Proteína p53 em nefroblastomas

p53 protein in nephroblastomas

PROTEÍNA P53 EM NEFROBLASTOMAS

P53 PROTEIN IN NEPHROBLASTOMAS

Ricardo Iwakura¹, Antonio Carlos Pereira Martins², Silvio Tucci Jr ³, Monica T. Pastorello⁴, Haylton Jorge Suaid³ , Adauto José Cologna³, João José Carneiro², Antônio D. Campos⁵

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO - USP

Departamento de Cirurgia –Disciplina de Urologia

Departamento de Patologia

Unitermos: p53, nefroblastoma, tumor de Wilms

Key words: p53, nephroblastoma, Wilms’tumor

Projeto financiado pela FAPESP – Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo, e pela FAEPA – Fundação de Apoio ao Ensino, Pesquisa e Assistência do HCFMRP-USP

Resumo: A imunoexpressão do antígeno p53 foi estudada em 35 pacientes com idade média de 38± 29 meses. Todos foram tratados com nefrectomia e quimioterapia, em 17 se associou também a radioterapia. O tempo médio de seguimento foi de 69± 66 meses. Em 5 deles a histologia era defavorável. Em 10 casos (28,5%) a marcação foi positiva, com ordem crescente de positividade para epitélio, blastema e estroma. Cinco pacientes faleceram da doença, nenhum deles com histologia desfavorável. Não se encontrou relação significante entre o padrão imunohistoquímico e os parêmetros seguintes: sobrevida dos pacientes, estádio e grau do tumor.

Introdução: O Tumor de Wilms, também chamado de nefroblastoma, é a neoplasia renal mais comum na infância, com incidência anual de 600 casos por ano nos EUA⁵. No Brasil, a incidência estimada pelo Instituo Nacional do Câncer no quinquênio 1976-80 foi de 543 casos. No HCFMRP-USP, com média de atendimento anual de 35.000 casos novos, 2,7 correspondem a portadores desta neoplasia.

Os nefroblastomas são constituídos de 3 linhagens celulares derivadas do blastema metanefrogênico, epitélio tubular e do estroma. A proporção desses componentes varia de um caso para outro e a histologia pode ser favorável ou não. Os tumores de histologia desfavorável incluem aqueles com áreas de anaplasia, os tumores rabdóides e os sarcomatosos.

Através da biologia molecular, particulamente da imunohistoquímica, vários estudos têm sido realizados na tentativa de se caracterizar esta técnica como um novo fator prognóstico para pacientes com nefroblastoma, através da identificação de clones celulares mais agressivos, o que poderia passar desapercebido pela histologia convencional. Dentre os antígenos ou marcadores muito estudados em imunohistoquímica pode-se mencionar o p53, os antígenos de proliferação celular, como o PCNA e o Ki-67(MIB-1). Alguns pesquisadores conseguiram correlacionar a imunoexpressão do p53 com um pior prognóstico⁴, porém , nem sempre os resultados são consistentes, quando não contraditórios³. O fato é que, nos últimos dois anos, somente dois trabalhos^1,2 relacionados ao p53 em nefroblastomas foram publicados, mostrando a necessidade de novos estudos para que se possa tirar conclusões mais seguras.

Neste trabalho, estudamos a marcação imunohistoquímica da proteína p53 em tumores de Wilms com o objetivo de analisar o padrão de marcação nos vários componentes histológicos, assim como de verificar se há relação entre este e a agressividade biológica do tumor.

MATERIAL E MÉTODOS

Casuística: Foram estudados os pacientes portadores de nefroblastomas que foram atendidos e operados no HCFMRP-USP no período de 1/1/79 a 31/12/98, e que atendiam aos requisitos seguintes:

a - continham informações clínicas nos respectivos prontuários que permitiam obter dados precisos sobre o estadiamento inicial, idade, sexo, cor da pele, tipo de tratamento, evolução e tempo de seguimento.

b - seguimento mínimo de 6 meses, assim como aqueles com seguimento inferior desde que tivessem falecido em conseqüência da doença.

c - tinham peças operatórias conservadas em formol e/ou em blocos de parafina.

Foram incluídos neste estudo 35 pacientes, dos quais 28 brancos, 3 negros e 4 mulatos, com idade média no momento do diagnóstico de 38± 29 meses. Todos foram submetidos à nefrectomia total e quimioterapia. Em 17 (48,5%) casos associou-se também a radioterapia. O tempo de seguimento pós-operatório variou de 6 a 240 meses (média: 69± 66 meses).

IMUNOHISTOQUÍMICA

Materiais e Métodos: As peças foram fixadas em formol a 10%, sendo clivadas em cortes com espessura ideal de 0,4cm. Realizou-se a desidratação com escala crescente de alcoóis (80^o, 90^o e 100^o); clarificação com solvente de parafina-xilol; impregnação em parafina seguida de inclusão em formas com parafina. Após isto, foi feita a microtomia em cortes de 5 micra; coloração de rotina de hematoxilina-eosina-floxina; montagem das lâminas em meios "entelan".

Os cortes para a imunohistoquímica foram mantidos em estufa (60^oC), desparafinados em xilol I, II e III por 5 minutos cada e passados em alcoóis decrescentes (10’ em álcool absoluto I, 10’em álcool absoluto II, 3’em álcool a 95% e 3’em álcool a 70%); lavagem em água corrente; as lâminas foram colocadas no suporte com tampão citrato (volume de 200ml para 20 lâminas). Para recuperação antigênica, foram ao forno microondas, na potência máxima por 7 minutos; feito esfriamento por 30 minutos. As lâminas foram secadas ao redor do corte, formando "janelas" e lavadas em PBS por 3 vezes, aspirando a cada lavagem; pingou-se H₂O₂ a 3% por 20 minutos; lavagem novamente em PBS por 3 vezes, aspirando a cada lavagem; foi colocado o soro normal por 20 minutos e em seguida, aspirado; incubação das lâminas no anticorpo primário DO-7 da Dako (anti-p53 a 1/50 diluído previamente em BSA e conservado a 4^oC) e homogeneização com movimentos pendulares com a mão; incubação por 2 horas, protegendo-se da luz. Após isto, foram lavadas em PBS (0,1M ph 7,4) por 3 vezes, aspirando a cada lavagem; incubação no anticorpo secundário (Mouse - Immunoglobulins Biotinylated , diluição 1/50) por 30 minutos, com homogeneização com soro normal; lavagem com PBS por 3 vezes, aspirando a cada lavagem. Incubação em estreptavidina, uma gota por corte, por 30 minutos, com homogeneização; lavagem em PBS por 3 vezes, aspirando a cada lavagem. Deixaram-de as lâminas em PBS 0,1M ph 7,4 enquanto se preparava o DAB (misturou-se 0,16ml da solução B na solução A). Aspiraram-se as lâminas e colocou-se o DAB, observando-se por 5 minuto e lavagem com PBS para inibir a continuição da reação se as lâminas coraram-se; lavagem em água corrente. Contracoramento com hematoxilina de Harris sem ácido por 30 segundos e lavagem com água corrente. Diferenciação com água amoniacal, lavagem, desidratação em álcoóis, difanização e montagem em entelan. Com pequenas modificações, a técnica utilizada seguiu as recomendações de Taylor et al.⁶.

As lâminas foram analisadas em microscópio (com câmera) acoplado a um microcomputador (KS 300 2.0). Pela revisão bibliográfica, constatamos que em trabalhos recentes³, a varredura das lâminas está sendo feita em 4 campos, contando-se o número de células coradas em 100 células em cada campo, na ocular 40´ . No nosso estudo, contamos o número de células coradas de 100 células, em 5 campos, na ocular 40´ . Fizemos a média aritmética dos números dos 5 campos, resultando em um valor percentual (por número de células) estimativo da marcação do determinado antígeno imunohistoquímico naquela peça operatória. Foram consideradas como positivas as lâminas que apresentaram marcação maior ou igual a 2/1000 células.

Os níveis de significância dos parâmetros analisados foram determinados pelo teste exato de Fisher considerando-se como limite o valor de 5%.

Resultados: A relação entre tipo de histologia e marcação imunohistoquímica encontra-se disposta na Tabela 1. Não se encontrou relação significativa entre essas 2 variáveis (p>0,05).

Observa-se que 10/35 (28,5%) dos tumores apresentaram células marcadas para a p53. As proporções de marcação encontradas nos diferentes componentes hsitológicos foram: túbulo – 1/19 (5,2%), blastema – 5/26 (19,2%) e estroma – 4/19 (21%).

A relação entre estádio tumoral e reatividade nuclear à p53 está exposta na Tabela 2. Essa relação não foi estatisticamente significante (p>0,05).

Durante o seguimento 5 pacientes faleceram todos de histologia favorável. Nenhum dos 5 casos com nefroblastoma de histologia favorável, todos com seguimento superior a 2 anos, faleceu. A Tabela 3 mostra a relação entre padrão de marcação e sobrevida, que não foi diferente do ponto de vista estatístico (p>0,05).

Discussão: Nossos resultados indicam que 28,5% dos nefroblastomas apresentaram marcação para a proteína p53. Na literatura esse percentual é referido entre 8,6 e 71%^1,5.

Não encontramos relação entre o tipo de histologia, estádio ou sobrevida e o índice de positividade para a p53, ao contrário do sugerido por outros autores^2,4. Nossos resultados confirmam a contradição sugerida em outros artigos³. Há várias hipóteses que poderiam explicar essa contradição: variações na amostragem ou casuística, nuanças da técnica imunohistoquímica utilizada, tipo de anticorpo utilizado, estado de conservação das amostras de tumor, critérios de leitura histológica ou de índice de positividade, por constituir análise da expressão de apenas 1 gene dentre um conjunto variável de mutações genéticas.

Embora o estudo aqui apresentado seja retrospectivo, não oferece indícios ou evidências de que a imunohistoquímica tenha alguma utilidade na determinação da agressividade biológica dos nefroblastomas.

Conclusão: Em 28,5% dos nefroblastomas detectou-se expressão imunohistoquímica da p53. Mas, não se conseguiu estabelecer relação entre a imunoexpressão desse marcador com o tipo histológico e estádio tumoral. Também não se encontrou associação entre a expressão dessa proteína com a sobrevida dos pacientes.

• 1. Argani P, Oerlman EJ, Breslow NE, Browning NG, Green DM, D'Angio GJ, Bedwith JB. Clear Cell Sarcoma of the Kidney, A Review of 351 Cases from the NWTSG Pathology Center. Am J Surg Pathol 2000;24:4-18.
• 2. Cheah PL, Looi LM, Chan LL. Immunohistochemical expression of p53 protein in Wilms' tumour: a possible association with the histological prognostic parameter of anaplasia. Histopathology 1996;28:49-54.
• 3. Defavery R. Avaliaçăo do gene p53 pelo método de PCR-SSCP em Linfomas, Tumores Sólidos e Leucemias Agudas da Infância. Tese apresentada ŕ FMRP-USP para a obtençăo do Título de Doutor em Medicina na Área de Pediatria. 1999.
• 4. Govender D, Harilal P, Hadley GP, Chetty R. p53 protein expression in nephroblastomas: a predictor of poor prognosis. Br J Cancer 1998;77:314-8.
• 5. P&S Journal. Winter 1995;15(1).
• 6. Taylor CR, Shi SR, Chaiwun B, Young L, Imam AS, Cote RJ. Strategies for improveing the immunohistochemical staining of various intranuclear prognostic markers in formalin-paraffin sections: androgen receptor, estrogen receptor, progesterone receptor, p53 protein, proliferating cell nuclear antigen, and Ki-67 antigen revealed by antigen retrieval techniques. Hum Pathol 1994;25:263-70.

1

Doutorando de Medicina da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto - USP

² Professor Titular do Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP

³ Professor Doutor do Departamento de Cirurgia e Anatomia da FMRP-USP

⁴ Médica Assistente do Departamento de Patologia da FMRP-USP

⁵ Professor Adjunto - Departamento de Medicina Social - FMRP -USP.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  26 Mar 2001
• Data do Fascículo
  2000