Modulação da proliferação fibroblástica e da resposta inflamatória pela terapia a laser de baixa intensidade no processo de reparo tecidual

Resumos

FUNDAMENTOS: Ao longo dos anos, diversos estudos têm sido realizados para compreender o processo de reparo tecidual, bem como os possíveis efeitos da terapia a laser no processo de cicatrização de feridas. OBJETIVOS: Investigar o comportamento de feridas cutâneas provocadas na região dorsal de ratos Wistar (Rattus norvegicus), que foram submetidos ao tratamento com laser de baixa intensidade, com 3,8 J/cm² de dosagem, 15mW de potência e tempo de aplicação de 15s. MÉTODOS: Os animais (n = 12) foram divididos em dois grupos, um controle e outro tratado com laser. Foram realizadas, no grupo tratado, três aplicações (imediatamente após o ato cirúrgico, 48 horas e sete dias após a realização das feridas cirúrgicas). Dez dias após o ato cirúrgico foram colhidas amostras das lesões de ambos os grupos para realização de estudo histopatológico e histomorfométrico. RESULTADOS: Foram evidenciados aumentos da neovascularização e da proliferação fibroblástica, e diminuição da quantidade de infiltrado inflamatório nas lesões cirúrgicas submetidas à terapia com laser. CONCLUSÃO: Os resultados em conjunto sugerem que a terapia a laser de baixa intensidade é um método eficaz no processo de modulação da reparação tecidual, contribuindo significativamente para a cicatrização tecidual mais rápida e organizada.

Cicatrização de feridas; Ratos; Terapia a laser de baixa intensidade

BACKGROUND: Several studies have been performed to understand the tissue repair process as well as the possible effects of laser therapy in wound healing. OBJECTIVES: To study the behavior of skin wounds induced in the dorsal region of Wistar rats (Rattus norvegicus), which were submitted to the low-intensity laser therapy at 3.8 J/cm² dosage, 15mW potency, during 15 seconds. MATERIAL AND METHODS: The animals (n=12) were divided into two groups - control and laser-treated. The latter comprised three applications (immediately after surgery, 48 hours and 7 days after induction of surgical wounds). Ten days after surgery samples of the wounds were collected and submitted to histopathological and histomorphometric studies. RESULTS: Neovascularization, fibroblast proliferation and reduced inflammatory infiltrate in surgical wound submitted to laser therapy were demonstrated. CONCLUSION: Taken together, the results suggest that low-intensity laser therapy is an effective method to modulate tissue repair, thus significantly contributing to a faster and more organized healing process.

Laser therapy; low-level; Rats; Wound healing

INVESTIGAÇÃO CLÍNICA, EPIDEMIOLÓGICA, LABORATORIAL E TERAPÊUTICA

Modulação da proliferação fibroblástica e da resposta inflamatória pela terapia a laser de baixa intensidade no processo de reparo tecidual^*

Adeir Moreira Rocha Júnior^I; Rodrigo Guerra de Oliveira^II; Rogério Estevam Farias^III; Luiz Carlos Ferreira de Andrade^IV; Fernando Monteiro Aarestrup^V

^ICentro de Biologia da Reprodução – CBR - da Universidade Federal de Juiz de Fora. Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental, mestrando em Saúde Brasileira – Universidade Federal de Juiz de Fora - UFJF - Juiz de Fora (MG), Brasil

^IICirurgião-dentista da Faculdade de Odontologia - Universidade Federal de Juiz de Fora - UFJF - Juiz de Fora (MG), Mestre em Laser na Odontologia – Universidade de São Paulo - USP - São Paulo (SP), Brasil

^IIIPesquisador do Centro de Biologia da Reprodução – CBR - Universidade Federal de Juiz de Fora – UFJF - Juiz de Fora (MG) Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental, Doutor em Patologia pela Universidade Federal Fluminense - UFF - Niterói (RJ), Brasil

^IVFundação Instituto Mineiro de Estudos e Pesquisas em Nefrologia – Imepen - Juiz de Fora (MG), Doutor em Nefrologia pela Universidade Federal de São Paulo - UNIFESP - São Paulo (SP), Brasil

^VPesquisador do Centro de Biologia da Reprodução – CBR da Universidade Federal de Juiz de Fora - UFJF - Juiz de Fora (MG), Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental, Doutor em Patologia pela Universidade Federal Fluminense - UFF - Niterói (RJ), Brasil

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTOS: Ao longo dos anos, diversos estudos têm sido realizados para compreender o processo de reparo tecidual, bem como os possíveis efeitos da terapia a laser no processo de cicatrização de feridas.

OBJETIVOS: Investigar o comportamento de feridas cutâneas provocadas na região dorsal de ratos Wistar (Rattus norvegicus), que foram submetidos ao tratamento com laser de baixa intensidade, com 3,8 J/cm² de dosagem, 15mW de potência e tempo de aplicação de 15s.

MÉTODOS: Os animais (n = 12) foram divididos em dois grupos, um controle e outro tratado com laser. Foram realizadas, no grupo tratado, três aplicações (imediatamente após o ato cirúrgico, 48 horas e sete dias após a realização das feridas cirúrgicas). Dez dias após o ato cirúrgico foram colhidas amostras das lesões de ambos os grupos para realização de estudo histopatológico e histomorfométrico.

RESULTADOS: Foram evidenciados aumentos da neovascularização e da proliferação fibroblástica, e diminuição da quantidade de infiltrado inflamatório nas lesões cirúrgicas submetidas à terapia com laser.

CONCLUSÃO: Os resultados em conjunto sugerem que a terapia a laser de baixa intensidade é um método eficaz no processo de modulação da reparação tecidual, contribuindo significativamente para a cicatrização tecidual mais rápida e organizada.

Palavras-chave: Cicatrização de feridas; Ratos; Terapia a laser de baixa intensidade

INTRODUÇÃO

O reparo tecidual é um estado dinâmico que compreende diferentes processos, entre eles, inflamação, proliferação celular e síntese de elementos que constituem a matriz extracelular, como colágeno, elastina e fibras reticulares.¹ A síntese de colágeno é processo rápido e harmônico que tem seu início com a lesão intersticial e se estende até o final da fase de cicatrização, quando ocorre a remodelação dos tecidos.²

Os processos de cicatrização e reparo tecidual ocorrem após trauma ou doença.³ O reparo das feridas e sua reestruturação constituem mecanismo complexo, em que vários fatores contribuem para a criação de diversos tipos de cicatrização, como hipertrofia, atrofia ou normotrofia, da área lesionada. Esses processos compreendem três fases: inflamação, granulação e formação de matriz extracelular.⁴ Normalmente no processo de cicatrização de feridas, após o início do estágio de granulação, há sutil predominância de macrófagos e aumento do número de fibroblastos com síntese de nova matriz extracelular, ocorrendo a remodelação desses tecidos com a contração do tecido de granulação. Na fase de formação da matriz, os fibroblastos produzem quantidades abundantes de matriz extracelular. A síntese de colágeno ocorre no 21º dia posterior à lesão, e o retorno da pele ao aspecto normal, no 26º dia.⁵ Com a resolução da ferida e estando ela envolvida por tecido de granulação, ocorre significativa diminuição de macrófagos e fibroblastos, e a maturação da cicatriz torna-se relativamente acelular.⁶

O laser, amplificação da luz por emissão estimulada de radiação, originou-se da abreviação de Light Amplification by Stimulated Emission of Radiation, cuja teoria é do físico Albert Einstein, que em seu artigo “Zur Quantum Theories der Strahlung”, de 1917, expôs os princípios físicos da emissão estimulada (fenômeno laser), sendo este classificado como de “alta potência” (com potencial destrutivo) e em “baixa potência” (sem potencial destrutivo).⁷ Essa terapia foi utilizada primeiramente por Mester e colaboradores, que usaram o laser de argônio de 488 e 515nm. Subseqüentemente foi introduzido o hélio-neon (HeNe), laser que emite luz vermelha com comprimento de onda de 632.8nm, agora usualmente substituído por um aparelho de preço mais reduzido, mais potente, o laser de diodo, com comprimento de onda de 660-950nm.⁸ Os tratamentos experimentais em pacientes iniciaram-se na década de 1970 após relatos de resultados positivos da irradiação com a terapia a laser de baixa intensidade (TLBI) em culturas de células e em experimentos animais. Estudos realizados foram insuficientes para confirmar os efeitos benéficos da TLBI.^9,10 Efeitos positivos surgiram,¹¹ mas falharam devido ao grande número de intervenções e à insatisfatória qualidade da metodologia.

Diversos estudos têm sido realizados para compreender o processo de cicatrização de feridas, objetivando esclarecer os diferentes aspectos do tecido de granulação, da epitelização e da neoformação tecidual, bem como os possíveis efeitos da TLBI no processo de reparo tecidual. Mediante a análise histopatológica e histomorfométrica, este trabalho pretende avaliar o comportamento clínico-biológico de feridas cutâneas provocadas na região dorsal de ratos Wistar (Rattus norvegicus), que foram submetidos à TLBI. Particularmente, foram analisados os efeitos da TLBI sobre a angiogênese, a proliferação fibroblástica e o infiltrado inflamatório.

MATERIAIS E MÉTODOS

Animais

Foram utilizados 12 ratos Wistar (Rattus norvegicus), machos, entre seis e oito semanas de idade e peso variando de 160 a 220 gramas, provenientes do Biotério do Centro de Biologia da Reprodução (CBR) da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF/MG). O alojamento dos ratos, no CBR-UFJF, é provido de amplos basculantes telados e de dois exaustores, além de aquecedores de meio ambiente. A temperatura é mantida ao redor de 22ºC, pela ventilação natural no verão, e no inverno, com ajuda de aquecedores. A iluminação é mista – luz natural e lâmpadas fluorescentes controladas automaticamente para acenderem às 6h e apagarem às 18h. Os animais foram mantidos em gaiolas individuais de polipropileno, providas de camas de maravalhas selecionadas, mamadeira para água e cocho para ração do tipo peletizada, em condições de manutenção de acordo com os critérios do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, e submetidos a avaliações macroscópicas diárias para observação de sinais que evidenciassem infecção secundária.

Os animais foram divididos aleatoriamente em dois grupos, um (I) submetido à realização de feridas cutâneas cirúrgicas (n=6), e outro (II), à realização de feridas cutâneas cirúrgicas e à terapia a laser de baixa intensidade (n=6).

No protocolo de tratamento utilizado para este estudo o grupo I foi mantido como controle, e no grupo II foi realizado tratamento com laser, sendo o experimento executado por período de 10 dias.

Modelo experimental

A região dorsal dos animais foi depilada após anestesia com Ketamine (100ml/kg) + Xylazine (10mg/kg) via intraperitonial, e, com auxílio de um punch de aproximadamente 10mm de diâmetro, foi feita a remoção de um fragmento circular de tecido cutâneo.

O tratamento foi realizado com a utilização do laser de baixa intensidade (Twin Laser) com as seguintes características: laser de emissão infravermelha, pulsátil, semicondutores de arsênio e gálio, comprimento de onda de 870nm, potência de pico de 70mW, potência média de saída de 0,5 a 3,5mW e aplicação através de fibra ótica. A aplicação foi realizada pelo método de “varredura” na área central da ferida, permitindo assim seu tratamento uniforme. No grupo controle não se utilizou nenhuma forma de tratamento. No grupo II, as feridas experimentais foram submetidas à TLBI nos seguintes parâmetros: 15mW de potência, dose de 3,8J/cm² e 15s em cada uma de três aplicações, a primeira logo após o ato cirúrgico, a segunda 48 horas após o procedimento cirúrgico e a terceira sete dias após a realização da lesão cirúrgica.

Decorridos 10 dias do ato cirúrgico e após aplicação do laser, os animais foram sacrificados com sobredose de anestesia com Ketamine (100ml/kg) + Xylazine (10mg/kg) via intraperitonial. As amostras das lesões cutâneas foram colhidas de maneira a incluir parte da pele adjacente às bordas da ferida e de todo o tecido cicatricial em sua profundidade.

Histopatologia e histomorfometria

Todas as amostras das lesões cutâneas obtidas foram fixadas em formol tamponado a 10% (pH 7) por período mínimo de 24 horas. Após a fixação as amostras foram desidratadas gradativamente em concentrações crescentes de álcool etílico (70% a 100%), diafanizadas em xilol, embebidas e incluídas em parafina, conforme métodos histológicos de rotina. Os fragmentos incluídos em parafina foram cortados utilizando-se micrótomo modelo “820” Spence, obtendo-se seções de 6mm de espessura. As lâminas histológicas foram mantidas em estufa para secagem, e os cortes posteriormente submetidos à coloração por hematoxilina e eosina, para análise histológica.

A histomorfometria foi realizada através de imagens capturadas e avaliadas por sistema computadorizado de captura de imagens Axion Vision (Zeiss, Berlim, Alemanha). Foi realizada captura de imagens de quatro campos microscópicos aleatórios de cada lâmina histológica com câmera digital (aumento total 400x) do microscópio modelo Axiostar Plus (Zeiss, Berlin, Germany). As imagens foram arquivadas e submetidas à contagem de células inflamatórias, avaliação da proliferação fibroblástica, análise da angiogênese local e do diâmetro das áreas ulceradas das lesões ao final do experimento com auxílio de marcação digital.

Análise estatística

A análise estatística dos diversos parâmetros avaliados nos diferentes grupos foi realizada por método não paramétrico – Mann-Whitney, com nível de significância p<0,05.

RESULTADOS

A observação clínica das amostras das lesões cutâneas dos animais evidenciou pequena quantidade de coágulo sobre a superfície, com presença nítida de vasos sangüíneos na profundidade da hipoderme. Esses vasos, quando rompidos acidentalmente na região da derme ou hipoderme, preenchiam as lesões parcial ou totalmente com coágulos.

No 10º dia de pós-operatório, as lesões cutâneas do grupo I (controle) exibiam padrão de reparação tecidual em fase inicial, com formação de crosta de aspecto esbranquiçado, com bordas ligeiramente elevadas e centro avermelhado, devido à presença acentuada de irrigação sangüínea na área, o que indicava presença de tecido de granulação. Por outro lado, as feridas do grupo II, que foram submetidas ao tratamento com laser de baixa intensidade, apresentavam completa reparação tecidual, exibindo cicatriz com bordos evidentes e porção central ligeiramente desnivelada, porém, mostrando um adiantado restabelecimento morfofuncional dos tecidos envolvidos.

Os animais, colocados em gaiolas individuais em condições de manutenção de acordo com os critérios do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, foram submetidos a avaliações macroscópicas diárias e não apresentaram sinais que evidenciassem infecção secundária durante o experimento.

Na análise dos resultados histológicos, foram avaliadas duas áreas distintas, uma mais superficial, que envolvia proliferação epitelial, e a área de tecido conjuntivo abaixo da porção mais superficial da lesão. No grupo controle, junto à borda da ferida cirúrgica, observava-se discreta proliferação epitelial e, em praticamente toda a sua extensão, notava-se a presença de tecido exibindo ampla área de ulceração e material fibrino-necrótico sobre tecido de granulação (Figura 1). Já no grupo II, submetido à laserterapia, o estudo histopatológico evidenciou material exibindo epiderme íntegra revestindo tecido de granulação bem desenvolvido (Figura 2), com tecido conjuntivo rico em fibras colágenas orientadas paralelamente à superfície da ferida, determinando um processo de reparo tecidual mais organizado.

O gráfico 1 apresenta o diâmetro das áreas ulceradas no 10º dia de pós-operatório, tendo-se observado nos animais tratados redução significativa dos diâmetros das áreas ulceradas ao final do experimento, em relação ao grupo controle (p<0,05). Com relação à vascularização, os animais tratados apresentaram número significativamente maior de vasos sangüíneos por campo microscópico (Gráfico 2).

A análise histomorfométrica também demonstrou que os animais tratados com a TLBI apresentavam maior número de fibroblastos por campo microscópico (Gráfico 3), sendo que a identificação dos fibroblastos, baseada em critérios morfológicos, foi realizada por dois diferentes pesquisadores. Além disso verificou-se que a TLBI reduziu significativamente a intensidade do infiltrado inflamatório presente nas lesões submetidas ao tratamento (Gráfico 4).

DISCUSSÃO

A terapia a laser de baixa intensidade é método aceito pela Food and Drug Administration (FDA) como tratamento clínico eficaz para cicatrização de tecidos, por ser amplamente estudado.^12,13 Estudos in vitro sugerem que a TLBI facilita a síntese de colágeno,¹⁴ aumenta a motilidade dos queratinócitos,¹⁵ liberando fatores de crescimento,¹⁶ além de transformar os fibroblastos em miofibroblastos.¹⁷

Diversos estudos têm utilizado feridas superficiais para avaliar os efeitos da TLBI na cicatrização. Alguns usam úlceras de vários tamanhos e profundidades,^12,18,19 e outros têm desenvolvido modelos de feridas superficiais em animais.^20-22 Esses diferentes métodos têm produzido uma variedade de resultados e conclusões sobre os efeitos da TLBI. Neste estudo, observou-se que as lesões cirúrgicas submetidas ao tratamento com laser de baixa intensidade, quando comparadas com as lesões do grupo controle, mostraram processo de reparação tecidual mais evoluído, com maior contração das feridas e maior velocidade de migração epitelial.

Vários autores têm noticiado em estudos clínicos os benefícios da TLBI na cicatrização de tecidos, mas outros relatam a ausência desses efeitos.^20,23 Os dados conflitantes da literatura resultam em dúvidas plausíveis quanto a variações nos fatores de tratamento e limitações em projetos experimentais, incluindo comparação entre a clínica heterogênea das feridas, necessidade de grupos controle e as limitações encontradas com as investigações desses resultados contraditórios. A TLBI ainda é método controverso, como se depreende de numerosas publicações,^8,24,25 principalmente porque não se conhece seu mecanismo de ação.

O campo de ação do laser é muito amplo, e estudos vêm mostrando a contribuição no processo de reparo tecidual, particularmente a respeito da influência na modulação de certos tipos celulares no processo de cicatrização. Gómez-Villamandos et al evidenciaram aumento da cicatrização das feridas após terapia com laser, havendo aumento na atividade mitótica, número de fibroblastos, síntese de colágeno e neovascularização dos tecidos lesados.²⁶ Outros autores^16,27 observaram que a produção de fatores de crescimento fibroblástico (FGF) e o predomínio de fibroblastos em cultura aumentaram consideravelmente após irradiação com o laser de baixa intensidade. Adicionalmente, Bisht et al. relataram desenvolvimento do tecido de granulação e epitelização das feridas em ratos Wistar tratados com laser de HeNe.²⁸

No presente estudo, ao se avaliar a proliferação vascular, observou-se quantidade menor de vasos sangüíneos nas lesões cirúrgicas do grupo controle (Figura 3) quando comparadas com as do grupo tratado (Figura 4), em que ocorreu aumento na proliferação vascular nas amostras das lesões cirúrgicas. O que também foi observado ao se avaliar a proliferação fibroblástica em ambos os grupos. Nas amostras do grupo controle observou-se menor número de fibroblastos (Figura 5) quando comparadas com as do grupo tratado, que evidenciou aumento significativo na proliferação fibroblástica (Figura 6).

Adicionalmente, quando analisada a quantidade de células inflamatórias presentes nas lesões de ambos os grupos, observou-se número maior de células inflamatórias nas amostras do grupo controle (Figura 5) em comparação com as do grupo tratado (Figura 6), que evidenciavam diminuição significativa do infiltrado inflamatório.

Tais achados sugerem maior velocidade de reparo tecidual no grupo submetido à TLBI, traduzida por aumento da proliferação celular e da vascularização, além de diminuição expressiva no número de células inflamatórias.

CONCLUSÃO

Em conjunto, os resultados sugerem que a TLBI é eficaz na cicatrização tecidual verificada em modelo experimental de feridas cirúrgicas realizadas em ratos. Esse tipo de laserterapia mostrou efeitos positivos, acelerando a proliferação tecidual, aumentando a vascularização local e formando um tecido de granulação mais organizado.

Recebido em 22.08.2005.

Aprovado pelo Conselho Consultivo e aceito para publicação em 21.03.2006.

Conflito de interesse declarado: Nenhum

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Trabalho desenvolvido e realizado no Laboratório de Imunopatologia e Patologia Experimental do Centro de Biologia da Reprodução da Universidade Federal de Juiz de Fora - UFJF - Juiz de Fora (MG), Brasil.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Maio 2006
• Data do Fascículo
  Mar 2006

Histórico

• Aceito
  21 Mar 2006
• Recebido
  22 Ago 2005