Investigação de variantes gênicas de canais iônicos em pacientes com síndrome do QT longo

Resumos

BACKGROUND: The long QT syndrome (LQTS) is an inherited arrhythmia syndrome with increased QT interval and risk of sudden death. Mutations in genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A account for 90% of cases with genotype determined, and genotyping is informative for genetic counseling and better disease management. OBJECTIVE: Molecular investigation and computational analysis of gene variants of KCNQ1, KCNH2 and SCN5A associated with LQTS, in families with the disease. METHODS: The coding regions of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A in patients with LQTS and their family members were sequenced and analyzed using Geneious ProTM software. RESULTS: Two families with clinical criteria for LQTS were investigated. The proband of Family A had QTC = 562 ms, Schwartz Score = 5.5. The genotyping identified the G1714A mutation in the KCNH2 gene. QTC = 521 ± 42 ms was observed in family members carrying the mutation against QTC = 391 ± 21 ms for non-carriers. The proband of Family B had QTc = 551 ms, Schwartz Score = 5.5. The genotyping identified the G1600T mutation, in the same gene. The analysis of family members revealed QTC = 497 ± 42 ms in mutation carriers, compared with QTC = 404 ± 29 ms in non-carriers. CONCLUSION: Two gene variants previously associated with LQTS were found in two families clinically diagnosed with LQTS. The prolongation of the QT interval was observed in all family members carrying the mutations. A strategy was developed to identify variants of genes KCNQ1, KCNH2 and SCN5A, making it possible to train technical staff for future application to diagnosis routine.

Long QT syndrome; ion channels; mutation; death sudden cardiac

FUNDAMENTO: El síndrome del QT largo (SQTL) es un síndrome arrítmico heredado con aumento del intervalo QT y riesgo de muerte súbita. Mutaciones en los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A responden por 90% de los casos con genotipo determinado, y el genotipaje es informativo para aconsejamiento genético y mejor manejo de la enfermedad. OBJETIVO: Investigación molecular y análisis computacional de variantes génicas de KCNQ1, KCNH2 y SCN5A asociadas a la SQTL en familias portadoras de la enfermedad. MÉTODOS: Las regiones codificantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A de pacientes con SQTL y familiares fueron secuenciadas y analizadas utilizando el software Geneious Pro®. RESULTADOS: Fueron investigadas dos familias con criterios clínicos para SQTL. La probanda de la Familia A presentaba QT C = 562 ms, Escore de Schwartz = 5,5. El genotipaje identificó la mutación G1714A en el gen KCNH2. Fue observado QT C = 521 ± 42 ms en los familiares portadores de la mutación contra QT C = 391 ± 21 ms de no portadores. La probanda de la Familia B presentaba QT C = 551 ms, Escore de Schwartz = 5. El genotipaje identificó la mutación G1600T, en el mismo gen. El análisis de los familiares reveló QT C = 497 ± 42 ms en los portadores de la mutación, contra QT C = 404 ± 29 ms en los no portadores. CONCLUSIÓN: Fueron encontradas dos variantes génicas previamente asociadas a la SQTL en dos familias con diagnóstico clínico de SQTL. En todos los familiares portadores de las mutaciones fue observada la prolongación del intervalo QT. Fue desarrollada una estrategia para identificación de variantes de los genes KCNQ1, KCNH2 y SCN5A, posibilitando el entrenamiento de personal técnico para futura aplicación en la rutina diagnóstica.

Síndrome del QT largo; canales iónicos; mutación; muerte súbita cardíaca

Investigação de variantes gênicas de canais iônicos em pacientes com síndrome do QT longo

Ernesto Curty^I; Fernando Eugênio dos Santos Cruz^II; Fabiane Santos Lima^I; Jorge Luiz Albuquerque Coutinho^II; Rosane Silva^III; Turán Peter Ürményi^III; Antônio Carlos Campos Carvalho^II,III; Edson Rondinelli^I,III

^IFaculdade de Medicina, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, RJ - Brasil

^IIInstituto Nacional de Cardiologia, Rio de Janeiro, RJ - Brasil

^IIIInstituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, UFRJ, Rio de Janeiro, RJ - Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTO: A síndrome do QT longo (SQTL) é uma síndrome arrítmica herdada com aumento do intervalo QT e risco de morte súbita. Mutações nos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A respondem por 90% dos casos com genótipo determinado, e a genotipagem é informativa para aconselhamento genético e melhor manejo da doença.

OBJETIVO: Investigação molecular e análise computacional de variantes gênicas de KCNQ1, KCNH2 e SCN5A associadas à SQTL em famílias portadoras da doença.

MÉTODOS: As regiões codificantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A de pacientes com SQTL e familiares foram sequenciadas e analisadas utilizando o software Geneious Pro^TM.

RESULTADOS: Foram investigadas duas famílias com critérios clínicos para SQTL. A probanda da Família A apresentava QTC = 562 ms, Escore de Schwartz = 5,5. A genotipagem identificou a mutação G1714A no gene KCNH2. Foi observado QTC = 521 ± 42 ms nos familiares portadores da mutação contra QTC = 391 ± 21 ms de não portadores. A probanda da Família B apresentava QTc = 551 ms, Escore de Schwartz = 5. A genotipagem identificou a mutação G1600T, no mesmo gene. A análise dos familiares revelou QTC = 497 ± 42 ms nos portadores da mutação, contra QTC = 404 ± 29 ms nos não portadores.

CONCLUSÃO: Foram encontradas duas variantes gênicas previamente associadas à SQTL em duas famílias com diagnóstico clínico de SQTL. Em todos os familiares portadores das mutações foi observado o prolongamento do intervalo QT. Foi desenvolvida uma estratégia para identificação de variantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A, possibilitando o treinamento de pessoal técnico para futura aplicação na rotina diagnóstica. (Arq Bras Cardiol. 2011; [online].ahead print, PP.0-0)

Palavras-chave: Síndrome do QT longo, canais iônicos, mutação, morte súbita cardíaca.

Introdução

A síndrome do QT longo (SQTL)^1,2 é uma doença genética com prevalência de 1:2000³ que cursa com risco de morte súbita por arritmias ventriculares em um coração estruturalmente normal⁴. O diagnóstico é feito através do escore de Schwartz⁵, que combina critérios eletrocardiográficos e da história clínica, classificando a probabilidade de SQTL em "baixa" (< 1) "intermediária" (2-3) e "alta" (> 4). Um escore de Schwartz > 4 tem especificidade > 99% para o diagnóstico da SQTL⁶.

Diferentes tipos de SQTL são provocados por variantes em genes de canais iônicos^7,8 e no gene da ankirina⁹. Atualmente são descritos 12 tipos¹⁰, porém os tipos 1, 2 e 3 respondem por 90% dos casos com genótipo identificado¹¹. Embora mais de 700 variantes tenham sido descritas¹², em 29% dos casos a base genética não foi identificada¹³. Os vários tipos de SQTL diferem quanto ao risco de morte súbita¹⁴, aos gatilhos para os episódios de arritmia^15,16 e a resposta ao tratamento farmacológico^17,18. Além disso, a gravidade depende da região afetada do canal¹⁹, o que torna a identificação da mutação importante para o manejo da doença.

Apesar do grande número de variantes envolvidas, a pesquisa de variantes gênicas associadas à SQTL (genotipagem) está sendo cada vez mais utilizada na prática clínica. Que seja de nosso conhecimento, nenhuma unidade do Sistema Único de Saúde realiza atualmente a genotipagem da SQTL. Por esta razão, foram investigadas variantes gênicas associadas à SQTL em duas famílias com diagnóstico clínico da doença. As condições de genotipagem dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A foram estabelecidas, e foi utilizada análise computacional para a identificação facilitada de mutações já descritas e de novos variantes gênicas na população brasileira.

Métodos

Pacientes

Pacientes encaminhados ao Instituto Nacional de Cardiologia com suspeita clínica de SQTL foram submetidos a anamnese e exame físico por um cardiologista com experiência em SQTL (FESCFº). Os eletrocardiogramas foram analisados independentemente por dois pesquisadores (EC e FESCFº), e a medida do intervalo QT realizada pelo método da tangente²⁰. Nenhum dos probandos apresentava sinais eletrocardiográficos de hipertrofia cardíaca, distúrbios da condução ou isquemia miocárdica. Probandos com escore de Schwartz > 4 e familiares em primeiro grau foram submetidos à análise molecular, num total de 29 indivíduos de duas famílias.

Extração de DNA e reação em cadeia da polimerase (PCR)

O DNA genômico era extraído de sangue periférico²¹. Os exons correspondentes às regiões codificantes dos 3 genes investigados eram amplificados por PCR utilizando os iniciadores previamente descritos^22,23. Os exons dos genes KCNQ1 e KCNH2 eram amplificados utilizando, respectivamente, os programas "B" e "C" previamente publicados por Syrris e cols.²⁴. Para amplificação dos exons 1A de KCNQ1 e 4 de KCNH2 era adicionado à reação o reagente PCRx Enhancer (Invitrogen), conforme as instruções do fabricante. Os exons do gene SCN5A eram amplificados utilizando condições por nós estabelecidas: 0,2 mM dXTP, 3 mM MgCl₂, 0,5 µM de iniciadores (senso+antissenso), 0,625 UI de Taq DNA polimerase recombinante (Invitrogen), 200 ng de DNA molde, em um volume final de 50 µl. O programa consistia em 94ºC/10min; 30 ciclos de 94ºC/1 min, 58ºC/1 min., 72ºC/2 min.; extensão final a 72ºC/10 min.

Sequenciamento automático de DNA

O sequenciamento de produtos de PCR purificados em filtros Millipore PCR Cleanup era realizado utilizando iniciadores senso ou antissenso, em um equipamento MegaBACE 1000 (Amersham Biosciences) com reagentes DYEnamic ET Dye Terminator Kit (GE Healthcare Life Systems) conforme as instruções do fabricante.

Análise das sequências obtidas para identificação das mutações

Foi utilizado o software Geneious Pro^TM25 para análise das sequências obtidas e geração de mapas de mutações já descritas para os genes estudados. Resumidamente, as sequências das regiões codificante e genômicas dos genes KCNQ1 (nº de acesso NM_000218 e NG_008935.1), KCNH2 (nº de acesso NM_000238 e NG_008916) e SCN5A (nº de acesso NM_000335 e NG_008934.1) foram importadas do GenBank e as mutações conhecidas (Inherited Arrhythmias Database¹²) adicionadas a estas no software com as respectivas referências bibliográficas. Em seguida foram assinalados os sítios de anelamento dos iniciadores, intrônicos em sua maioria, utilizados nas reações de amplificação e as porções centrais dos introns foram removidas para facilitar a análise. A comparação direta dos mapas de mutações com as sequências obtidas de pacientes permite visualizar simultaneamente a qualidade do sequenciamento e as mutações previamente descritas.

Considerações éticas

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Instituto Nacional de Cardiologia (processo nº 0187/4.01.08). Os pacientes e familiares foram informados dos objetivos e riscos do estudo e concordaram em participar do mesmo através de assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido.

Resultados

Foi realizada pesquisa de variantes gênicos de KCNQ1, KCNH2 e SCN5A em duas famílias com diagnóstico clínico de SQTL, incluindo na análise dois probandos e seus respectivos familiares, perfazendo 11 indivíduos na Família A e 17 na Família B. A análise dos variantes foi otimizada mediante criação de mapas de mutação com o software Geneious Pro^TM (dados não mostrados).

A probanda da Família A (Figura 1A, paciente A2.21), de 36 anos, começou a sentir palpitações aos 15 anos; aos 24 anos passou a apresentar episódios de palpitações seguidas de síncope desencadeados por estresse emocional, ruídos súbitos e no despertar, sendo feito o diagnóstico de SQTL. A probanda da Família B (Figura 1B, paciente B2.1) apresentava 42 anos e episódios de pré-síncope durante esforços físicos. A mesma buscou atendimento médico e recebeu o diagnóstico de SQTL após sua prima (#B2.9) apresentar um episódio de morte súbita abortada (MSA) em ambiente hospitalar. Os ECGs com medidas do intervalo QT das probandas estão mostrados na Figura 2. A paciente A2.21 apresentava QT_C = 560 ms (Figura 2A) e a paciente B2.1 QT_C = 551 ms (Figura 2B). Na história familiar da probanda A2.21 era possível identificar 10 casos de morte súbita em idades precoces, compatíveis com SQTL. (Figura 1A, destacado em verde). Na Família B havia somente um caso de MSA (#B2.9).

 

 

Os dados clínicos e eletrocardiográficos dos indivíduos de ambas famílias estão apresentados na Tabela 1. A Família A totalizava 9 mulheres e 2 homens, com idade entre 14 e 80 anos. A Família B continha 17 indivíduos (7 do sexo masculino), com idades entre 5 meses e 69 anos. Podem ser identificados 8 indivíduos com Escore de Schwartz>4, quatro na Família A (A2.21, A2.23, A3.2, A3.3) e 4 na Família B (B1.1, B2.1, B2.9, B3.1). Dois desses indivíduos (A2.21 e B2.9) apresentaram episódios de morte súbita abortada (MSA) e foram tratados com CDI + betabloqueador. Os demais (A1.10, A2.23, A3.2, A3.3, B1.1) eram assintomáticos e foram tratados com betabloqueadores isoladamente. Um dos casos de MSA (B2.9) apresentava intervalo QTC=448ms, entretanto, este ECG foi registrado na vigência do tratamento com betabloqueador, que pode reduzir o intervalo QT. Apenas um indivíduo (A1.10) apresentava probabilidade intermediária de SQTL (Escore de Schwartz = 2.5) e QT_C limítrofe (450 ms). A análise do heredograma sugeriu que esse indivíduo deveria ser portador de mutação causadora de SQTL, o que foi confirmado pela análise molecular. Apenas um indivíduo (A2.21) apresentava registro de Torsades de Pointes.

A análise molecular foi capaz de detectar variações previamente descritas do gene KCNH2 nas probandas de ambas famílias. Na probanda da Família A foram identificadas as variantes gênicas A1692G e G1714A, ambas no exon 8. Na probanda da Família B foram identificadas as variantes gênicas C1467T, C1600T, A1692G e T1956C. Todas as variantes encontradas são polimorfismos de único nucleotídeo (SNPs) e as pacientes são heterozigotas em todos os loci. Entretanto, as variantes gênicas G1714A (Família A) e C1600T (Família B), ambas no exon 8 do gene KCNH2, são SNPs do tipo não sinônimo (missence) e foram previamente descritas como associadas à SQTL. A identificação dessas variantes gênicas é destacada na Figura 3. As outras variantes encontradas são polimorfismos comuns e sem relevância clínica demonstrada¹².

As variantes missence G1714A e C1600T foram pesquisadas nos familiares dos probandos A2.21 e B2.1, respectivamente. Os resultados dessa genotipagem estão apresentados nas Figuras 1A e 1B. Na Família A o QT_C médio nos portadores da variante gênica era de 521 ± 42 ms, comparado a um QT_C médio de 391 ± 21 ms nos não portadores. Na Família B a média do intervalo QT_C nos portadores da variante era de 497 ± 42 ms, comparado com um QT_C médio de 404 ± 29 ms nos não portadores. Observa-se, portanto, que todos os portadores dos alelos G1714A e C1600T apresentam prolongamento do intervalo QT_C, confirmando a relevância clínica das variantes encontradas.

Discussão

Neste trabalho realizamos o sequenciamento completo das regiões codificantes dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A visando identificar as variantes gênicas associadas à SQTL em duas famílias contendo membros diagnosticados com a doença. A triagem de variantes gênicas na SQTL frequentemente é feita utilizando a técnica de SSCP (single strand conformation polymorphism), que requer maior trabalho manual e apresenta sensibilidade inferior à de sequenciamento.

As dificuldades de implementação em rotina de um método diagnóstico molecular de alta complexidade como a do SQTL nos levaram a desenvolver, utilizando o software Geneious Pro^TM, uma sequência de passos para identificar com precisão mutações novas e já descritas. Os recursos de manipulação e anotação de sequências desse software foram explorados para a construção de mapas de mutação indicando os locais com mutações descritas, permitindo o alinhamento das sequências dos diferentes genes obtidas dos pacientes com os mapas dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A construídos, facilitando a identificação de diferenças entre ambas sequências. O alinhamento realizado nesse programa permite, ainda, eliminar artefatos de sequenciamento. Caso uma variante gênica encontrada tenha sido previamente descrita como associada à SQTL, a referência bibliográfica da mesma estará prontamente disponível nas marcações do mapa. Além disso, o programa organiza os arquivos internamente em um sistema de pastas, de modo que os diversos arquivos de sequência originais ficam centralizados e indexados, o que é crucial quando se leva em conta o enorme volume de informação gerada para cada paciente. Dessa forma, a metodologia desenvolvida permite a análise das sequências de maneira eficiente e de fácil manuseio, reduzindo a chance de erros de interpretação e possibilitando o treinamento técnico de pessoal para a futura implementação de rotina dessa metodologia para a rede SUS.

A metodologia de análise molecular por nós estabelecida foi capaz de identificar variantes gênicas previamente associadas à doença em duas famílias selecionadas pelos critérios clínicos já definidos. Ambas as famílias investigadas apresentaram variantes associadas à SQTL no gene KCNH2, o que permitiu classificar ambas as pacientes como portadoras de SQTL tipo 2. Esse gene codifica a sub-unidade alfa do canal de potássio K_V11.1, responsável pela corrente I_Kr no potencial de ação cardíaco²⁶. A variante G1714A encontrada na Família A já foi previamente descrita²⁷ como associada à SQTL, e provoca a substituição do aminoácido glicina por serina na posição 572 da proteína, correspondente ao poro. Entretanto, as consequências eletrofisiológicas da mutação na atividade do canal iônico ainda não foram investigadas. A presença da variante gênica G1714A na família aqui descrita reforça a evidência em favor da patogenicidade dessa alteração. A variante gênica C1600T, encontrada na Família B, provoca a troca do aminoácido arginina por cisteína na posição 534 do polipeptídeo, correspondente ao sensor de voltagem do mesmo canal iônico²⁸. Além disso, em contraste à variante anterior, os efeitos dessa alteração foram investigados eletrofisiologicamente por Nakajima e cols.²⁹, que demonstraram redução do limiar de ativação do canal, aceleração da ativação e inativação, e redução da inativação do canal em repouso.

Curiosamente, o genótipo identificado foi o do subtipo 2 - o segundo mais frequente, respondendo por cerca de 30% dos casos. Por outro lado, embora essas famílias fossem portadoras do mesmo subtipo, e das variantes gênicas estarem bastante próximas (no mesmo exon, inclusive), a apresentação clínica da doença diferia entre as mesmas, talvez devido a alterações em diferentes regiões do canal iônico. A associação entre a região alterada na estrutura da proteína, e a gravidade da doença foi investigada por Moss e cols.¹⁹. Os autores demonstraram que as mutações na região do poro do canal codificado pelo gene KCNH2 estão associadas a um risco muito aumentado - cerca de 3 vezes maior - de eventos arritmogênicos. Um estudo de Shimizu e cols.³⁰ obteve resultados similares. Em conformidade com esses trabalhos, observamos uma gravidade muito maior da doença na Família A (mutação na região S5-Poro) que na Família B (mutação no segmento transmembrana S4 - sensor de voltagem). Entretanto, outro fator descrito que resulta em maior gravidade na apresentação clínica é a presença de mais de uma mutação causadora de SQTL (compound mutations), que ocorre em cerca de 2% dos casos³¹. Como não foram pesquisadas as variantes gênicas nos genes menos frequentemente associados à SQTL (SQTL tipos 4-12), não podemos excluir a possibilidade da Família A ser um caso desse tipo.

Foram encontrados portadores assintomáticos, mas não portadores silenciosos com ECG normal. Portadores silenciosos são descritos na SQTL^4,5,32, sendo mais comuns na SQTL1¹⁴. O indivíduo A1.10 é ilustrativo da complexidade da doença: embora seja portador da variante associada à doença, seu eletrocardiograma mostra um prolongamento apenas limítrofe do intervalo QT_C (450 ms) e seu Escore de Schwartz é igual a 2,5. Diversos fatores podem influenciar o intervalo QT - algumas doenças, as concentrações séricas de íons cálcio e potássio e diversos medicamentos - e dessa forma podem influenciar na apresentação da SQTL. Além disso, alguns trabalhos recentes demonstraram que polimorfismos comuns em genes de receptores adrenérgicos cardíacos são capazes de modular a duração do intervalo QT e a gravidade da apresentação clínica entre portadores da mesma mutação no gene KCNQ1³³. Portanto, a pesquisa de variantes gênicas na SQTL pode auxiliar na identificação de portadores assintomáticos com o intervalo QT limítrofe, e pode ser útil ao aconselhamento genético.

Conclusão

Foi realizada a investigação molecular de duas famílias com diagnóstico clínico de SQTL, tendo sido encontradas duas variantes gênicas distintas previamente associadas à doença. Foi implementada metodologia de amplificação e sequenciamento da região codificante completa dos genes KCNQ1, KCNH2 e SCN5A, e desenvolvido método computacional simplificado de análise das sequências para a pesquisa das variantes gênicas utilizando recursos do software Geneious Pro^TM, que facilita o treinamento de pessoal técnico para a futura aplicação dessa metodologia na rotina diagnóstica.

Potencial conflito de interesses

Declaro não haver conflito de interesses.

Fontes de financiamento

O presente estudo foi financiado pelo CNPq e parcialmente financiado pela FAPERJ.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Ernesto Curty pela Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro.

Artigo recebido em 23/08/10; revisado recebido em 23/08/10; aceito em 24/09/10.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  04 Fev 2011
• Data do Fascículo
  Mar 2011

Histórico

• Revisado
  23 Ago 2010
• Recebido
  23 Ago 2010
• Aceito
  24 Set 2010