR_β1 y TR α₁, fueron medidas por el coeficiente de correlación de Pearson. El nivel de significación fue de 5%.

Resultados

Las características generales de los animales están presentadas en la tabla 1. Los pesos corporales iniciales y las relaciones VD/PCF no fueron diferentes entre los grupos. Los animales con restricción, R₅₀ y EX₅₀, presentaron pesos corporales finales, del VI, VD, atrio y consumo de ración, significativamente inferiores a los respectivos controles (C vs R₅₀ y EX vs EX₅₀). Los animales entrenados, EX y EX₅₀, presentaron reducción en los pesos corporales finales en relación a los ratones C y R₅₀ respectivamente. Los ratones EX aumentaron el peso del atrio en relación a los animales C. La relación VI/ PCF aumentó significativamente en los animales EX₅₀ cuando fueron comparados a los animales EX.

La tabla 2 presenta los resultados de la evaluación del ARNm por la técnica de PCR en tiempo real. Se verificó que los animales R₅₀ aumentaron la expresión del NCX, canal de calcio-L y PLB y redujeron la expresión del TRα₁ en relación a los ratones controles. Los animales del grupo EX aumentaron la expresión del NCX, canal-L y del receptor TR_β1 en relación a los animales controles. La asociación del entrenamiento físico y RA, grupo EX₅₀, aumentó la expresión de la SERCA2a, NCX y PLB en relación a los animales EX y R₅₀. Además de eso, los animales EX₅₀ presentaron aumento en la expresión del TR_β1 cuando fueron comparados a los ratones R₅₀.

Los dosajes séricos de T₃, T₄ y TSH están presentados en la tabla 3. No hubo alteración en la concentración sérica del T₃ por la acción de la RA o entrenamiento físico. Los ratones entrenados, EX, no presentaron alteración de las concentraciones séricas de T₄ y TSH. Entre tanto, se verificó significativa reducción del T₄ y TSH en los grupos R₅₀ y EX₅₀ en relación a los respectivos controles (C vs R₅₀ y EX vs EX₅₀).

Los coeficientes de correlación y las significaciones entre ARNm de las estructuras del tránsito calcio y receptores de hormonas tiroideas están en la tabla 4. Están presentadas solamente las correlaciones positivas (r > 0,70) en el grupo EX₅₀, ya que el objetivo de ese estudio fue evaluar la asociación y entrenamiento físico y restricción alimenticia sobre la transcripción génica de estructuras moleculares envueltas en el tránsito de calcio y la influencia del eje HT - receptor en el miocardio. Así, los coeficientes de correlación para los grupos C, R₅₀ y EX fueron presentados para definir las participaciones de los factores ejercicio, restricción alimenticia y asociación entre los dos factores.

Se observó que el gen del TR_β1 presenta más correlaciones con las estructuras moleculares del tránsito de calcio que el gen TR_α1 (tab. 4). Aunque los ARNm del canal-L y PLB hayan presentado aumento significativo en los ratones EX₅₀, esos genes no presentaron correlación con los genes del TRα₁ o TR_β1 El ARNm de la rianodina tuvo significativa correlación con el ARNm del TR_β1 en todos grupos y fue mayor en la asociación de la RA con entrenamiento físico. El ARNm de la SERCA2a también presentó buena correlación con el ARNm del TR_β1 en los grupos R₅₀, EX y EX₅₀ a pesar de no ser estadísticamente significativo, lo que puede ser decurrente del bajo número de muestras. Los genes calsequestrina y NCX presentaron correlación con el ARNm TR_β1 y TRα₁, respectivamente, solamente en el grupo EX₅₀ indicando la dependencia de la asociación de los dos factores. Es interesante resaltar que el ARNm de la CQS y RYR2 presentaron fuerte correlación con TR_β1 en los animales EX₅₀. Entre tanto, no hubo aumento de expresión génica de la CQS y RYR2 en ese grupo. Contrariamente, el gen NCX aumentó, pero presentó correlación apenas con el gen TRα₁. El gen de la SERCA2a fue el único que presentó correlación con el ARNm de la TR_β1 y aumento en la expresión génica en los animales EX₅₀.

Discusión

El objetivo de este estudio fue evaluar la participación de las hormonas tiroideas en la asociación entre la severa restricción alimenticia y entrenamiento físico y la correlación entre los receptores de HT y la expresión génica de las estructuras moleculares envueltas en el movimiento de calcio intracelular del miocardio. Los resultados de este estudio mostraron que el entrenamiento físico asociado a la severa RA promovió aumento significativo del ARNm de la SERCA2a, del canal-L, de la fosfolamban y del intercambiador Na⁺/Ca⁺². Esas alteraciones fueron acompañadas por elevación en la expresión de los receptores de hormonas tiroideas (TR_β1) a pesar de que los niveles séricos de T₃ estaban normales y T₄ y TSH reducidos.

Los protocolos de RA y entrenamiento físico promovieron importantes alteraciones morfológicas (tab. 1). Las reducciones del peso corporal, peso del VD y peso del VI inducidas por la RA están asociadas al grado de restricción calórica. Restricción alimenticia, exceso de ingestión o estado de ayuno alteran el gasto energético y la composición corporal²⁵. La reducción del gasto energético durante la restricción alimenticia ha sido documentada y representa un mecanismo de conservación de energía, que previene la pérdida de peso corporal en exceso²⁵. Las cámaras cardíacas fueron reducidas en la misma proporción de la reducción de peso corporal, como es observado por las relaciones VI/PC y VD/PC. La disminución del peso corporal por el entrenamiento físico está asociada al aumento del gasto energético decurrente de las sesiones de entrenamiento físico; las relaciones VI/PC y VD/PC fueron mantenidas en relación al grupo control. La asociación del EF y RA intensificó la reducción de peso corporal, sin embargo preservó la masa del VI y del VD y mantuvo las relaciones VI/PC y VD/PC cuando fueron comparados con los ratones R₅₀. Así, los resultados referentes a las cámaras cardíacas indican que la RA promovió significativa reducción de la masa cardíaca y el entrenamiento físico, aislado o asociado a RA, no promovió hipertrofia cardíaca. Esos resultados fueron semejantes a los constatados en estudios anteriores¹⁰.

La RA, aislada o en ratones entrenados, redujo los niveles de T₄ y TSH, mientras que el entrenamiento físico no alteró los niveles séricos de los hormonas tiroideas. A pesar de que la RA redujo el nivel sérico de T₃ en 29% en ambos grupos (R₅₀ y EX₅₀), esa reducción no fue de magnitud suficiente para mostrar diferencia estadística entre los grupos. La ausencia de alteración en los niveles de T₃ puede ser decurrente del dosaje del T₃ total y no del T₃ libre, que es la forma activa de la hormona. Datos de literatura indican que, en estados de ayuno y severa restricción calórica, ocurren acentuado aumento de T₃ reverso¹³. Así es posible que la relación entre T₃ libre y T₃ reverso haya sido reducida en los animales sometidos a RA. Se cree que la privación de energía puede modular la concentración sérica de T₃ y reducir la actividad o concentración de yodotironina deiodinasa que convierte T₄ en T₃²⁶. La significativa reducción de los niveles séricos de T₄ y TSH inducido por la RA indica estado de hipotiroidismo, lo que también fue observado en estudios experimentales^8,13,27,28 y clínicos²⁹. El mecanismo responsable por la reducción de los niveles plasmáticos de las hormonas tiroideas inducida por la RA puede estar relacionado a la propia reducción en el consumo energético. La reducción de los niveles de hormonas tiroideas está relacionada al mecanismo de conservación de energía, una vez que esas hormonas son los principales responsables por el gasto energético²⁵. Considerando que el gasto energético es reducido en la restricción alimenticia, seria esperada reducción de los niveles de HT. El entrenamiento físico no promovió alteraciones en los niveles plasmáticos de las hormonas tiroideas. Este resultado difiere del observado por Iemitsu et al²² y Katzeff et al¹³, que verificaron aumento en los niveles séricos de T4. Esa discrepancia de resultados puede haber sido decurrente del tipo, intensidad y volumen de entrenamiento físico. En conclusión, mientras que la RA promovió el estado de hipotiroidismo, el entrenamiento físico parece no tener efecto directo sobre la acción de las hormonas tiroideas.

En el corazón de ratones, más de 70% de todos los receptores HT son TRα₁, con TR_β1 constituyendo apenas 30%³⁰. La hormona tiroidea se liga a elementos responsivos de tiroides (receptores de HT) en regiones promotoras de varios genes, regulando la transcripción de genes blanco en el corazón incluyendo intercambiador Na⁺/Ca⁺², rianodina, canal de calcio tipo-L y principalmente SERCA2a y fosfolambam³⁰. Esa regulación por el HT es un importante mecanismo en el proceso de contracción y relajación del miocardio³¹.

Los resultados de este estudio indican que el estado de hipotiroidismo inducido por la RA redujo la expresión del gen TRα₁, receptor predominante del miocardio. Ese resultado era esperado, una vez que la reducción de HT acarrea feedback negativo en el receptor HT. El entrenamiento físico, aislado o asociado a RA, aumentó la expresión del TR_β1 sin alterar los niveles de TRα₁. La escasa literatura sobre el papel de los receptores TRα₁ y TR_β1 en la transcripción génica de proteínas del tránsito de calcio del miocardio. Kinugawa et al²¹ mostraron que el TRα₁ está relacionado con transcripción de la a-MHC y síntesis proteica miocárdica, mientras que el TR_β1 está relacionado con SERCA2a, el propio TR_β1 e inhibición de la b-MCH. Así, nuestros datos sugieren que la reducción del gen TRα₁ por la RA podría ser un mecanismo asociado a la pérdida de masa cardíaca; la ausencia de hipertrofia en los animales entrenados podría ser decurrente de la manutención de los niveles de TRα₁.

Los efectos de las intervenciones, RA y EF, resultaron en alteraciones en el ARNm de las estructuras moleculares reguladoras del transito de calcio (tab. 2). El aumento de la SERCA2a y PLB en los ratones EX₅₀ observados en este estudio sugiere que el proceso de recaptura de calcio por el retículo sarcoplasmático (RS) puede estar facilitado. La explicación para esa hipótesis se basa en los datos referentes a los efectos de la RA que, aisladamente, promovió solamente aumento de la PLB indicando empeoramiento en el proceso de recaptura de calcio por el RS. Como ese proceso es dependiente de ATP y, en la severa restricción alimenticia, se necesita economía de energía, el aumento de la fosfolamban podrá acarrear reducción de la actividad de la SERCA2a. Cuando la RA fue asociada al entrenamiento físico hubo aumento proporcional de la SERCA2a y de la PLB, indicando que el entrenamiento físico protegió al miocardio de los daños provocados por la RA. La mejora en el proceso de recaptura de calcio por el RS inducido por el entrenamiento físico está de acuerdo con estudios de Kemi et al³² que observaron aumento de la recaptura de calcio en el miocardio decurrente de la elevación de la SERCA2a y fosfolamban fosforilada (PLB-thr17) en ratones entrenados. El aumento del canal de calcio-L observado en los animales EX₅₀ sugiere un aumento del influjo de calcio en el sentido de mejorar la respuesta contráctil. La elevación del gen NCX tendría como finalidad compensar el aumento del influjo de calcio por los canales lentos de calcio sarcolemal.

En este estudio no fue posible relacionar los receptores HT con las estructuras moleculares del tránsito de calcio en el miocardio de ratones entrenados y sometidos a severa RA, considerando que el test de correlación no mostró significación en el ARNm de la SERCA2a, PLB, NCX, canal-L con los receptores TRα₁ o TR_β1. Datos de literatura muestran asociación de las estructuras moleculares envueltas en el movimiento de calcio con receptores de HT inducidos por el entrenamiento o estado de hipotiroidismo; Iemitsu et al²² verificaron aumento significativo en la expresión de los receptores TRα₁ y TR_β1 acompañado de aumento en la expresión de la SERCA2a por el entrenamiento físico. En condiciones de hipotiroidismo, la insuficiencia de la tiroides está asociada a disminución de la SERCA2a y aumento de la fosfolamban²³, aumento en la expresión del NCX³³ y niveles de canal-L inalterados³⁴ o aumentados³⁵.

Los mecanismos moleculares para el aumento de la transcripción génica de la SERCA2, PLB y NCX en el ejercicio aislado o asociado a la RA aun no están aclarados; como fue citado anteriormente, nuestros hallazgos sugieren que los HT y/o receptores de HT no participan en la transcripción génica de las estructuras moleculares del tránsito de calcio en ese grupo de animales. El proceso de remodelación cardíaca es consecuente de estímulos extracelulares que activan señales citosólicas complejas, con números puntos de integración, y procesos transcripcionales nucleares. Entre los estímulos extracelulares los agonistas de receptores acoplados a proteína G (angiotensina, endotelinas, catecolaminas), citocinas y factores de crecimiento (IGF, TGF, FGF) son los principales candidatos que podrían, por lo tanto, estimular la transcripción génica de estructuras del movimiento de calcio^36,37. Entre tanto, no existen datos de literatura que permitan especular sobre los mecanismos responsables por el aumento de la transcripción génica de la SERCA2, PLB y NCX en la interacción ejercicio y restricción alimenticia.

Limitaciones del estudio

Nuestros hallazgos de expresión génica de ARNm obtenidos por medio de PCR cuantitativo de la SERCA2a, fosfolamban, intercambiador Na⁺/Ca⁺², canal de calcio tipo-L, calsequestrina y receptores de HT pueden no traducirse en formación de proteínas. Datos recientes obtenidos en nuestro laboratorio verificaron significativa reducción de la expresión proteica del canal tipo-L en ratones con severa RA, contrariando nuestros hallazgos de aumento de ARNm de la misma proteína¹⁴. Por lo tanto, la continuidad de esos hallazgos será la determinación de la expresión proteica por Western Blot. Tampoco fue posible establecer una relación de causa-efecto de los hormonas tiroideas y/o receptores de HT con el ARNm del tránsito de calcio; serían necesarios estudios con tratamiento de HT o utilizando animales monoclonales específicos para HT.

En conclusión, los datos del trabajo mostraron aumento de la expresión de ARNm de las estructuras moleculares envueltas en el movimiento intracelular de calcio en animales sometidos a severa restricción y entrenamiento físico. A pesar de que la asociación EF y RA induce estado de hipotiroidismo, el eje HT-receptor no parece participar de la transcripción del ARNm de las proteínas del transito de calcio del miocardio.

Potencial Conflicto de Intereses

Declaro no haber conflicto de intereses pertinentes.

Fuentes de Financiación

FAPESP financió el presente estudio.

Vinculación Académica

No hay vinculación de este estudio a programas de post grado.

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Ejercicio y restricción alimenticia aumentan el rnam de proteínas del tránsito de Ca²⁺ miocárdico en ratones

Mário Mateus Sugizaki^I,II; Ana Paula Lima-Leopoldo^II; Sandro José Conde^II; Dijon Salome Campos^II; Ricardo Damato^II; André Soares Leopoldo^II; André Ferreira do Nascimento^II; Silvio de Assis Oliveira Júnior^II; Antonio Carlos Cicogna^II

Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  27 Mayo 2011
• Fecha del número
  Jul 2011

Histórico

• Recibido
  07 Set 2010
• Revisado
  09 Set 2010
• Acepto
  25 Feb 2011