SEROLOGIA APLICADA AO ESTUDO DE XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. PASSIFLORAE, AGENTE CAUSAL DA BACTERIOSE DO MARACUJAZEIRO (PASSIFLORA SPP)¹

SEROLOGY APPLIED TO THE STUDY OF XANTHOMONAS CAMPESTRIS PV. PASSIFLORAE, A CAUSITIVE AGENT 1N BACTERIOSIS OF THE PASSION FRUIT TREE (PASSIFLORA SPP)

RESUMO

A bacteriose do maracujazeiro (Passiflora spp), causada por Xanthomonas campestris pv. passiflorae, é a principal moléstia desta cultura, sendo fator limitante para sua exploração comercial. Cinquenta e quatro linhagens de X.c.pv.passiflorae foram analisadas pelas técnicas de serologia, por mçio de testes de dupla difusão em ágar. Foram produzidos antissoros para duas linhagens deX.c.pv.passiflorae originárias de Passiflora alata (AS-XCP-444 e AS-XCP-1171) e um antissoro para X.c.pv.passiflorae isolada de P.edulis (AS-XCP-748). Antígenos na forma de suspensão bacteriana (SB), suspensão bacteriana autoclavada (SBA), exopolissacarídeos (EPS), complexo proteico das membranas (CPM) e glicoproteínas foram testados por dupla difusão em ágar com os três antissoros. Os resultados mostram que os antígenos na forma de SB e CPM são os mais indicados para a diagnose de X. e. pv. passiflorae em material suspeito de infecção. As demais formas de antígenos, se purificados, podem ser utilizadas em estudos visando a separação de linhagens de X.e. pv. passiflorae em grupos serológicos.

PALAVRAS-CHAVE:
Xanthomonas campestris pv passiflorae; Passiflora edulis ; serologia

ABSTRACT

The bacterial disease of passion fruit (Passiflora spp), caused by Xanthomonas campestris pv. passiflorae, is the most important disease in this crop in Brazil and can be a commercial restriction for its commercial cultivation. Fifty-four strains of X. e. pv. passiflorae were analysed by serology, through double diffusion agar test (d.d.a.). Antisera were produced against two strains of X e. pv. passiflorae from P. alata (AS-XCP-444 and AS-XCP-1171) and one strain from P. edulis ( AS-XCP-748). Antigens were prepared as bacterial suspension (BS), autoclaved bacterial suspension (ABS), extracellular polysacharides (EPS), membrane protein complex (MPC) and glycoprotein (GP). All antigens were tested with the three antisera. The results showed that the BS and MPC antigens were the most efficient for pv. passiflorae diagnosis, using material under suspected infection. Although the ABS, EPS and GP antigens could not be employed for X. e. pv. passiflorae diagnosis, if purified, they can be used in serogroups screening.

KEY WORDS:
Xanthomonas campestris pv passiflorae; Passiflora edulis ; serology

INTRODUÇÃO

Várias moléstias de etiologia bacteriana já foram assinaladas na cultura do maracujazeiro (Passiflora spp). De acordo com BRADBURY (1986) estão relatadas como patogênicas a esta cultura as bactérias Agrobaeterium tumefaeiens (Smith & Townsend 1907) Conn 1942), Pseudomonas syringae pv. syringae Van Hall 1902, P. viridiflava (Burkholder 1930) Dowson 1939 e P. syringae pv. passijlorae (Reid 1938) Young, Dye & Wilkie 1978. JABUONSKI et al. (1986) também relacionaram, no Brasil, Erwinia earotovora subsp. earotovora, causando sintomas de podridão mole. Dessas bactérias, as mais importantes, pelos prejuízos ocasionados, são Pseudomonas syringae pv. passijlorae, observada na África do Sul, Austrália e Nova Zelândia e X. e. pv. passiflorae, assinalada na Austrália e no Brasil (BRADBURY, 1986).

A bacteriose ou mancha oleosa do maracujazeiro, causada por Xanthomonas eampestris pv. passiflorae, foi descrita e caracterizada por PEREIRA (1968), estando atualmente disseminada em todas as regiões onde há o plantio comercial desta frutífera (MARQUES et al., 1994; PERUCH et al., 1997).

Plantas infectadas por X.e. pv. passijlorae mostram redução no período de exploração comercial, apresentando frutos de baixo valor ou impróprios para a comercialização. A sintomatologia observada nas plantas infectadas consiste basicamente em manchas foliares. Essas manchas apresentam coloração verde escura, anasarcadas, com aspecto oleoso e translúcido. Com a evolução da moléstia, estas lesões podem colaescer, ocasionando a queda de folhas. A partir das lesões foliares, a infecção pode tomar-se sistêmica, atingindo os ramos, que progressivamente secam, apresentando escurecimento dos feixes vasculares. A disseminação desta bactéria a longas distâncias ocorre principalmente através de sementes contaminadas (PEREIRA, 1968; DIAS, 1990; MALAVOLTA JR., 1998).

A bacteriose do maracujazeiro é atualmente a principal moléstia desta cultura, constituindo-se em fator limitante para a sua expansão, principalmente pelo fato de poder ser transmitida pela semente e por não possuir defensivos agrícolas eficientes para o seu controle.

Este trabalho foi desenvolvido com o objetivo de se determinar as características serológicas de 54 isolados de X.e. pv. passiflorae, visando principalmente a utilização das técnicas serológicas para identificação e diagnóstico da bacteriose do maracujazeiro, sem a necessidade prévia do isolamento do patógeno. Além da diagnose, o trabalho também teve por objetivo' a determinação da variabilidade serológica de linhagens de X.e. pv. passijlorae originárias de diferentes regiões do Brasil.

MATERIAL E MÉTODOS

Linhagens bacterianas

Foram utilizadas 54 linhagens de X. e. pv. passijlorae (Quadro 1) originárias de diferentes regiões geográficas Estas linhagens foram conservadas por liofilização e para os testes de rotina foram mantidas na forma de suspensão em água destilada estéril.

Serologia

a) Preparo de antígenos

Os antígenos para os testes serológicos foram preparados de cinco formas diferentes,a partir do crescimento bacteriano em meio de Nutriente-Ágar (LEVINE, 1954), a 28 ºC por 48 h. As frações antigênicas foram constituídas por (a) suspensão bacteriana (SB), (b) suspensão bacteriana autoclavada (SBA), (c) complexo proteico das membranas (CPM), (d) glicoproteínas (GP) e (e) exopolissacarídeos (EPS). Para o preparo da SB, uma alçada do crescimento bacteriano foi homogeneizada em água destilada (concentração aproximada de 10⁸ UFC/mL). Uma alíquota desta fração foi autoclavada por 15 min, a 121 ºC, constituindo a chamada SBA (DE BOER & SCHAAD, 1990), conforme Esquema 1.

O complexo proteico da membrana (CPM) foi extraído seguindo metodologia descrita por THAVEECHAI & SCHAAD (1986), com pequenas modificações. O crescimento bacteriano obtido em meio sólido foi coletado em solução 0,2 M de cloreto de lítio (LiCl) (2,5 mL/placa). Este material foi agitado por 3h, a 45 ºC, sendo posteriormente centrifugado (12.000g/ 15 min; 40.000g/ 40 mini 4 ºC). Os precipitados foram descartados e os líquidos sobrenadantes submetidos a centrifugação (100.000g/ 120 min/4 ºC). Os líquidos sobrenadantes foram descartados e os precipitados ressuspendidos a 1/10 do volume original em água destilada, sendo posteriormente armazenados a-20 ºC. (Esquema 1).

As glicoproteínas da cápsula bacteriana foram extraídas segundo metodologia descrita por DIGAT & CAMBRA (1976), com pequenas modificações. O crescimento bacteriano foi coletado em água destilada estéril (2,5mL/placa). Esta suspensão foi agitada (250 r.p.m.) durante 30 min, à temperatura de 25 ºC e posteriormente centrifugada (12 000g/ 30 min, a 4 ºC). Descartou-se o precipitado e o líquido sobrenadante foi filtrado em papel de filtro, com ajuste do pH para 7. Este filtrado foi tratado com igual volume de solução saturada de sulfato de amônio [(NH₄ \ SO₄ ] , e mantido a 8 ºC, por 16 h. Posteriormente, o material foi centrifugado (15000g/ 30 min/4 ºC). O líquido sobrenadante foi descartado e o precipitado ressuspendido em a 1/10 do volume inicial, sendo em seguida dialisado contra água destilada por 48 h, constituindo a fração GP, que foi armazenada a-20 ºC (Esquema 1).

Os exopolissacarídeos foram extraídos seguindo metodologia de DE BOER & SCHAAD (1990). O crescimento bacteriano foi coletado em 2 mL de tampão fosfato salino 0,0lM, pH 7,0, agitado vigorosamente em agitador rotativo por 1 mine em seguida centrifugado (12.000g/ 60min/25 ºC). O precipitado foi descartado e o líquido sobrenadante foi tratado com quatro volumes de acetona a -20 ºC, e em seguida centrifugado (12.000g/ 30min/ 25 ºC). O líquido sobrenadante foi descartado e os precipitados ressuspendidos em 200 µL de água destilada e mantidos a - 20 ºC.

Quadro 1
Plantas hospedeiras, origem e código das linhagens de Xanthomonas campestris pv. passiflorae utilizados nos estudos de serologia em testes de dupla difusão em ágar.

PARÂMETROS	TRATAMENTOS
1	2	3	4
Latossol	Latossol	Latossol	Latossol
vermelho	vermelho	vermelho	vermelho
amarelo	com alto	amarelo c/	escuro
	teor de	25% de
	areia	humus
Peso da concha (g) 6,22	5,90	5,24	-
Peso da carne (g) 3,86a	3,10a	2,72ab	-
Hepatopâncreas (g) 2,38	2,24	1,72	-
Genitália+epifragma 3,68	2,32	2,58	-

⁽²⁾ linhagens utilizadas no preparo de antissoros

⁽³⁾ linhagens apigmentadas

⁽⁴⁾ linhagens não incorporadas à Coleção de Culturas IBSBF

b) Preparo de antissoros e testes de dupla difusão emágar

Foram preparados antissoros para as linhagens XCP-444, XCP-748 e XCP-1171 (Quadro 1), que receberam as siglas AS-XCP-444, AS-XCP-748 e"'ASXCP-1171.

Os antígenos para imunização, na forma de suspensão bacteriana, foram preparados a partir de crescimento bacteriano nas condições anteriormente descritas. As suspensões bacterianas foram homogeneizadas em agitador rotativo por 3 rnin e posteriormente centrifugadas. Os precipitados foram ressuspendidos em 200 µL de água destilada estéril e tratados com igual volume de adjuvante completo de Freund. Após a homogeneização, esta emulsão foi empregada como antígeno imunizante. As imunizações foram efetuadas via linfonódulo (OLIVEIRA, 1976), em coelhos da raça "Nova Zelândia". Antes da primeira injeção, os animais foram sangrados para a obtenção do soro normal, empregado como controle negativo das reações serológicas. Foram efetuadas três imunizações por animal, em intervalos de 15 dias entre uma imunização e outra. As sangrias foram efetuadas semanalmente, pela veia marginal da orelha (20 mL/ sangria). Os antissoros, obtidos após a centrifugação da porção líquida do sangue, foram aliquotados e conservados a -20 ºC.

Os testes de dupla difusão em ágar foram efetuados em lâminas de microscopia óptica. Em cada lâmina foram adicionados 3 mL de ágar a 1% em solução salina (NaCl 0,85%), contendo 0,02% de azida de sódio. Após a solidificação, as lâminas foram montadas seguindo-se protocolos previamente determinados. Antígenos e antissoros foram colocados nos respectivos orifícios. As lâminas foram mantidas à temperatura ambiente, até 72 h e posteriormente lavadas em solução salina (24 horas), desidratadas e coradas com negro de amido.

Esquema 1
Preparo das suspensões bacterianas (SB), suspensões bacterianas autoclavadas (SBA), complexo proteico das membranas (CPM), exopolissacarídeos (EPS) e glicoproteínas (GP).

No Quadro 2 estão relacionadas as linhagens utilizadas nos testes serológicos, com antígenos na forma de suspensão bacteriana (SB), suspensão bacteriana autoclavada (SBA), exopolissacarídeos (EPS), complexo proteico das membranas (CPM) e gliprotefuas (GP).

Todas as formas de antígeno foram testadas contra o soro normal. Suspensões bacterianas das linhagens tipo de Xanthomonas arboricola pv. pruni, X.axonopodis, X. brami, X. campestris, X. cassavae, X. cordiaei, X.cucurbitae, X. hortorum, X. hyacinthi, X .melonis, X. pisi, X. sacchari, X. theicola, X. vasicola, e X.vesicatoria e ainda uma linhagem de Pseudomonas syringae pv. passiflorae também foram testados em dupla difusão em ágar, com fins comparativos.

RESULTADOS

Os resultados dos testes de dupla difusão em ágar das cinqüenta e quatro linhagens de X. e. pv. passiflorae utilizando-se os antissoros AS-XCP-444, AS-XCP-748 e AS-XCP-1171 podem ser observados na Tabela 1 e no Esquema 2.

O número máximo de linhas de precipitação observado para todas as formas de antígenos testadas (SB, SBA, CPM, EPS e GP) foi três. Essas linhas, classificadas como linha "a", linha "b" e linha "c", expressam a posição dos arcos de precipitação (antígenos/antissoros) nos testes de dupla difusão em ágar (Esquema 2).

Para os três antissoros utilizados, as frações que apresentaram os maiores percentuais de reações positivas foram SB e CPM. As frações SBA e GP mostraram os menores percentuais de reações positivas.

Para o AS-XCP-444 foi verificado que entre as três linhas de precipitação observadas, a linha de precipitação "b" foi detectada em 88,1% das linhagens testadas com antígenos na forma de SB. Já na fração CPM, o maior percentual de reações positivas foi detectado para a linha de precipitação "a", com 92,2% de reações positivas. Os testes com antígenos na forma de SBA foram os que apresentaram os menores percentuais de reações positivas, seguidos por GP. Não foi detectada, em nenhuma das linhagens testadas para SBA, a linha de precipitação "b". Para os antígenos na forma de EPS e GP, as reações positivas foram principalmente com a linha de precipitação "a" (Tabela 1 e Esquema 2).

Quadro 2
Linhagens de X.c.pv.passiflorae utilizadas nos testes de dupla difusão em ágar, com as respectivos antígenos: suspensão bacteriana (SB), suspensão bacteriana autoclavada (SBA), exopolissacarídeos (EPS), compleo proteico das membranas (CPM) e glicoproteínas (GP).

Para o antissoro AS-XCP-748, dentre as três linhas de precipitação, a linha de precipitação "b" foi a detectada no maior número de linhagens bacterianas (72,8%), conforme a Tabela 1 e o Esquema 2.

Para o AS-XCP-1171, à semelhança do que foi observado para o AS-XCP-444 e AS-XCP-748, na fração SB a linha de precipitação "b" foi a observada em maior percentual (82,8%). Para a fração CPM, o maior percentual de linhas positivas foi verificado para a linha de precipitação "a" (Tabela 1). As formas de antígenos que apresentaram os menores percentuais de reações positivas também foramSBA e GP.

Algumas espécies de Xanthomonas testadas contra os antissoros para X. e. pv passiflorae (X. arborícola pv. pruni, X. bromi, X. cassavae, X. cordiaei, X. hortorum, X.hyacinthy, X. melonis, X. pisi, X. sacchari, X. theicola e X.vasicola) apresentaram reações cruzadas com os antissoros AS444 e AS-748, porém a totalidade das reações foi de não identidade. A linhagem de Peudomonas syringae pv. passiflorae não reagiu com nenhum dos antissoros testados.

DISCUSSÃO

A comparação entre as diversas formas de antígenos utilizadas mostra que antígenos na forma de suspensão bacteriana são os mais indicados para fins de identificação de X. e. pv. passiflorae, visto que além de reagir com grande parte das linhagens testadas, também é a que se obtém com maior facilidade e rapidez.

Uma das questões mais importantes na utilização de técnica serológica é a escolha do tipo de antígeno que deve ser utilizado para a produção de antissoros (SCHAAD, 1979). As vantagens em se produzir antissoros a partir de antígenos purificados está em se poder empregar estes antissoros em testes com macerados de plantas ou de suspensões bacterianas, minimizando os riscos da ocorrência de reações inespecíficas, o que iria contra uma das principais e mais importantes características da serologia - a alta especificidade. A escolha da fração SB foi a mais indicada, visto reagir com grande números de linhagens de X.e. pv. passiflorae,. sem ter apresentado reações positivas com macerados de plantas sadias.

Tabela 1
Resultados dos testes serológicos de dupla difusão em ágar entre os antissoros AS-XCP-444-P. a/ata, AS-XCP-748-P. edulis e AS-XCP-1171-P. a/atei e as frações SB (suspensões bacterianas); SBA (suspensões bacterianas autoclavadas; CPM (complexo proteico da membranas); EPS (exopolissacarídeos) e GP (glicoproteínas) de cinqüenta e quatro linhagens de Xanthomonas campestris pv. passiflorae.1

AS-XCP-444	AS-XCP-748	AS-XCP-1171	% Média
a 79,4	61,7	54,9	65,3
SB b 88,1	72,8	82,8	81,2
c 77,7	44,2	52,5	58,1
a 12,1	31,4	26,7	23,4
SBA b 0,0	10,0	5,5	5,2
c 17,1	10,0	25,0	17,4
a 92,2	72,8	90,5	85,2
CPM b 35,0	33,6	35,7	34,8
c 35,0	7,4	17,1	19,8
a 66,7	31,1	49,6	49,1
EPS b 43,0	41,1	45,8	43,3
c 29,8	28,5	27;5	28,6
a 30,0	30,0	50,0	36,6
GP b 20,0	20,0	30,0	23,3
e 20,0	10,0	10,0	13,3

• ¹
  Resultados expressos em percentagens da linhas de precipitacção "a", "'b" e "c

Testes de dupla difusão em ágar empregandose tecido vegetal macerado, com sintomas característicos de X.e. pv. passiflorae e os três antissoros foram positivos. Tais resultados, confirmados por testes de patogenicidade, permitem concluir que a detecção e a confirmação da identidade desta bactéria em materiais suspeitos de infecção pode ser efetuada sem a necessidade do isolamento e purificação do agente causal.

Os resultados obtidos também evidenciam que antígenos na forma de SBA, EPS e GP não são indicados para a diagnose de X. e. pv. passiflorae, em testes de dupla difusão em ágar. Estas formas de antígeno, apesar de não terem aplicabilidade na diagnose, provavelmente possam ser úteis para experimentos visando a separação das linhagens desta fitobactéria em serogrupos.

Embora a fração CPM também apresente altos percentuais de reações positivas, reconhecendo grande parte das linhagens testadas, a sua utilização para fins de diagnóstico apresenta algumas desvantagens quando comparada à fração SB. Estas desvantagens relacionam-se principalmente à extração da fração CPM, que envolve isolamento, purificação e multiplicação de células bacterianas em larga escala. Além disso, a maior especificidade da fração CPM pode apresentar problemas, deixando de reconhecer algumas linhagens de X. c. pv. passiflorae e consequentemente, implicar em falsos resultados negativos.

Esquema 2
Testes sorológicos de d pla difus o em ágar entre os antissoros AS-XCP-444 - P. alata, AS-XCP-748 _ P. edulis, e AS-XCP-1171 _ P. alatae ant1genos de Xanthomonas campestrls pv. passiflorae, na forma de suspensão bacteriana (SB), suspensão bacteriana autoclavada (SBA) complexo prote· da membrana (CPM), exopolissacarídeos (EPS) e glicoproteínas (GP).

A observação do Esquema 2 também permite concluir que há diferenças entre os três antissoros testados, não sendo, porém, possível separar as linhagens de X. c. pv. passiflorae isoladas de P edulis daquelas provenientes de P. alata pelos testes de dupla difusão em ágar.

As técnicas serológicas podem ser um alternativa para a detecção de X. c. pv. passiflorae em lotes de sementes. Como as sementes infectadas constituem a principal forma de disseminação deste patógeno, a seleção de sementes sadias é uma importante medida visando o controle da moléstia, principalmente quando se considera que a utilização de defensivos agrícolas no controle da bacteriose do maracujazeiro tem se mostrado ineficiente até o presente. Além da técnica de dupla difusão em ágar, utilizada neste trabalho, é necessário testar-se outras técnicas serológicas visando a detecção de X.c. pv. passiflorae, principalmente em lotes de sementes, uma vez que essa técnica, embora permita determinar ò relacionamento serológico entre as diversas linhagens testadas, apresenta baixa sensibilidade (mínimo de 10* células) (DE BOER, 1989; BOUZAR & MOORE, 1990). O teste ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) é mais sensível (detecção a partir de 104 células) (KELMAN & DICKEY, 1989) e talvez seu emprego para detecção em lotes de semente seja mais indicado, visto que o importante é determinar se as sementes estão contaminadas ou não, independente de diferenças que possam ser detectadas com relação a grupos serológicos.

As reações serológicas cruzadas observadas entre os antissoros para X. c. pv .passiflorae e algumas espécies de Xanthomonas devem ser melhor exploradas, principalmente em relação ao número de linhagens testadas e também a forma de antígeno utilizada. É provável que com a utilização de antígenos purificados, como por exemplo, proteínas da membrana bacteriana ou glicoproteínas, estas reações não sejam observadas.

Os resultados obtidos neste trabalho permitem concluir que das diferentes formas de antígenos de X. c. pv. passiflorae analisadas, a fração SB é a mais indicada para fins de diagnóstico, incluindo-se testes com tecido vegetal. A fração CPM também pode ser utilizada com fins de diagnóstico, mas apresenta como principais desvantagens a necessidade do isolamento, purificação e posterior extração do complexo proteico da membrana. Os antígenos na forma de SB A, EPS e GP não são indicados para a diagnose de X. c. pv. passiflorae. Linhagens originárias de P. alata e P. edulis são serologicamente similares, não tendo sido possível diferenciá-las por testes de dupla difusão em ágar.

• 1
  Parte da tese de doutorado defendida por L.O.S. Beriam, no Departamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biologia, UNICAMP, em janeiro de 1998.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Fev 2025
• Data do Fascículo
  Jul-Dec 1998

Histórico

• Recebido
  09 Jun 1998