Purificação de IgG de codorna a partir de soro e gema de ovos

Purification of Japanese quail IgG from serum and egg yolk

COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

Purificação de IgG de codorna a partir de soro e gema de ovos

Purification of Japanese quail IgG from serum and egg yolk

D.D. Oliveira^I; J.S. ResendeI, ^*; A.V.F. Flatschart^I; J.T. Abreu^II; R.B. Flatschart^I; N.R.S. Martins^I

^IEscola de Veterinária - UFMG - Caixa Postal, 567, 30123-970 - Belo Horizonte, MG

^IICurso de Medicina Veterinária - PUC - Betim, MG

Palavras-chave: codorna, imunoglobulina, gema de ovo, purificação, soro de codorna

ABSTRACT

The purification of Japanese quail IgG from serum was performed using caprilic acid and ammonium sulfate, and from egg yolk using PEG-6000 and ethanol. After confirming the purification and the concentration of IgG, the yolk samples had twice the amount of protein compared to serum samples. The IgG extracts were analyzed by SDS-PAGE and western blot showing similar results as the ones of chicken IgG used as the standard. So, these methodologies can be used for purifying quail serum or egg yolk IgG, which would enable the development of diagnostic assays.

Keywords: quail, immunoglobulin, egg yolk, purification, quail serum

A IgG é a imunoglobulina encontrada em maior concentração no soro das aves, pode passar para o ovo, conferindo imunidade passiva para o pintinho recém-eclodido (Rosenberg, 1996; Tini et al., 2002). A gema de ovo pode ser usada em testes sorológicos, porém, devido à grande quantidade de lipídeos presentes, os anticorpos precisam ser purificados (Tini et al., 2002). Os testes sorológicos convencionais utilizados para codornas (Coturnix coturnix japonica) têm sido baseados naqueles padronizados para galinhas (Gallus gallus formadomestica). Por isso, os objetivos deste trabalho foram a avaliação e a purificação de IgG, em amostras de soro e gema de ovos de codorna, para futura utilização em testes sorológicos.

A purificação de IgG do soro de codornas foi realizada segundo Bhanushali et al. (1994), com modificações. Foram usados 10mL de soro de codorna diluído a 1:5 em tampão acetato. A este material foi adicionado ácido caprílico na proporção de 25μL/mL de soro, mantido overnight a 4C. O sobrenadante foi removido após centrifugação a 10.000 x g (30min/4ºC), filtrado em membrana (0,2μm, Millipore) e diluído com PBS (pH 7,2) na proporção 1:10. Uma segunda precipitação foi feita adicionando-se solução saturada de sulfato de amônio tamponada (pH 7,0), até atingir 36% de saturação final. Após centrifugação a 10.000 x g (30min/4ºC), o pellet foi ressuspendido em 1mL de PBS (pH 7,2) e dialisado. As amostras foram armazenadas a 4ºC sem conservantes como sugerido por Otani et al. (1993).

A purificação de IgG da gema de ovos de codorna foi realizado segundo Akita e Nakai (1992), Abbassi et al. (1999) e Bizhanov e Vyshniauskis (2000).

Para obtenção de IgG, a mistura contendo clorofórmio, pool de gemas e água 18,2mΩ acidificada com HCl 0,1N (pH final 5,0 a 5,2), foi centrifugada a 3000 x g 30min/temperatura ambiente (TA) para separação das fases. A fase aquosa superior, que continha a IgG, foi coletada, e para cada 10mL desta fase aquosa foram adicionados 5mL de uma solução 36% (p/v) PEG-6000 (Sigma Aldrich - St. Louis, EUA), a mistura foi mantida em repouso por 30min (4ºC). O pelete, obtido por centrifugação a 3000 x g (10min/TA), foi ressuspendido em PBS (pH 7,2), em volume equivalente a 1% do volume original de gema utilizada. A precipitação da IgG foi realizada com etanol (-20ºC) numa mistura final de 50% (v/v) e centrifugação a 10.000 x g (30min/4ºC). O precipitado foi ressuspendido com PBS em 25% do volume do pool de gemas inicial, dividido em placas de Petri estéreis e colocado em estufa de 37ºC por 2h para a evaporação do álcool. Os sólidos foram ressuspendidos no mesmo volume inicial da gema com água 18,2m estéril, e a dosagem de proteína foi feita pelo método de Lowry, utilizando-se o kit protein assay¹.

Para confirmar o grau de pureza das amostras de IgG purificadas do soro e da gema de ovos de codornas, foi feita eletroforese em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) a 10%, corado com azul de Comassie (Makkay et al., 1999). Para confirmar a identidade das proteínas purificadas, se compatíveis coma massa molecular de IgG (Makkay et al., 1999), foi realizado o western blot.

Após bloqueio da membrana de nitrocelulose com leite em pó desnatado 3%, foi adicionado IgG de coelho anti-IgG de galinha (Sigma Aldrich), na diluição 1:5000, com posterior lavagem com PBS tween 20 0,5%. A revelação foi feita com o seguinte substrato: 10mL de tampão AP (Tris HCl pH 9,5, NaCl, MgCl₂) 64μL de nitro blue tetrazolium (Sigma Aldrich), e 34μL de BCIP (5-bromo, 4-chloro, 3 indolyl-phosphate (Promega Co.- Madison, EUA), mantido em agitação à TA até o aparecimento das bandas. Para interromper reação, o substrato foi descartado e a membrana lavada três vezes com água 18,2mΩ estéril por 15min.

Determinou-se a concentração de proteína das amostras de IgG purificada do soro e da gema de ovos de codorna. As amostras de IgG dos soros tinham, em média, 4939,4μg de proteína total/mL e as das gemas 7467,5μg de proteína total/mL. Na Tab. 1 mostram-se as concentrações de proteína (IgG) obtidas de cada amostra.

Pela análise de cada amostra de IgG purificada, observa-se que a concentração de proteínas decresce à medida que é feita uma nova centrifugação. As concentrações de proteína obtidas da purificação de IgG do soro e das gemas dos ovos de codorna apresentaram coerência com os resultados encontrados em estudos anteriores (Otani et al., 1993; De Meulenaer e Huyghebaert, 2001; Tini et al., 2002) para purificação de IgG de galinha.

Os resultados da eletroforese (SDS-PAGE) e western blot confirmaram a purificação das amostras (Fig. 1). Na eletroforese, verificou-se a separação das cadeias leve e pesada das imunoglobulinas do soro, com aproximadamente 25 e 65kDa, respectivamente, que coincidiram com o padrão de tamanho molecular utilizado (Fig. 1A). No SDS-PAGE, IgG purificada de gema, (Fig. 1A, canaletas 5 e 7), foi possível observar a presença das bandas, com tamanho molecular em torno de 45,5kDa, diferentes das cadeias leve e pesada de IgG da amostra padrão.

A membrana de western blot, revelada, confirmou a identidade das bandas das cadeias leve e pesada do gel de SDS-PAGE. Os dados encontrados de eletroforese assemelham-se aos resultados de De Meulenaer e Huyghebaert (2001), mostrando a eficiência dos processos de purificação para IgG do soro e da gema dos ovos de codorna. Provavelmente, devido à grande concentração de IgG na gema dos ovos de codorna, o processo de separação das cadeias leves e pesada da IgG não tenha sido totalmente eficiente, devido à presença de outra banda, com tamanho molecular em torno de 45,5kDa. Essa banda, provavelmente, refere-se à ovalbumina, proteína presente em grande quantidade na gema do ovo (Otani et al., 1993). Quando revelada a membrana de western blot, foi possível verificar a identidade das bandas das cadeias leve e pesada das IgG do gel de SDS-PAGE. Para confirmar os dados utilizou-se, também, da amostra de IgG de galinha comercial purificada. O padrão de bandas encontrado no SDS-PAGE e western blot foram semelhantes.

Com base nos dados de dosagem de proteína, foi comprovada a eficiência dos métodos utilizados para purificação de IgG de codornas a partir do soro e da gema de ovos.

Recebido em 2 de fevereiro de 2009

Aceito em 29 de janeiro de 2010

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  06 Maio 2010
• Data do Fascículo
  Abr 2010