OCORRÊNCIA DO HERPESVIRUS BOVINO 1 (BOHV-1) NO LÍQUIDO FOLICULAR E CÉLULAS EPITELIAIS DE OVIDUTO BOVINO

OCCURENCE OF BOVINE HERPESVIRUS 1 (BoHV-1) IN FOLICULAR FLUID AND EPITHELIAL CELLS OF BOVINE OVIDUCT

RESUMO

O objetivo desse estudo foi verificar a ocorrência do herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) no líquido folicular de ovários e células epiteliais de oviduto bovino colhidos de abatedouro. Foi realizada a reação de polimerase em cadeia (nested PCR) das amostras resultantes de 12 colheitas, utilizando primers que amplificam o gene da glicoproteína B (gB) do BoHV-1. Uma amostra de líquido folicular apresentou reação positiva enquanto as amostras de células epiteliais de oviduto bovino apresentaram reações negativas. Este resultado é de grande relevância, pois o BoHV-1 constitui um risco para a produção in vitro de embriões, tendo como conseqüência a mortalidade embrionária que é uma importante causa de falha reprodutiva e tem profundo impacto na produção animal.

PALAVRAS-CHAVE
BoHV-1; líquido folicular; nested PCR

ABSTRACT

The objective of that study was to verify the incidence of the bovine herpesvirus type 1 (BoHV-1) in follicular fluid and bovine oviduct epithelial cells of slaughterhouse animals. There were 12 collections and a total of 138 ovaries, after extraction with the protein k enzyme, the samples were amplified, and internal fragment of the gene of the gB of BoHV-1 was used. A sample of follicular fluid presented a band of 175pb being shown positive to the test, while the samples of bovine oviduct epithelial cells, were all verified negatives. This discovery is of great relevance, because BoHV-1 constitutes a risk for the production of embryos in vitro. Leading to embryonic mortality, which has a deep impact in the animal production.

KEY WORDS
BoHV-1; follicular fluid; nested PCR

INTRODUÇÃO

O BoHV-1 é considerado um agente infeccioso para os embriões (VANROOSE et al., 2000). Com advento de técnicas bem sucedidas de produção in vitro e criopreservação de embriões e oócitos, houve o crescimento do comércio interno e externo, assim, têm sido levantadas questões concernentes aos riscos de transmissão de enfermidades infecciosas pelo emprego destes produtos de biotecnologias (BIELANSKI et al., 1997).

A utilização de ovários e de ovidutos bovinos colhidos em abatedouros procedentes de animais com estado sanitário desconhecido é uma prática já estabelecida para a produção de embriões in vitro. Durante os últimos anos foi demonstrado que o BoHV-1 pode estar presente no material utilizado no sistema de produção in vitro (VANROOSE et al., 1999), no fluído folicular, associado às células epiteliais de oviduto, nos oócitos (BIELANSKI et al., 1993) e nos espermatozóides de touros infectados (ROCHA et al., 1998). O risco de transmissão do BoHV-1 pela produção in vitro de embriões deve ser determinada, uma vez que este vírus pode estar presente em animais aparentemente saudáveis (FENNER, 1993).

O monitoramento de meios de maturação, fecundação, líquidos foliculares e células epiteliais de oviduto constitui um meio de promover o controle sanitário evitando assim a disseminação da enfermidade (GUERIN et al., 1989). Neste contexto, o objetivo desse estudo foi verificar a ocorrência do Herpesvírus bovino tipo 1 (BoHV-1) no líquido folicular de ovários e células epiteliais de oviduto bovino colhidos em abatedouro.

MATERIAL E MÉTODOS

Colheita e preparo do material

Líquido folicular e células epiteliais de oviduto bovino

Foram realizadas 12 colheitas em abatedouro obtendo-se um total de 276 ovários e ovidutos. Estes foram transportados em solução salina tamponada (PBS) estéril, pH 7,2 acrescida de gentamicina (50μg/mL) à temperatura de 33º C. Inicialmente, os folículos foram aspirados e o fluído folicular transferido para tubos cônicos. Os ovidutos foram dissecados e colocados em placa de petri, onde cada um deles foi raspado com auxílio de duas lâminas de vidro estéreis para obtenção das células epiteliais. Dessas colheitas foram realizados pools de líquido folicular e de células epiteliais de oviduto bovino para verificação da presença do BoHV-1.

Extração do DNA viral

Para a extração do DNA viral, 200 μL do pool de líquido folicular e do pool de células epiteliais de oviduto bovino foram homogeneizados com 400 μL de TE (10 mM Tris HCl pH 8,0; 1 mM EDTA pH 8,0) e centrifugados a 13.000 xg por 15min. O pellet foi ressuspenso em 300 μL de tampão de lise (195 μL de água milliQ, 60μL de TNE [500 mM NaCl, 50 mM Tris HCl pH 8,0, 125 mM EDTA pH 8,0], 30μL de Dodecil Sulfato de Sódio (SDS) e 0,2 mg de proteinase K/mL) e incubado em banho-maria por 60min a 56º C. À suspensão foram acrescidos de 150 μL de fenol e, após agitação, a mistura foi centrifugada por 5min a 13.000 xg. Da fase aquosa foram colhidos 300μL, aos quais foram adicionados 100 μL de uma solução de fenol clorofórmio álcool isoamílico (25:24:1) e, após agitação, a mistura foi centrifugada a 13.000 xg por 5min. A seguir, 200 μL da fase aquosa foram precipitados com 40 μL de acetato de sódio 2 M e 480 μL de etanol absoluto a -20º C por 12h. Seguido de centrifugação a 13.000 xg por 10min, o DNA foi seco e ressuspenso em 40 μL de TE e estocado a temperatura de -20º C.

PCR

A reação da PCR foi realizada em um volume de 50 μL, contendo 10 μL de DNA, 10 mM de Tris HCl pH 9,0; 1,5 mM de MgCl₂, 200 μM de cada nucleotídeo (dNTPs), 5% de glicerol, 2,5U da enzima Taq DNA polimerase e 50 pmol de cada um dosprimers sense e antisense descritos por VILCEK (1994), respectivamente primer 1 (P1: 5’CAC GGA CCT GGT GGA CAA GGA G 3’) e primer 2 (P2: CTA CCG TCA CGT GCT GTG TAC G 3’) que amplificam fragmento de 468 pares de bases (pb) do gene da gB do BoHV-1. As amostras foram inicialmente desnaturadas a 95º C por 5min. A reação de amplificação foi feita com 35 ciclos repetidos de desnaturação (95º C por 1min), anelamento (57º C por 1min) e extensão (72º C por 1min30), e uma extensão final de 10min a 72º C. Como controle negativo foi utilizada a mistura dos reagentes e água milliQ.

Nested-PCR (nPCR)

Para a nPCR foram utilizados os primers 3 (P3: 5’ CCT CTG TGA ACT GCA TCG TGG A 3’) e 4 (P4: 5´TAG CCC TCG ATC TGC TGG AAG C 3’), que amplificam o fragmento interno de 175 pb da gB do BoHV-1 (D’ANGELO, 1998).

Detecção dos produtos amplificados

A detecção do produto amplificado foi realizada por eletroforese em gel de agarose a 2% em tampão TBE 1X (54 g Tris base; 27,5 g Ácido Bórico e 20 mL EDTA 0,5 M pH 8,0). O gel foi corado com brometo de etídio (5 μg/mL em água), visualizado em transiluminador U.V. e fotografado em câmera digital (Kodak Digital Science DC-40 Câmera).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As amostras de líquido folicular e células epiteliais de oviduto bovino colhidas de vacas e novilhas de abatedouro, quando submetidas à reação da PCR, baseada em uma seqüência conservada do gene que codifica a gB, não foram capazes de amplificar o fragmento de 468 pb. Quando estas amostras foram submetidas a nPCR (Fig.1) foi detectado o gene da gB do BoHV-1 em uma colheita do pool de líquido folicular onde foi observado um fragmento de 175 pb.

Fig. 1
Detecção de produto amplificado de líquido folicular. 1- padrão molecular (100 bp), 2 ao 7 - amostras de líquido folicular negativas, 8- amostra de líquido folicular positiva, 9- controle positivo (BoHV-1), 10- controle negativo (água milliQ).

BIELANSKI et al. (1993) estudaram a presença do BoHV-1 em líquido folicular e células epiteliais de oviduto bovino colhidos em abatedouro e verificaram 11,8% e 6,2% respectivamente de positividade em 85 amostras testadas pela técnica de isolamento viral, constatando que embriões positivos para o vírus eram correlacionados com líquidos foliculares também positivos. Com relação aos resultados do presente estudo, pode-se verificar a presença do BoHV-1 em 8,33% (1/12) das colheitas de líquido folicular e não foi constatada a presença do vírus em células epiteliais de oviduto bovino, empregando a técnica da nPCR.

Os resultados demonstram que nem sempre o líquido folicular está livre de patógenos e o risco potencial de sua presença pode ser remoto, mas deve ser considerado.

Para melhorar o certificado de sanidade dos embriões, é necessário testar os animais doadores e receptores. Testes sorológicos são geralmente conduzidos em colheitas pareadas (um no dia da colheita de embriões ou oócitos e outro poucas semanas após) para permitir um tempo adequado de incubação do vírus (STRINGFELLOW & GIVENS, 2000).

A nested-PCR mostrou-se um método sensível para a detecção de patógenos nos meios e produtos biológicos que são utilizados para a produção de embriões in vitro.

Os resultados deste trabalho tornam consistente a proposição do aspecto sanitário em relação ao comércio externo devendo-se, portanto, atentar as condutas e procedimentos sanitários recomendados pelo Manual da Sociedade Internacional de Transferência de Embriões (STRINGFELLOW & SEIDEL, 1998).

REFERÊNCIAS

• BIELANSKI, A.; LOEWEN, K.S.; DEL CAMPO, M.R.; SIRARD, M.A.; WILLADSEN, S. Isolationofbovineherpesvirus-1(BoHV-1) and bovine viral diarrhea virus (BVDV) in association with the in vitro production of bovine embryos. Theriogenoogy, v.40, p.531-38, 1993.
• BIELANSKI, A.; LUTZE-WALLACE, C.; SAPP, T.; JORDAN, L. The efficacy of trypsin for disinfection of in vitro fertilized bovine embryos exposed to bovine herpesvirus 1. Animail Reproduction Science, v.47, p.1-8, 1997.
• D’ANGELO, M. Interação do herpesvírus bovino tipo 1 (BOHV-1) com oócitos bovinos maturados in vitro 1998. 51p. Tese (Doutorado) - Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo: 1998.
• FENNER, F.J.; GIBBS, E.P.J.; MURPHY, F.A. Herpesviridae. In: Veterinary virology New York: Academic Press, 1993. p. 335-68.
• GÚERIN, B.; LEGUIENNE, B.; CHAFFAUX, S.; HARLAY, T.; ALLIETTA, M.; THIBIER, M. Contamination des ovocytes et des embryons fecondes “in vitro” après infection experimentale de vaches donneuses par le vírus herpes bovin de type 1 (BoHV-1). Recueil de Médicine Véterinaire, v.165, p.827-833, 1989.
• ROCHA, M.A.; BARBOSA, E.F.; GUIMARÃES, S.E.F.; DIAS NETO, E.; GOUVEIA, A.M.G. A high sensitivity-nested PCR assay for BOHV-1 detection in semen of naturally infected bulls. Veterinary Microbiology, v.63, p.1-11, 1998.
• STRINGFELLOW, D.A. & SEIDEL, S.M. (Ed.). Manual da sociedade internacional de transferência de embriões Jaboticabal: SBTE, 1998. 180p.
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• VILCEK, S. Detection of the bovine herpesvirus 1 (BoHV-1) genome by PCR. Journal Virological Methods, v.41, p.245-248, 1994.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Abr 2022
• Data do Fascículo
  Jul-Sep 2005

Histórico

• Recebido
  12 Jun 2005
• Aceito
  30 Jun 2005