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Método para o estudo in vivo da angiogênese: indução de neovascularização na córnea de coelho

Method for in vivo study of angiogenesis: induction of neovascularization in the rabbit cornea

Resumos

A angiogênese é um processo de múltiplos degraus que conduz a formação de novos vasos sangüíneos a partir de capilares preexistentes e que participa em diversos processos fisiológicos e patológicos incluindo o crescimento tumoral e de metástases. Vários métodos têm sido desenvolvidos para estudar a angiogênese. A técnica de indução de vascularização na córnea do coelho foi uma das primeiras a serem desenvolvidas pelo grupo de Gimbrone e colaboradores. O principal objetivo deste trabalho foi descrever a técnica de indução de angiogênese na córnea do coelho, através do implante cirúrgico de "pellets" de polimetilmetacrilato (PMMA) contendo fator básico de crescimento fibroblástico (FCFb). Um "pellet" contendo 0.1 mig de FCFb foi implantado em uma das córneas e outro, sem FCFb, na córnea contralateral, como controle. A atividade angiogênica foi expressa por um índice, resultado da contagem do número de vasos e da medição de seu comprimento em milímetros. Os resultados mostraram que o FCFb induz crescimento vascular significativo a partir do sexto dia após o implante do "pellet" com atividade máxima no 15º dia. O PMMA sem FCFb não estimulou significativamente a vascularização. Esta técnica fornece uma nova opção de modelo para o estudo da biologia da angiogênese e para avaliação de drogas antiangiogênicas, usando "pellets" de polimetilmetacrilato (PMMA).

Córnea; Angiogênese; Neovascularização; Fator de crescimento de fibroblastos; Coelhos


Angiogenesis is a multi-step process that leads to the formation of new blood vessels from preexisting capillaries and is a key event in several physiological and pathophysiological processes including the tumor growth and development of metastases. Several in vitro and in vivo techniques have been developed for studying angiogenesis. The Rabbit Cornea Assay was one of the first, created by Gimbrone and coworkers. The main objective of this work was to describe the method of inducing angiogenesis in the rabbit cornea, by means of surgical polymethylmetacrylate pellet implantation containing a basic fibroblast growth factor (bFGF). Pellets with bFGF 0.1 mug were implanted in one cornea, while in the contralateral cornea pellets without bFGF was implanted as controls. The angiogenic activity was expressed as an angiogenic index resulted from the counting of the vessel number and the measurement of their length in millimeters. The results showed that bFGF induced a significant vascular growth into the corneal stroma at the sixth day after the pellet implantation reaching the maximal activity in the fifteenth day. The pellets with PMMA alone, did not stimulate a significant vascularization. This method can be readily implemented for the study of the pathophysiology in the angiogenic process and for the screening of new anti-angiogenic drugs.

Cornea; Angiogenesis; Neovascularization; Fibroblast growth factor; Rabbits


MÉTODO PARA O ESTUDO IN VIVO DA ANGIOGÊNESE: INDUÇÃO DE NEOVASCULARIZAÇÃO NA CÓRNEA DE COELHO1 1 Trabalho realizado no Laboratorio de Oncologia Experimental (LOE), Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).

Raimundo P. González 2 1 Trabalho realizado no Laboratorio de Oncologia Experimental (LOE), Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).

Albert Leyva3 1 Trabalho realizado no Laboratorio de Oncologia Experimental (LOE), Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).

Ramon Andrade Bezerra Melo4 1 Trabalho realizado no Laboratorio de Oncologia Experimental (LOE), Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).

Rafael Dias Marques Moreira 5 5 Professor de Oftalmologia da UFC.

Claudia Pessoa6 5 Professor de Oftalmologia da UFC.

Romulo Feio Farias7 5 Professor de Oftalmologia da UFC.

Manoel Odorico Moraes8 5 Professor de Oftalmologia da UFC.

González RP, Leyva A, Melo RAB, Moreira RDM, Pessoa C, Farias RF, Moraes MO. Método para o estudo in vivo da angiogênese: indução de neovascularização na córnea de coelho. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Jul-Sept;15(3). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

RESUMO: A angiogênese é um processo de múltiplos degraus que conduz a formação de novos vasos sangüíneos a partir de capilares preexistentes e que participa em diversos processos fisiológicos e patológicos incluindo o crescimento tumoral e de metástases. Vários métodos têm sido desenvolvidos para estudar a angiogênese. A técnica de indução de vascularização na córnea do coelho foi uma das primeiras a serem desenvolvidas pelo grupo de Gimbrone e colaboradores. O principal objetivo deste trabalho foi descrever a técnica de indução de angiogênese na córnea do coelho, através do implante cirúrgico de "pellets" de polimetilmetacrilato (PMMA) contendo fator básico de crescimento fibroblástico (FCFb). Um "pellet" contendo 0.1 mg de FCFb foi implantado em uma das córneas e outro, sem FCFb, na córnea contralateral, como controle. A atividade angiogênica foi expressa por um índice, resultado da contagem do número de vasos e da medição de seu comprimento em milímetros. Os resultados mostraram que o FCFb induz crescimento vascular significativo a partir do sexto dia após o implante do "pellet" com atividade máxima no 15o dia. O PMMA sem FCFb não estimulou significativamente a vascularização. Esta técnica fornece uma nova opção de modelo para o estudo da biologia da angiogênese e para avaliação de drogas antiangiogênicas, usando "pellets" de polimetilmetacrilato (PMMA).

DESCRITORES: Córnea. Angiogênese. Neovascularização. Fator de crescimento de fibroblastos. Coelhos.

INTRODUÇÃO

Tanto as células normais quanto as tumorais precisam de um adequado aporte de oxigênio e nutrientes para o seu desenvolvimento e proliferação. Os requerimentos nutritivos são fornecidos durante o crescimento tissular através de um processo de neovascularização. A neovascularização pode acontecer diante de dois tipos de mecanismos: a vasculogênese, definida como a diferenciação in situ de precursores mesodérmicos, em células endoteliais, que posteriormente organizam-se em um plexo capilar primário1, e por outro lado, através da angiogênese, que é definida como a formação de novos vasos sangüíneos por um processo de germinação de brotos endoteliais a partir de vasos capilares preexistentes 2.

A angiogênese é um mecanismo de múltiplos passos controlada por fatores ativadores e inibidores, que se desenvolve quando algum estímulo induz a mudança das células endoteliais de um estado de quiescência para um fenótipo de replicação e invasão (angiogenic switch) 3.

A importância da angiogênese está baseada no fato de que este processo é chave numa série de eventos fisiológicos como ovulação, formação do corpo lúteo e cura das feridas e em doenças como artropatias crônicas, psoríase, retinopatia proliferativa diabética, crescimento tumoral e disseminação metastásica 2,4, o que faz de todos os mecanismos que participam na angiogênese alvos promissores da terapêutica neste grupo de doenças chamadas angiogênese-dependentes.

Substâncias antiangiogênicas produzidas no próprio tumor são capazes de freiar o desenvolvimento de metástases em alguns tipos de tumores, o que confirmou as observações feitas anteriormente relacionadas com o incremento da agressividade das metástases após a exérese do tumor primário, esse fato, aumentou o interesse na procura de drogas que imitassem a ação de tais substâncias endógenas como são a Angiostatina e a Endostatina 5, 6, 9.

No esforço por procurar substâncias antiangiogênicas de distintas fontes, várias técnicas têm sido desenvolvidas. Além do método que utiliza a membrana corioalantóica de embrião (MCA)7, o ensaio na córnea de coelho (rabbit cornea assay) aparece como uma das mais usadas na atualidade 8.

Em particular, a córnea apresenta um tecido avascular e transparente que permite uma fácil visualização e quantificação da vascularização induzida no seu interior seja por fatores angiogênicos ou tecido tumoral 8.

O principal objetivo deste trabalho é apresentar a descrição detalhada da técnica de indução de angiogênese através de implantes de "pellets" de PMMA contendo FCFb que é lentamente liberado na córnea de coelho.

MÉTODOS

Considerações Gerais

Esta técnica consiste basicamente na estimulação de vascularização na córnea do coelho através da colocação de um "pellet" de polímero inerte, misturado com um fator de crescimento, num pequeno bolso feito cirurgicamente no estroma corneal. O estímulo angiogênico induz a formação de brotos capilares a partir da rede vascular existente na área córneo-escleral. Foram usadas como referência as metodologias descritas nos trabalhos de Gimbrone (1974)8 e Ziche (1994)10, (Figura 1). Compostos potencialmente antiangiogênicos podem ser testados pela via oral, sistêmica ou localmente, incorporados em "pellets" que podem ser colocados adjacentes ao indutor da angiogênese.

Figura 1.

Descrição da Técnica

I. Preparação do "PELLET"

O objetivo do "pellet" é favorecer a liberação lenta de um composto estimulador da angiogênese ou droga, no meio onde ele é implantado, neste caso o estroma corneal.

A literatura relata o uso principalmente de dois tipos de substâncias polímeras usadas para a preparação destes "pellets" de liberação lenta, o etilene-vinil acetato copolímero (Elvax) e o Polietilmetacrilato (PEMA) 10, 11.

Em nosso trabalho utilizamos para construir o "pellet" de liberação lenta, o Polimetilmetacrilato (PMMA), um polímero que é utilizado na área de Odontologia na preparação de próteses, entre outros usos.

Foram preparados "pellets" de tamanho 1 x 1 x 0,5 mm utilizando moldes de silicone. Inicialmente, o molde foi recheado com uma primeira camada de polímero a qual, foram adicionados 5 ml de uma solução de bFGF (basic fibroblast growth factor) equivalentes a 0,1 mg do fator, de maneira que a solução fosse absorvida pelo polímero e distribuída uniformemente. Permitiu-se que a mistura permanecesse em repouso o tempo suficiente para secar a solução. Posteriormente foi adicionada uma segunda camada de polímero no qual foi colocado o solvente (metilmetacrilato) deixando-se secar até a solidificação. "Pellets" sem fator de crescimento, isto é, apenas de polímero foram usados como controle.

Foram utilizados coelhos Nova Zelândia brancos de ambos sexos pesando entre 1,5 – 2,5 Kg, obtidos no biotério da UFC, os quais foram colocados individualmente em gaiolas adequadas para este tipo de animal, em condições ótimas de temperatura e umidade, com água e comida ad libitum.

II. Técnica de implante

Inicialmente os animais foram pesados e em seguida anestesiados com pentobarbital sódico (30 mg/ Kg) administrado nas veias central ou marginal da orelha (Fig. 1-A). Após a anestesia geral foi realizada uma anestesia retrobulbar com uma solução de xilocaína 2% em água estéril em proporção de 1:5 (v/v). Esta anestesia retrobulbar facilita a protusão manual do globo ocular que foi fixado manualmente e submetido a uma incisão de aproximadamente 1,5 - 2 mm de largura, na metade inferior da córnea, utilizado-se um bisturi oftálmico e tendo o cuidado de não perfurar a córnea ( Fig.1- B).

No passo seguinte foi realizada uma abertura no interior da córnea e na direção do limbo com espátula de Íris afiada. Esta abertura foi ampliada posteriormente com outro tipo de espátula maior e de ponta romba, até conseguir formar um bolso corneal de aproximadamente 2,5 –3 mm de comprimento e 2 mm de largura (Figs. 1-C,D e F).

Após a conclusão dos bolsos, os "pellets" foram colocados no interior destes usando uma pinça de dissecção de ponta fina (Fig.1-E). Esta técnica também permite o implante de células tumorais ou fragmentos de tumores na córnea.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados seguindo normas de assepsia e anti-sepsia. Não foram usados antibióticos ou outro tipo de droga além das mencionadas.

III. Quantificação da angiogênese

Partindo das experiências de outros autores que observaram que "pellets" implantados na córnea de coelho contendo outros fatores de crescimento em doses similares induzem um crescimento vascular significativo a partir do terceiro ou quarto dia após o implante, foram realizadas avaliações do crescimento neovascular nos dias 3, 6, 9, 12 e 15 contando a partir do dia da colocação do "pellet". A quantificação da angiogênese foi realizada conforme a metodologia descrita na literatura 10, utilizando um índice de angiogênese calculado da seguinte maneira:

Índice de Angiogênese = número de vasos x comprimento (milímetros)

  • Número de vasos: Durante cada avaliação foi feita a contagem de vasos visíveis ao nível do extremo distal da área vascularizada usando um microscópio cirúrgico DF Vasconcellos M-90, com aumento de 40x. Esta contagem foi convertida em valores de 1 – 5 segundo a seguinte escala: 1 = (0 – 25 vasos); 2 = (26 – 50 vasos); 3 = (51 – 75 vasos); 4 = (76 – 100 vasos); 5 = + de 100 vasos.

  • Crescimento vascular: Foi avaliado utilizando uma lente objetiva milimetrada, medindo o comprimento vascular entre o limite córneo-escleral e o extremo distal dos vasos. A margem de erro com esta lente entre dois observadores foi de 0,1 mm.

IV. Drogas e compostos

O polimetilmetacrilato (PMMA) e seu solvente o metilmetacrilato foram obtidos da Clássico Ltda, São Paulo e fornecido gentilmente pelo Dr. Marcus Aurélio Rabelo Lima-Verde da Faculdade de Odontologia da UFC. basic Fibroblastic Growth Factor foi obtido da Sigma Co, St Louis, MO, Pentobarbital Sódico (Sagatal) foi obtido da Rhone Merieux, Irlanda e a Xilocaína 2% da Astra Química e Farmacêutica Ltda, Brasil.

Análise Estatística

Os dados do índice angiogênico foram expressos segundo a média ± e.p.m. (erro padrão da média). As comparações entre dois grupos foram feitas usando o teste não paramétrico Mann Whitney onde p < 0.05 foi considerado como significativo.

RESULTADOS e DISCUSSÃO

O desenvolvimento no estudo da angiogênese tanto tumoral quanto inflamatória tem sido possível graças ao desenvolvimento de diferentes técnicas in vitro e in vivo . Além disso, essas técnicas permitiram a avaliação de produtos com atividade pró e antiangiogênica.

O objetivo do presente trabalho foi descrever o método de avaliação da angiogênese induzida na córnea de coelho pelo fator básico de crescimento fibroblástico (FCFb) fazendo algumas modificações no modelo original desenvolvido pelos grupos de Gimbrone8 e Ziche10. Essas modificações incluem o uso de um novo composto polimérico para a confecção dos "pellets" de liberação lenta, o polimetilmetacrilato (PMMA) que não tinha sido usado até então para estes fins, já que os polímeros mais comumente utilizados têm sido o ElVAX e o polietilmetacrilato (PEMA)11.

Por outro lado, não foi necessário o uso de fluoresceina ou qualquer outra substância para evidenciar os vasos sangüíneos como foi descrito por Gimbrone e Ziche, já que no trabalho destes autores foram usados extratos de tumores ou citocinas inflamatórias para estimular a vascularização corneal o que induziu a uma grande hiperemía na área vascularizada e opacificação corneal que dificulta a visibilidade dos vasos. Na técnica apresentada aqui usamos FCFb para estimular a vascularização corneal que é do tipo não inflamatória e por isso não se acompanha de hiperemia significativa nem opacidade corneal. Isso facilitou a visualização dos vasos e sua contagem.

Outro aspecto diferencial neste procedimento, foi o não puncionamento do globo ocular para diminuir sua tenção e facilitar a colocação do "pellet" como foi relatado no trabalho original de Gimbrone e colaboradores8, isto porque as possibilidade de furar o olho do animal aumentam com esta prática e também devido a que o "pellet" é suficientemente fino e consistente para ser colocado com facilidade no bolso pré-formado, sem necessidade de diminuir a tensão do globo ocular.

Os resultados aqui obtidos no desenvolvimento de angiogênese na córnea de coelho mostram que os "pellets" contendo bFGF produziram um crescimento vascular linear em relação ao tempo. Em geral, foi observada uma hiperemia com vasodilatação significativa na rede vascular córneo-escleral no terceiro dia após o implante enquanto o crescimento efetivo de brotos capilares foi obtido a partir do sexto dia (segunda avaliação) após o implante, neste ponto, os valores do índice angiogênico foram de 3,9 ± 0,4 e 0,1 ± 0,06 nos grupos com FCFb e controle respectivamente (p < 0.05). O extremo distal dos vasos atingiram o "pellet" no décimo segundo dia após o implante, enquanto o índice angiogênico chegou a um valor máximo no deecimo quinto dia após o implante do "pelet", 12,05 ± 1,3 (Figura 2).

Figura 2.

Na seqüência de fotos da figura 3 pode-se observar a progressão da vascularização induzida pelo FCFb na córnea do coelho. Os "pellets" sem fator de crescimento, ou seja, apenas com o polímero (PMMA), não induziram uma vascularização significativa.

Figura 3:

CONCLUSÕES

1. O fator de crescimento fibroblástico básico (FCFb) 0.1 m g/pellet induziu uma vascularização corneal significativa, com crescimento linear e resposta máxima 15 dias após o implante.

2. O polimetilmetacrilato (PMMA) é efetivo como polímero substituto do PEMA e do ELVAX na preparação dos "pellets" de liberação lenta.

3. A córnea de coelho fornece um tecido avascular e transparente onde a formação de novos vasos sangüíneos (angiogênese), estimulados por fatores pró-angiogênicos pode ser avaliada de forma fácil e precisa. Por isso esta técnica é um instrumento efetivo de pesquisa na fisiopatologia da angiogênese e no "screening" de drogas antiangiogênicas.

AGRADECIMENTOS

Os autores deste trabalho agradecem a Francisco E. Gonçalves Lima pela assistência técnica.

González RP, Leyva A, Melo RAB, Moreira RDM, Pessoa C, Farias RF, Moraes MO. Method for in vivo study of angiogenesis: induction of neovascularization in the rabbit cornea. Acta Cir Bras [serial online] 2000 Jul-Sept;15(3). Available from: URL: http://www.scielo.br/acb.

ABSTRACT: Angiogenesis is a multi-step process that leads to the formation of new blood vessels from preexisting capillaries and is a key event in several physiological and pathophysiological processes including the tumor growth and development of metastases. Several in vitro and in vivo techniques have been developed for studying angiogenesis. The Rabbit Cornea Assay was one of the first, created by Gimbrone and coworkers. The main objective of this work was to describe the method of inducing angiogenesis in the rabbit cornea, by means of surgical polymethylmetacrylate pellet implantation containing a basic fibroblast growth factor (bFGF). Pellets with bFGF 0.1 mg were implanted in one cornea, while in the contralateral cornea pellets without bFGF was implanted as controls. The angiogenic activity was expressed as an angiogenic index resulted from the counting of the vessel number and the measurement of their length in millimeters. The results showed that bFGF induced a significant vascular growth into the corneal stroma at the sixth day after the pellet implantation reaching the maximal activity in the fifteenth day. The pellets with PMMA alone, did not stimulate a significant vascularization. This method can be readily implemented for the study of the pathophysiology in the angiogenic process and for the screening of new anti-angiogenic drugs.

SUBJECT HEADINGS: Cornea. Angiogenesis. Neovascularization. Fibroblast growth factor. Rabbits.

Endereço para correspondência:

Manoel Odorico Moraes, MD, PhD

Rua Cel. Nunes de Melo 1127, CP:3157

Fortaleza - CE

60431-970,

Tel: (85) 288-8201 Fax: (85) 288-8333

Data do recebimento: 18/06/2000

Data da revisão: 20/07/2000

Data da aprovação: 12/08/2000

2Aluno do Curso de Mestrado em Farmacologia, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC.

3 Professor de Farmacologia da Universidade do Missouri, USA.

4 Aluno do Curso de Medicina da UFC.

6 Professora de Fisiologia, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC.

7 Aluno do Curso de Doutorado em Farmacologia, Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC.

8 Professor de Farmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC.

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  • 1
    Trabalho realizado no Laboratorio de Oncologia Experimental (LOE), Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC).
  • 5
    Professor de Oftalmologia da UFC.
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      04 Set 2000
    • Data do Fascículo
      Set 2000

    Histórico

    • Aceito
      12 Ago 2000
    • Revisado
      20 Jul 2000
    • Recebido
      18 Jun 2000
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