Resultados preliminares da utilização de cultivos de anéis de traquéia para o estudo de estirpes brasileiras do vírus da bronquite infecciosa das galinhas

A preliminary use of tracheal organ cultures for evaluating Brazilian infectious bronchitis virus strains

Chicken; infectious bronchitis virus; tracheal organ culture

Galinha; vírus da bronquite infecciosa; cultivo de anéis de traquéia

COMUNICAÇÃO

[Communication]

Resultados preliminares da utilização de cultivos de anéis de traquéia para o estudo de estirpes brasileiras do vírus da bronquite infecciosa das galinhas

[A preliminary use of tracheal organ cultures for evaluating Brazilian infectious bronchitis virus strains]

E.O.B. Epiphanio, N.R.S. Martins*, J.S. Resende, R.G. Pinto, M.A. Jorge, M.B. Souza, J. Caccioppoli, R.M. Cardozo

Escola de Veterinária da UFMG

Caixa Postal 567

30123-970 - Belo Horizonte, MG

Recebido para publicação em 9 de dezembro de 2000

Recebido para publicação, após modificações, em 18 de fevereiro de 2002

*Autor para correspondência

E-mail: [e-mail]

O controle da bronquite infecciosa das galinhas (BIG) é difícil devido à existência de diversos sorotipos do vírus da BIG (VBIG). Isolados capazes de causar a doença em aves vacinadas foram identificadas por diversos autores (Cubillos et al., 1991; Gough et al., 1996). Com a possibilidade da existência de novos sorotipos, semelhante ao que ocorre em todo o mundo, ficou evidente a necessidade de estudos de classificação sorológica das amostras isoladas no país.

O teste de SN tem sido utilizado como prova definitiva para a classificação sorológica, podendo ser realizado em ovos embrionados de galinhas livres de patógenos específicos (OEG/SPF=ovos embrionados de galinhas livres de patógenos especificados), em cultivos primários de rins e em cultivos de anéis de traquéia (CAT). O CAT tem sido extensivamente usado para a identificação e análise de proteção cruzada para o VBIG e sua utilização é relatada como sistema alternativo confiável, rápido e simples, quando comparado com o uso de OEG/SPF (Cook et al., 1976b; Dhinakar & Jones, 1996). A facilidade de se determinar o end point pela parada de batimentos ciliares e deterioração do epitélio apresentada pela CAT, e também pela rapidez de ciliostase que amostras de VBIG causam nos anéis de traquéia, faz desse sistema biológico a melhor alternativa para o estudo do VBIG em provas de neutralização viral (Johnson & Marquardt, 1975). Além disto, o CAT é um método que restringe ao mínimo as mudanças antigênicas decorrentes de adaptação do VBIG ao cultivo laboratorial.

Este trabalho objetivou o estabelecimento da técnica de CAT no setor de doenças das aves da Escola de Veterinária da Universidade Federal de Minas Gerais (SDA/EV/UFMG), e sua avaliação para a titulação de VBIG, assim como em teste de SN, frente a soros monoespecíficos para estirpes de referência e isolados de campo brasileiros, cruzados com estirpes de VBIG de referência e vacinais.

A técnica utilizada para CAT, descrita por Darbyshire et al. (1976) e Cook et al. (1976b), foi adotada com modificações. Anéis de traquéias de embriões de galinhas livres de patógenos específicos (SPF), com 19-20 dias de incubação, foram cortados com lâmina esterilizada sobre superfície de papel filtro umedecido, com rendimento de 15 a 20 anéis por traquéia e colocados individualmente em tubo de ensaio de 16 X 150 mm com tampa de rosca, contendo 1ml do meio RPMI 1640 (Sigma-EUA.) adicionado de tampão Hepes (Sigma-EUA.) 20mM e antibióticos¹ (penicilina 100 UI/ml, estreptomicina 100 mg/ml e garamicina 50 mg/ml) e 5% de meio Hyclone (HyQ-CCM)¹, utilizado como substituto de soro fetal bovino. Para utilização dos CAT nos testes de neutralização, utilizou-se também 1,5% de alfa-metil-D-glicopiranosídeo(Sigma-EUA.) (Darbyshire et al., 1979; Lukert, 1973). Os tubos contendo os anéis de traquéia foram transferidos para aparelho rotativo de cultivo (roller) modelo CEL-GRO (Cel-Gro-Lab-Line-EUA), com 1,5 rotações por minuto, em câmara a 37ºC.

Os cultivos foram observados sob microscópio de luz invertida (Olympus-Japão.), verificando-se os batimentos ciliares na mucosa. Para a utilização foram selecionados apenas os anéis que apresentaram 50% ou mais da superfície com movimentação ciliar.

As estirpes do VBIG de referência M41 (sorotipo Massachusetts) e A5968 (sorotipo Connecticut) foram obtidas da ATCC (ATTCC - American Type Culture Collection, 112301 Parklawn Drive, Rockville – EUA), com autorização do Ministério da Agricultura do Brasil. A estirpe H120 (sorotipo Massachusetts) foi obtida de vacina comercial liofilizada.

Os soros de referência utilizados, específicos para as estirpes dos sorotipos Massachusetts (M41 e H-52) e Connecticut (A5968), e os soros contra as amostras isoladas de surtos de BIG no Estado de Minas Gerais (208, PM2, PM4, 29/78), provenientes de trabalhos anteriores desenvolvidos no SDA/EV/UFMG, foram preparados em galos SPF.

As titulações de VBIG em CAT foram feitas de acordo com Darbyshire et al. (1975), com o tempo de leitura estipulado em quatro dias (Cook) (Cook, J.K.A. – INTERVET, Reino Unido, 1998. (Comunicação Pessoal)..

A estirpe de VBIG H120 (sorotipo Massachusetts), de vacina comercial, foi usada para adaptação da técnica, sendo três repetições da sua titulação realizadas em CAT e comparadas com um mesmo número de titulações em OEG/SPF (Villegas & Purchase, 1980). A vacina foi reconstituída e feitas diluições logarítmicas decimais sucessivas, das quais 100ml foram inoculados em cinco repetições (tubos), com um anel em cada, após o meio ter sido drenado. Após repouso por uma hora, meio completo (RPMI 1640 com antibióticos, Hepes e HyQ-CCM) foi adicionado aos tubos para completar 1ml. Os tubos foram colocados no roller e incubados a 37^oC. Anéis de controle negativo somente receberam meio de cultura. As leituras foram realizadas em 24, 48, 72 e 96 horas, com microscópio de luz invertida⁴ para observação da atividade ciliar e elaboração dos escores. O título foi calculado conforme descrito por Reed & Muench (1938).

Os testes de SN foram estabelecidos com estirpes de VBIG de referência e com soros mono-específicos (M41 e A5968). Utilizou-se o método beta, no qual quantidades constantes de vírus, contendo 100 DC₅₀/0,1ml, foram misturadas a diluições logarítmicas em base 2 de soro conforme descrito por Cook (1984) e Johnson & Marquardt (1975). Os soros específicos contra os isolados de campo brasileiros e estirpes de referência (conservados liofilizados no SDA/EV/UFMG) foram reconstituídos em água destilada estéril, inativados (56^oC/30 minutos) e diluídos em RPMI 1640 a 1:4, a partir da qual foram feitas diluições logarítmicas em base 2. Para cada uma das diluições foi colocado um mesmo volume de vírus e soro (v/v), incubadas por 30 minutos e inoculados 0,2ml em cinco repetições de anéis previamente drenados do meio de cultura (Cook, 1984). Após repouso por uma hora a 37^oC, completou-se o volume para 1ml com meio completo adicionado de alfa-metil-D-glicopiranosídeo (Lukert, 1973). Controles foram mantidos para cada titulação e a contraprova da dose de 100 DC₅₀/0,1ml utilizada foi aferida pela retro-titulação. As leituras baseadas na ciliostase e destruição do epitélio ciliar foram realizadas como descrito previamente.

Os resultados das titulações das estirpes M41 e A5968 em CAT e H120 em CAT e em OEG/SF são apresentados nas Tab. 1 e 2, respectivamente, servindo de base para o cálculo das 100 DC₅₀ (doses ciliostáticas 50%) necessárias para a execução das provas de SN.

Durante a adaptação dos CAT, os cultivos foram desenvolvidos para viabilidade mínima de sete dias, período no qual houve permanência de batimentos ciliares com vigor normal, antes de serem utilizados para os estudos com VBIG. De modo geral os cultivos tiveram viabilidade de até 20 dias com apenas uma troca de meio, embora excepcionalmente alguns mantivessem atividade ciliar com pleno vigor até 63 dias. A qualidade do corte e adequação do meio de cultura podem ter sido definitivas para atingir viabilidade média de 86% dos anéis preparados, estes com mais de 50% da superfície ciliar em atividade. O meio RPMI 1640 adicionado de 5% de HyQ-CCM foi eficiente para o estabelecimento do CAT em nosso laboratório. O uso do roller (Cherry & Taylor, 1970) foi fundamental, não permitindo o acúmulo de muco e células mortas no lúmen dos anéis. Os CAT descritos por Cook et al. (1976b) foram mantidos a oito rotações por hora. Entretanto, neste trabalho, foram utilizadas 60 rotações por hora, por limitações do aparelho. Essas modificações aparentemente não interferiram nos resultados.

Os títulos do vírus foram considerados semelhantes dentro do mesmo sistema, pertencendo a um mesmo logarítmo (Tab. 1), enquanto que entre sistemas diferentes (Tab. 2) ocorreu superioridade dos OEG/SPF sobre CAT. Títulos mais altos em OEG/SPF podem ser esperados, considerando-se que a amostra vacinal H120 é adaptada e atenuada a este sistema (Cook et al., 1976a, Darbyshire et al., 1975). Os cultivos não inoculados mantiveram a atividade ciliar normal.

Os resultados encontrados na SN cruzada entre soros e vírus da BIG são apresentados na Tab. 3. Verificou-se que o soro específico contra a estirpe M41 neutralizou o seu vírus homólogo e não reconheceu o A5968. Em prova reversa, o mesmo ocorreu com o soro A5968 que neutralizou o vírus homólogo e não neutralizou o M41, possibilitando a tipificação das amostras referência (M41 e A5968) de acordo com a literatura (Cook et al., 1987; Darbyshire et al., 1979; Johnson & Marquardt, 1975). As retro-titulações confirmaram a utilização de 100 DC₅₀/0,1ml em todas as repetições.

Soros específicos contra isolados brasileiros de VBIG foram examinadas por SN em CAT frente às estirpes de VBIG de referência. Os soros contra 208, 29/78 e PM2 foram capazes de neutralizar M41, mas não A5968, sendo considerados homólogos ao sorotipo Massachusetts. O soro contra o isolado de campo PM4 não neutralizou as estirpes de referência testadas. O resultados com VBIG H120 foram coerentes, sendo neutralizado pelo soro para H120. Os resultados com os isolados de campo de VBIG estão de acordo com avaliação prévia em ELISA com anticorpos monoclonais anti-S1 de M41 (Martins et al., 1996).

Os resultados da SN cruzada ofereceram provas irredutíveis e adicionais da consistência do teste, em que a estirpe A5968 não foi neutralizada pelo soro específico contra M41, pois integram sorotipos distintos.

Os resultados dos estudos com o VBIG vacinal H120, estirpe classificada no sorotipo Massachusetts, adquirido de vacina comercial, foram surpreendentes. Essa estirpe não foi neutralizada pelo soro anti-M41 do mesmo sorotipo, sendo somente neutralizada pelos soros contra 208, 29/78 e H-52.

O processo de atenuação de VBIG para o desenvolvimento de vacinas, resultado da adaptação do isolado original em OEG/SPF, seleciona mutantes que, mais adaptados à OEG/SPF, possuem diferenças em regiões da glicoproteína S1 que também determina o sorotipo (Cavanagh et al., 1986). Essas diferenças podem estar sendo detectadas na prova de SN desenvolvida (Tab. 3), uma vez que o soro específico contra M41 não neutralizou H120. É importante destacar que estes resultados foram obtidos em três repetições independentes.

O soro PM4 não neutralizou as estirpes M41, A5968 e H120, podendo ser integrante de um sorotipo diferente dos testados, necessitando ainda ser testado com o seu vírus homólogo e também frente a um painel de soros contra estirpes de outros sorotipos.

Os testes de neutralização têm sido os métodos mais comuns para a classificação e avaliação de relacionamentos antigênicos de VBIG. A classificação de isolados de campo com a metodologia do CAT deve contribuir para o conhecimento do universo antigênico local e assim subsidiar a elaboração de programas de controle mais eficazes, seja pela utilização de vacinas específicas ou mesmo a produção de vacinas autóctones.

Palavras-chave: Galinha, vírus da bronquite infecciosa, cultivo de anéis de traquéia

ABSTRACT

Tracheal organ cultures (TOC) were prepared and used for evaluating four Brazilian isolates of infectious bronchitis virus (IBV). IBV field isolates and vaccine strains were titrated in TOC and results compared to those from chicken embrionated eggs. Serum neutralization (SN) employing IBV strain-specific serum was performed for evaluating relationships between isolates. Titration results of tests performed in TOC or eggs were in mutual agreement and were considered for validating the adapted TOC methodology as alternative for virological studies in our laboratory. Sera specific to M41 (Massachusetts) or A5968 (Connecticut) did neutralize their respective IBV strains only. Field strains 208 and 29-78 specific sera did neutralize Massachusetts serotype strains M41 and H120, but PM2 serum did only M41. Strain PM4 specific serum did not neutralize any of the reference IBV analyzed, including M41, A5968 and H120 and may indicate that the isolate is serologically different from the Massachusetts serotype, currently adopted for vaccine strains in Brazil.

Keywords: Chicken, infectious bronchitis virus, tracheal organ culture

• CAVANAGH, D.; DAVIS, P.J.; DARBYSHIRE, J.H. et al. Coronavirus IBV: virus retaining spike glycopeptide S2 but not S1 is unable to induce virus neutralizing or haemagglutination inhibiting antibody or induce chicken tracheal protection. J. Gen. Virol., v.67, 1435-1442, 1986.
• CAVANAGH, D.; NAQI, S.A. Infectious bronchitis. In: CALNEK, B.W.; BARNES, H.J.; BEARD, C.W. et al. (Eds.), Diseases of poultry. 10.ed. Iowa State University, 1997, p.511-526.
• CHERRY, J.D., TAYLOR, R. Large-quantity production of chicken, embryo tracheal organ cultures and use in virus and mycoplasma studies. Appl. Microbiol., v.19, p.658-662, 1970.
• COOK, J.K.A. Bronquite infecciosa aviária: situaçăo mundial e distribuiçăo de sorotipos. In: SIMPÓSIO SOBRE SANIDADE AVÍCOLA, 1997, Săo Paulo. Anais... Săo Paulo: Facta, 1997. p.13-27.
• COOK, J.K.A. The classification of new serotypes of infectious bronchitis virus isolated from poultry flocks in Britain between 1981 and 1983. Avian Pathol., v.13, p.733-741, 1984.
• COOK, J.K.A.; BROWN, A.J.; BRACEWELL, C.D. Comparison of the haemagglutination inhibition test and the serum neutralization test in tracheal organ cultures for typing infectious bronchitis virus strains. Avian Pathol., v.16, p.505-511, 1987.
• COOK, J.K.A.; DARBYSHIRE, J.H.; PETERS, R.W. Growth kinetic studies of avian infectious bronchitis virus in tracheal organ cultures. Res. Vet. Sci., v.20, p.348-349, 1976a.
• COOK, J.K.A.; DARBYSHIRE, J.H.; PETERS, R.W. The use of chicken tracheal organ cultures for the isolation and assay of avian infectious bronchitis virus. Arch. Virol., v.50, p.109-118, 1976b.
• CUBILLOS, A.; ULLOA, J.; CUBILLOS, V. et al. Characterization of strains of infectious bronchitis virus isolated in Chile. Avian Pathol., v.20, p.85-99, 1991.
• DARBYSHIRE, J.H.; COOK, J.K. A.; PETERS, R.W. Comparative growth kinetic studies of avian infectious bronchitis virus in different systems. J. Comp. Pathol., v.85, p.623-630, 1975.
• DARBYSHIRE, J.H.; COOK, J.K.A.; PETERS, R.W. Organ culture studies on the efficiency of infection of chicken tissues with avian infectious bronchitis virus. Br. J. Exp. Pathol., v.57, p.443-454, 1976.
• DARBYSHIRE, J.H.; ROWELL, J.G.; COOK, J.K. A. et al. Taxonomic studies on strains of avian infectious bronchitis virus using neutralization test in tracheal organ cultures. Arch. Virol., v.61, p.227-238, 1979.
• DHINAKAR, R.G.; JONES, R.C. An in vitro comparison f the virulence of seven strains of infectious bronchitis virus using tracheal and oviduct organ cultures. Avian Pathol., v.25, p.649-662, 1996.
• GOUGH, R.E.; COX, W.J.; GUTIERREZ, E. et al. Isolation of "variant"strains of infectious bronchitis virus from vaccinated chickens in Great Britain. Vet. Rec., v.139, p.552, 1996.
• JOHNSON, R.B.; MARQUARDT, W.W. The neutralizing characteristics of infectious bronchitis virus as measured by the constant-virus variable-serum method in chicken tracheal cultures. Avian Dis., v.19, p.82-90, 1975.
• LUKERT, P.D. Avian infectious bronchitis virus characteristics of an inhibitor found in serum. Arch. Ges. Virusforsch., v.40, p.93-104, 1973.
• MARTINS, N.R.S.; RESENDE, J.S.; SOUZA, M.B. et al. Avaliaçăo rápida parcial de isolados do vírus de bronquite infecciosa das galinhas. In: CONFERĘNCIA APINCO DE CIĘNCIA E TECNOLOGIA AVÍCOLAS, 1996, Săo Paulo. Anais... Săo Paulo: Facta, 1996. p.98.
• REED, L.J.; MUENCH, H. A simple method of estimating fifth percent end points. Am. J. Hyg., v.27, n.3, p.493-497, 1938.
• VILLEGAS, P.; PURCHASE, H.G. Titration of biological suspensions. In: ISOLATION AND IDENTIFICATION OF AVIAN PATHOLOGISTS. 2.ed. College Station: The American Association of Avian Pathologists, 1980. p.124-128.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Jul 2002
• Data do Fascículo
  Abr 2002

Histórico

• Aceito
  18 Fev 2002
• Recebido
  09 Dez 2000