Efeito do betacaroteno sobre o estresse oxidativo e a expressão de conexina 43 cardíaca

Resumos

BACKGROUND: Intervention studies have shown an increased mortality in patients who received beta-carotene. However, the mechanisms involved in this phenomenon are still unknown. OBJECTIVE: Evaluate the influence of beta-carotene on oxidative stress and the expression of connexin 43 in rat hearts. METHODS: Wistar rats, weighing approximately 100 g, were allocated in two groups: Control Group (n=30), that received the diet routinely used in our laboratory, and Beta-Carotene Group (n = 28), which received beta-carotene (in crystal form, added and mixed to the diet) at a dose of 500 mg of beta-carotene/kg of diet. The animals received the treatment until they reached 200-250g, when they were sacrificed. Samples of blood, liver and heart were collected to perform Western blotting and immunohistochemistry for connexin 43; morphometric studies, dosages of beta-carotene by high-performance liquid chromatography as well as reduced glutathione, oxidized glutathione and lipids hydroperoxides were performed by biochemical analysis. RESULTS: Beta-carotene was detected only in the liver of Beta-Carotene Group animals (288 ± 94.7 µg/kg). Levels of reduced/oxidized glutathione were higher in the liver and heart of Beta-Carotene Group animals (liver - Control Group: 42.60 ± 1.62; liver - Beta-Carotene Group: 57.40 ± 5.90; p = 0.04; heart: - Control Group: 117.40 ± 1.01; heart - Beta-Carotene Group: 121.81 ± 1.32 nmol/mg protein; p = 0.03). The content of total connexin 43 was larger in Beta-Carotene Group. CONCLUSION: Beta-carotene demonstrated a positive effect, characterized by the increase of intercellular communication and improvement of anti-oxidizing defense system. In this model, mechanism does not explain the increased mortality rate observed with the beta-carotene supplementation in clinical studies. (Arq Bras Cardiol. 2013; [online].ahead print, PP.0-0)

Beta Carotene; Oxidative Stress; Rats; Ventricular Remodeling

Efeito do betacaroteno sobre o estresse oxidativo e a expressão de conexina 43 cardíaca

Rosangela Novo; Paula S. Azevedo; Marcos F. Minicucci; Leonardo A. M. Zornoff; Sergio A. R. Paiva

Faculdade de Medicina de Botucatu - Universidade Estadual Paulista "Júlio de Mesquita Filho", Botucatu, SP - Brasil

^{Correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTO: Estudos de intervenção mostraram aumento da mortalidade em pacientes que receberam betacaroteno. Contudo, não são conhecidos os mecanismos envolvidos nesse fenômeno.

OBJETIVO: Avaliar a influência do betacaroteno sobre o estresse oxidativo e a expressão de conexina 43 em coração de ratos.

MÉTODOS: Ratos Wistar, pesando aproximadamente 100 g, foram alocados em dois grupos: Grupo Controle (n = 30), que recebeu a dieta usada de rotina em nosso laboratório, e Grupo Betacaroteno (n = 28), que recebeu betacaroteno (na forma de cristal, adicionado e misturado à dieta) na dose de 500 mg de betacaroteno/kg de dieta. Os animais receberam tratamento até que atingissem entre 200 e 250 g, quando eram sacrificados. Foram coletados sangue, fígado e coração para realização de Western blotting e imunoistoquímica para conexina 43; foram realizados estudos morfométricos, dosagens de betacaroteno por cromatografia líquida de alta eficiência bem como de glutationa reduzida, glutationa oxidada e hidroperóxidos de lipídeos por análises bioquímicas.

RESULTADOS: O betacaroteno foi detectado apenas no fígado dos animais do Grupo Betacaroteno (288 ± 94,7 µg/kg). Os níveis de glutationa reduzida/glutationa oxidada foram maiores no fígado e no coração dos animais do Grupo Betacaroteno (fígado - Grupo Controle: 42,60 ± 1,62; fígado - Grupo Betacaroteno: 57,40 ± 5,90; p = 0,04; coração: - Grupo Controle: 117,40 ± 1,01; coração - Grupo Betacaroteno: 121,81 ± 1,32 nmol/mg proteína; p = 0,03). O conteúdo de conexina 43 total foi maior no Grupo Betacaroteno.

CONCLUSÃO: O betacaroteno apresentou efeito benéfico, caracterizado pelo aumento da comunicação intercelular e melhora do sistema de defesa antioxidante. Nesse modelo, os mecanismos não explicam a maior mortalidade observada com a suplementação de betacaroteno em estudos clínicos. (Arq Bras Cardiol. 2013; [online].ahead print, PP.0-0)

Palavras-chave: Beta Caroteno / efeitos adversos, Estresse Oxidativo, Ratos, Conexina 43, Remodelação Ventricular.

Introdução

Junções comunicantes, ou gap junctions, são regiões de contato intercelular especializadas que conectam o citoplasma de células adjacentes, permitindo acoplamento elétrico e metabólico¹. Cada junção comunicante é constituída de proteínas chamadas Conexinas (Cx). Mais de 20 genes codificantes de Cx foram identificados. No coração, as três principais isoformas correspondem às Cx40, Cx43 e Cx45, sendo a Cx43 mais abundante entre miócitos atriais e ventriculares, e em partes distais do sistema de condução^2-4.

A redução da comunicação intercelular via junções comunicantes associa-se à ocorrência de arritmias cardíacas^5,6 e está presente em diversas situações em que o coração é submetido a algum tipo de agressão. Nesse sentido, já foi verificada alteração nas junções comunicantes em situações de remodelação ventricular, como hipertensão³, insuficiência cardíaca congestiva⁷ e infarto agudo do miocárdio⁸.

O betacaroteno é um carotenoide com atividade de pró-vitamina A, presente na dieta de seres humanos, em frutas e vegetais coloridos^9,10. Apresenta variedade de funções, incluindo ação antioxidante¹¹ e aumento da comunicação intercelular pelas junções comunicantes em diversos tipos de tecidos do organismo^9,12,13. No entanto, não se conhecem estudos que avaliaram os efeitos do betacaroteno em relação à Cx43 no coração.

Estudos de intervenção, delineados para testar a hipótese de que o betacaroteno protegeria os humanos contra o desenvolvimento de câncer ou de doenças cardiovasculares, mostraram aumento de mortes por doenças cardiovasculares nos grupos suplementados com o carotenoide^9,14-16. Adicionalmente, estudos realizados na Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX) mostraram que a suplementação da dieta de ratos com betacaroteno induziu remodelação ventricular, caracterizada por aumento do diâmetro sistólico do Ventrículo Esquerdo (VE) e diminuição das frações de ejeção e encurtamento ventriculares¹⁷. Além disso, em estudo que analisou os efeitos do betacaroteno antes do infarto em ratos normais e fumantes, observou-se que o ele aboliu o efeito paradoxal protetor do fumo induzido pelo cigarro¹⁸.

Assim, diante dos efeitos prejudiciais produzidos pelo betacaroteno no coração, o objetivo do presente estudo foi avaliar a influência do betacaroteno sobre o estresse oxidativo e a expressão de Cx43 em coração de ratos.

Métodos

O protocolo experimental foi aprovado pela Comissão de Ética em Experimentação Animal da da Faculdade de Medicina de Botucatu, estando em conformidade com os Princípios Éticos na Experimentação Animal, adotados pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal.

Foram utilizados ratos Wistar, machos, pesando aproximadamente 100 g. Os animais foram alocados, ao acaso, em dois grupos experimentais: Grupo Controle (C), formado por 30 animais, que receberam a dieta usada de rotina na Unidade de Pesquisa Experimental (UNIPEX); e Grupo Betacaroteno (BC), composto por 28 animais que receberam betacaroteno (na forma de cristal, adicionado e misturado à dieta) na dose de 500 mg de betacaroteno/kg de dieta. Os animais receberam tratamento até que os atingissem entre 200 e 250 g (entre 4 ea 5 semanas).

Após o fim do período de tratamento, os animais foram sacrificados com uma dose excessiva de anestésico (100 mg/kg de pentobarbital sódico) e, em seguida, foram coletados sangue, fígado e coração para realização do protocolo experimental.

Estudo morfométrico

Após eutanásia dos animais, os corações foram removidos e dissecados; os átrios e ventrículos foram separados e pesados. Os pesos do VE e do Ventrículo Direito (VD) foram ajustados pelo peso corporal final do rato e utilizados como índice de hipertrofia ventricular.

Amostras de tecido cardíaco foram fixadas em solução de formol a 10%, segundo método já descrito¹⁹. Após fixação, o tecido foi incluso em parafina, obtendo-se, a seguir, cortes de 4 µm. Os cortes histológicos foram corados em lâminas com solução Hematoxilina-Eosina (HE) para aferição das áreas da secção transversa dos miócitos, empregando-se microscópio Leica DM LS acoplado à câmera de vídeo, que envia imagens digitais ao computador dotado de programa de análise de imagens Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Foram mensurados 50 a 70 células por ventrículo analisado²⁰. Os miócitos selecionados estavam seccionados transversalmente e apresentavam forma arredondada e núcleo visível no centro da célula; eles se localizavam na camada subendocárdica da parede muscular do VE. Esse cuidado visou uniformizar ao máximo o conjunto de miócitos dos diferentes grupos. As áreas seccionais médias obtidas para cada grupo foram utilizadas como indicador do tamanho celular.

Para avaliação do interstício do miocárdio do VE, foram feitas lâminas com cortes histológicos coronais de 5 µm, corados pela técnica de Picrosirius red e específicos para visualização de colágeno. A leitura foi realizada utilizando-se microscópio Leica DM LS acoplado à câmera de vídeo, que envia imagens digitais ao computador dotado de programa de análise de imagens Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Silver Spring, Maryland, USA). Foram analisados 30 a 40 campos por ventrículo²⁰, utilizando-se objetiva de 40X. Os campos escolhidos estavam afastados da região perivascular.

Western blotting para Cx43

Os experimentos de Western blotting foram realizados segundo Rolim e cols.²¹, com algumas modificações²². Amostras de VE foram homogeneizadas em aparelho Polytron (Ika Ultra-Turrax^® T25 Basic, Wilmington, USA) com tampão de lise hipotônico (fosfato de potássio 50 mM; pH 7,0; sucrose 0,3 M; DTT 0,5 mM; EDTA 1 mM; pH 8,0; PMSF 0,3 mM; NaF 10 mM e inibidor de fosfatase) e centrifugadas (Eppendorf 5804R, Hamburg, Germany) a 12.000 rpm, durante 20 minutos, a 4ºC. A concentração de proteínas foi analisada pelo método de Bradford, utilizando curvas de BSA Protein Assay Standard (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) como padrão, com leituras a 595 nm de absorbância.

A corrida eletroforética foi realizada em gel bifásico de empilhamento (Tris-HCL 240 mM; pH 6,8; poliacrilamida 30%; APS e Temed) e de resolução (Tris-HCL 240 mM; pH 8,8; poliacrilamida 30%; APS e Temed), na concentração de 10% a 120V (PowerPac HC 3.0, Bio-Rad, Hercules, CA, USA) por 2 horas e 10 minutos. A transferência para membrana de nitrocelulose (Bio-Rad) foi realizada em sistema Mini Trans-Blot (Bio-Rad, Hercules, CA, USA), utilizando-se tampão de transferência (Tris 25 mM; glicina 192 mM; metanol 20% e SDS 0,1%). Após transferência, as membranas foram incubadas em solução bloquedora a 0,5% de leite em pó desnatado, dissolvido em tampão TBS pH 7,4 (Tris HCl 20 mM; NaCl 137 mM e detergente Tween 20 0,1%) por 2 horas, em temperatura ambiente. Após esse período, a membrana foi lavada três vezes em solução basal (Tris 1M pH 2,8; NaCl 5M e Tween 20) e incubada com os anticorpos primários diluídos na solução bloqueadora, sob agitação constante por 12 horas. Após incubação com anticorpo primário Mouse Monoclonal to GJA1 (Abcam) - para Cx43 total, na concentração de 1:250, e Mouse Monoclonal Anti-Connexin-43 (Zymed) - para Cx43 não fosforilada, na concentração de 3µg/mL, a membrana foi lavada em solução basal e incubada com o anticorpo secundário (1:10.000) IgG anti-mouse HRP (Sigma), em solução bloqueadora, por 2 horas em temperatura ambiente sob agitação constante.

A imunodetecção foi realizada por meio do método de quimioluminescência de acordo com as instruções do fabricante (Enhancer Chemi-Luminescence, Amersham Biosciences, NJ-USA).

O anticorpo de normalização utilizado correspondeu ao GAPDH, Mouse IgG1 (ABR, Affinity BioReagents, Golden, CO, USA) (1:10.000).

As análises quantitativas dos blots obtidos foram realizadas pelo programa Scion Image (Scion Corporation, Frederick, Maryland, EUA), em software livre, disponível no endereço http://www.scioncorp.com

Imunoistoquímica para Cx43

Os experimentos de imunoistoquímica foram realizados segundo Saffitz e cols.²³, com algumas modificações. Fragmentos do miocárdio ventricular esquerdo, fixados sucessivamente em formaldeído a 10% por 24 horas, água corrente por 24 horas e álcool 70º por 24 horas, foram emblocados em parafina e, em seguida, feitos cortes histológicos de 3 m. Em seguida, os cortes permaneceram em estufa a 60ºC, durante 24 horas. A desparafinização foi feita em banhos sucessivos de xilol, álcool 100º, álcool 95º e álcool 70º, seguida de hidratação em água destilada. Os cortes histológicos foram colocados em solução de ácido cítrico a 0,01M, pH 6,0 e submetidos a ambiente de micro-ondas por 10 minutos, para recuperação antigênica. Após resfriamento de 20 minutos, as lâminas foram lavadas em tampão fosfato de sódio (PBS) pH 7,2 e incubadas por 30 minutos em solução de albumina sérica bovina (BSA) a 3% (solução de BSA em PBS), para bloqueio de reações inespecíficas. Em seguida, foram incubadas overnight a 4ºC em câmara úmida com anticorpo primário (Rabbit Polyclonal Anti-Connexin 43; Abcam), na diluição de 1:100.

Após esse período, as lâminas foram lavadas em PBS, e os cortes foram incubados com anticorpo secundário (Texas Red anti-rabbit IgG; Vector), na diluição de 1:50, por 1 hora, em temperatura ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas em PBS e cobertas com meio de montagem, composto de glicerina tamponada e lamínula. Para cada bateria de reações de imunoistoquímica realizada (dez lâminas), o controle negativo correspondeu a uma lâmina de VE em que se omitiu o anticorpo primário.

A leitura foi feita utilizando-se microscópio equipado com unidade de epifluorescência (Carl-Zeiss, Inc. North America) acoplado à câmera de vídeo (AxioPlan 4.1; Carl-Zess Inc.) utilizando aumento de 40x. O filtro utilizado foi o verde (WG), com comprimento de onda de excitação a 550 nm e emissão a 650 nm.

Dosagens de betacaroteno

As concentrações de betacaroteno, no soro, foram quantificados segundo Yeum e cols.²⁴ e, no fígado e no coração, foram dosadas segundo Paiva e cols.²⁵. A metodologia utilizada foi a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC), com cromatógrafo Alliance 2695 (Waters) acoplado a detector PDA 2996 (Waters). A coluna analítica utilizada correspondeu a C₃₀ (Waters -YMC carotenoid: 4,6 x 150 mm; 3,0 µm). O betacaroteno foi quantificado pela determinação da área do pico da amostra/área pico do padrão interno. Os valores obtidos foram corrigidos quanto a perdas durante a extração e manipulação das amostras pela recuperação do padrão interno.

Estudo do estresse oxidativo

O estudo do estresse oxidativo foi realizado segundo Azevedo e cols.²⁶. Amostras de aproximadamente 200 mg de tecido (VE ou fígado) foram homogeneizadas com 5 mL de tampão fosfato de sódio 0,1M, pH 7,0, sob gelo, em homogeneizador. Os homogeneizados foram centrifugados (10.000 rpm) por 15 minutos, em centrífuga refrigerada a -4ºC. Os sobrenadantes obtidos foram utilizados para determinação da concentração de Glutationa Reduzida (GSH), Glutationa Oxidada (GSSG) e hidroperóxidos de lipídeos. As leituras espectrofotométricas foram obtidas em leitor ELISA (Biotek Instruments, INC) e em espectrofotômetro Pharmacia Biotech (England).

Determinação dos hidroperóxidos de lipídeos

Os hidroperóxidos de lipídeos foram determinados pela oxidação do Fe⁺² (sulfato ferroso amoniacal). O Fe⁺³ formado reage com alaranjado de xilenol, formando um composto colorido. As leituras foram realizadas com comprimento de onda de 560 nm.

Determinação da GSH e GSSG

A concentração de GSH (grupos SH não proteicos) foi determinada em tampão tris-HCl, pH 8,9, e 5,5'-dithiobis (ácido 2-nitro-benzoico), (DTNB) após prévia precipitação com ácido tricloroacético (TCA) 50%. Como padrão, foi utilizada GSH 1 mM²⁷. A concentração de GSSG foi determinada pela diferença entre GSH total e GSH reduzida, sendo a proporção estequiométrica (2GSH:GSSG)²⁸.

Análise estatística

Os resultados de cada variável, para cada grupo experimental, foram submetidos à verificação da normalidade e de igualdade de variância. Como em todas as comparações essas condições foram atendidas, foi realizado teste t de Student para análise das variáveis estudadas.

Resultados

No soro e no coração, não foi detectada presença de betacaroteno. No fígado, apenas os animais do Grupo BC apresentaram concentrações detectáveis desse carotenoide (288 ± 94,7 µg/kg).

Todos os animais apresentaram peso corpóreo entre 200 e 250 g, não havendo diferença estatisticamente significante entre os Grupos C e BC (Tabela 1). Os níveis de colágeno foram menores nos ratos suplementados com BC (Tabela 1).

Não se detectou diferença significante entre os Grupos C e BC quanto à localização e à intensidade de marcação (quantidade) para Cx43 (Figura 1 e Tabela 1). No entanto, o conteúdo de Cx43 total (fosforilada + não fosforilada) foi maior no Grupo BC quando comparado ao Grupo C (Figura 2).

As concentrações de GSH/GSSG foram maiores no fígado e no coração dos animais do Grupo BC em relação ao Grupo C. Quanto às demais variáveis, não se observou diferença estatística entre os grupos experimentais (Tabela 2).

Discussão

O presente estudo foi realizado para analisar os efeitos do betacaroteno sobre a comunicação intercelular e o estresse oxidativo em coração de ratos. Este estudo observou que esse carotenoide aumenta a expressão de Cx43 bem como a defesa antioxidante do coração.

Quanto aos efeitos antioxidantes do betacaroteno, vitaminas antioxidantes têm sido estudadas devido à sua capacidade de prevenir doenças crônicas, entretanto, o uso desses compostos em doenças cardiovasculares permanece controverso. Discrepâncias nos resultados obtidos podem ser relacionadas a características individuais ou às doses de antioxidantes utilizadas^29,30.

A ação antioxidante do betacaroteno é bem caracterizada na literatura. Em diversos estudos, com animais e humanos, ele oferece proteção contra danos oxidativos¹⁰. Também após injúrias cardíacas, o uso de antioxidantes tem efeito benéfico^31,32. Como o estresse oxidativo está envolvido na etiologia e na progressão de várias doenças crônicas no coração, antioxidantes como o betacaroteno são considerados importantes estratégias na prevenção dessas doenças^30,33. No presente estudo, o betacaroteno apresentou ação antioxidante, caracterizada pelo aumento da relação GSH/GSSG em coração e fígado de ratos, protegendo, assim, o sistema antioxidante total.

Outro efeito do betacaroteno, neste estudo, correspondeu à atenuação dos níveis de colágeno no tecido cardíaco. Em situações de agressão ao coração, é conhecida a participação de radicais livres no processo de remodelação ventricular^33-35, bem como a prevenção ou a atenuação desse processo, quando são utilizados antioxidantes^32,36.

Dentre as alterações morfológicas observadas durante o processo de remodelação, encontra-se a fibrose intersticial³⁷. Estudos mostram que o estresse oxidativo induz à síntese de colágeno, produzindo, consequentemente, fibrose no tecido cardíaco^34,36. Dentre os mecanismos, tem sido observado que os radicais livres induzem a expressão de TGF_β1, fator de crescimento que atua aumentando a síntese de colágeno, além de suprimir sua degradação no tecido cardíaco³⁶.

Este estudo está em consonância com tal conceito, já que a diminuição do estresse oxidativo foi associada à diminuição na quantidade de colágeno. Assim, pode-se sugerir que a atenuação dos níveis de colágeno, no presente estudo, tenha ocorrido devido à melhora do sistema antioxidante relacionado à suplementação da dieta com betacaroteno^10,12.

Quanto ao aumento da expressão de Cx43 no tecido cardíaco, induzido pelo betacaroteno neste estudo, este foi um achado de grande importância, uma vez que a estimulação da comunicação intercelular por carotenoides é bem documentada na literatura em outros tecidos, sendo considerada um dos mecanismos da ação preventiva contra o câncer^9,10,13. Além disso, tem sido mostrado que o betacaroteno aumenta a expressão de Cx43 em diversos tecidos, como fibroblastos humanos e de camundongo^38,39, linhagens celulares de adenocarcinoma de pulmão humano¹³ e células hepáticas de rato⁴⁰. Em relação ao efeito do betacaroteno na carcinogênese, os carotenoides, pelo aumento na expressão de Cx43, restauram a comunicação intercelular, efeito que se correlaciona à inibição do crescimento de células quimicamente transformadas⁹.

No presente estudo, o efeito de aumentar expressão de Cx43 induzido pelo betacaroteno ocorreu em corações não agredidos. Esse achado está em concordância com os demais resultados publicados na literatura, na qual é observado o aumento da expressão de Cx43 por ação desse carotenoide em vários tipos de tecidos do organismo^9,38. Assim, neste modelo experimental, a suplementação da dieta com o betacaroteno não se comporta como agressão, já que, em corações agredidos, observa-se redução da expressão de Cx43^3,7,8. Adicionalmente, essa alteração não explica o aumento de eventos adversos observados em estudos de intervenção com o betacaroteno.

Os mecanismos pelos quais o betacaroteno aumenta a expressão de Cx43 ainda não são completamente conhecidos. No entanto, é possível inferir que essa ação dos carotenoides não se deve exclusivamente à atividade de pró-vitamina A e nem à atividade antioxidante desses compostos. Essa afirmação se baseia no fato de que carotenoides sem atividade de pró-vitamina também exercem esse efeito e outros antioxidantes, como alfa-tocoferol, não o exercem¹⁰.

Em conclusão, o betacaroteno, no modelo experimental utilizado no presente estudo, apresenta efeito benéfico, caracterizado pelo aumento da comunicação intercelular e do sistema de defesa antioxidante.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: Novo R, Paiva SAR; Obtenção de dados: Novo R, Azevedo PS, Paiva SAR; Análise e interpretação dos dados: Novo R, Azevedo PS, Minicucci MF, Zornoff LAM, Paiva SAR; Análise estatística: Minicucci MF; Redação do manuscrito: Novo R, Minicucci MF, Paiva SAR; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: Azevedo PS, Zornoff LAM, Paiva SAR.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de tese de Doutorado de Rosângela Novo pela Faculdade de Medicina de Botucatu.

Artigo recebido em 23/4/13; revisado em 24/4/13; aceito em 27/5/13.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Ago 2013
• Data do Fascículo
  Set 2013

Histórico

• Recebido
  23 Abr 2013
• Aceito
  27 Maio 2013
• Revisado
  24 Abr 2013