Alterações agudas dos níveis de neurotransmissores em corpo estriado de ratos jovens após estado epiléptico induzido por pilocarpina

Acute alterations of neurotransmitters levels in striatum of young rat after pilocarpine-induced status epilepticus

Alterações agudas dos níveis de neurotransmissores em corpo estriado de ratos jovens após estado epiléptico induzido por pilocarpina

Acute alterations of neurotransmitters levels in striatum of young rat after pilocarpine-induced status epilepticus

Rivelilson Mendes de Freitas^I; Francisca Cléa Florenço de Sousa^II; Silvânia Maria Mendes Vasconcelos^II; Glauce Socorro Barros Viana^II; Marta Maria de França Fonteles^{II, III}

Departamento de Fisiologia e Farmacologia da Universidade Federal do Ceará (UFC), Fortaleza CE, Brasil

^IMestrando em Farmacologia

^IILaboratório de Neurofarmacologia

^IIIDepartamento de Farmácia

RESUMO

Altas doses de agonista colinérgico muscarínico, pilocarpina, produzem alterações comportamentais, convulsões e estado epiléptico em ratos. O objetivo desse estudo foi verificar as alterações nas concentrações dos neurotransmissores em corpo estriado de ratos em desenvolvimento após estado epiléptico induzido pela pilocarpina. Ratas Wistar foram tratadas com uma única dose de pilocarpina (400mg/Kg; s.c.). Controles receberam salina. A concentração dos neurotransmissores foi determinada através do HPLC, no corpo estriado de ratos que no período de observação de 1 e 24h desencadearam estado epiléptico e não sobreviveram à fase aguda do quadro convulsivo. Foi observada redução nos níveis de dopamina, serotonina, ácido dihidroxifenilacético, ácido 5-hidroxiindolacético, e aumento no ácido 4-hidroxi-3-metoxi-fenilacético. Os resultados mostraram que a ativação do sistema colinérgico pode interagir com os sistemas dopaminérgico e serotonérgico nos mecanismos referentes à fase aguda do processo convulsivo.

Palavras-chave: dopamina, serotonina, convulsão, pilocarpina, corpo estriado.

ABSTRACT

High doses of the muscarinic cholinergic agonist, pilocarpine, result in behavioural changes, seizures and status epilepticus in rats. The purpose of the present work is to invetigate the striatal neurotransmissors level in young rats after status epilepticus induced by pilocarpine. Wistar rats were treated with a single dose of pilocarpine (400mg/Kg; s.c.). Controls received saline. Young animals were closed observed for behavioural changes during 1 and 24h. In these periods, the animals that developed status epilepticus and didn't survive this acute phase of seizures had the brains removed and striatal neurotransmissors level determined by HPLC. The concentration of dopamine, serotonine, dihydroxyphenylacetic acid, 5-hydroxyindolacetic acid was reduced and an increase in 4-hydroxy-3-methoxy-phenylacetic acid was observed. These results suggest that cholinergic activation can interage with dopaminergic and serotonergic systems in acute phase of the convulsive process in immature striatum.

Keywords: dopamine, serotonine, seizures, pilocarpine, striatum.

Agonistas muscarínicos administrados em altas doses induzem a produção de convulsões motoras límbicas e estado epiléptico em ratos adultos^1,2. O modelo de convulsão com dose alta de pilocarpina (400mg/Kg) revela o processo convulsivo através de alterações comportamentais, eletroencefalográficas e pela presença de intensa lesão cerebral^3-5, permitindo também o estudo das alterações em nível de receptores⁶, e/ou dos níveis das monoaminas e seus metabólitos^7,8. As convulsões produzidas pelos agonistas colinérgicos em animais parecem depender da ativação do receptor muscarínico e do envolvimento dos fosfoinositídios^4,6, sugerindo ações pós -sinápticas. Vários estudos^4,6, porém, indicam aumento não somente na atividade colinérgica pós-sináptica, mas na pré-sináptica também. Contudo, como esses achados podem contribuir para explicar a origem e o mecanismo de todo o processo convulsivo, ainda precisam ser melhor determinados.

Para esse fim, vários aspectos têm sido observados, a saber: a interferência do sistema de neurotransmissão muscarínico⁶, dopaminérgico^9,10, glutamatérgico^11,12, e GABAérgico^13-15, e o estudo dos segundos mensageiros⁶ nas convulsões utilizando pilocarpina 400mg/Kg¹³. Tem sido feita outra abordagem que favorece o conhecimento da epilepsia em relação à idade: o estudo das convulsões em animais na fase de desenvolvimento¹⁶, uma vez que o cérebro imaturo, com suas inervações e densidade de receptores ainda em desenvolvimento, pode ajudar na investigação da origem das convulsões, incluindo a relação entre a ativação do receptor e o processo de transdução de sinal¹⁶ e as possíveis alterações nas concentrações dos neurotransmissores¹⁵. Várias pesquisas^16,17,18 têm sido desenvolvidas utilizando, em particular, animais de 21 dias de idade, no modelo de convulsão com pilocarpina 400mg/Kg. Foi relatado que os animais neonatos¹⁶ apresentam-se vulneráveis às convulsões induzidas por pilocarpina em altas doses e que a atividade convulsiva parece ter características diferentes em função da idade. O agonista colinérgico induz manifestações comportamentais e eletroencefalográficas de estado epiléptico em ratos a partir da segunda semana de vida, e essas alterações são semelhantes às da epilepsia do lobo temporal de humanos^16,17.

Como o mecanismo das convulsões ainda não foi completamente esclarecido, decidiu-se investigar, através de estudos neuroquímicos, as alterações que poderiam ocorrer com 1 e 24h sobre a concentração das monoaminas e metabólitos, após estado epiléptico induzido por pilocarpina (400mg/Kg), em ratos jovens com 21 dias de idade.

MÉTODO

Um número total de 90 animais foi utilizado nos experimentos. Ratos Wistar jovens (21 dias de idade; fêmeas; n=90), com peso variando de 25 e 35g, provenientes do Biotério Central da Universidade Federal do Ceará, foram tratados com uma única dose de pilocarpina (400mg/Kg; s.c.; n=60). Os animais foram divididos em 2 grupos com o mesmo número e observados durante 1 e 24h após a administração. Os animais controles foram tratados com solução salina (NaCl, 0,9%; s.c.; n=30). Durante todos os experimentos, os animais foram mantidos em gaiolas no máximo com 6 animais, em condições ambientais semelhantes, com ciclos de alternância claro/escuro de 12h, recebendo ração padrão tipo Purina e água ad libitum. Para o tratamento agudo com pilocarpina, a administração foi realizada com os animais no 21º dia de vida. Os animais que apresentaram convulsão, estado epiléptico e não sobreviveram ao tratamento durante o período de 1 e 24h de observação, foram decapitados e imediatamente o corpo estriado foi dissecado sobre gelo para preparação dos homogenatos utilizados na realização dos estudos neuroquímicos.

Os níveis cerebrais de monoaminas foram estudados em homogenatos a 10% preparados em tampão fosfato de sódio (150mM; pH 7,4). Para a determinação dos neurotransmissores dopamina (DA), serotonina (5-HT) e seus metabólitos ácido dihidroxifenilacético (DOPAC), ácido 4-hidroxi-3-metoxi-fenilacético (HVA), ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA), foi utilizado um equipamento de HPLC da Shimadzu, modelo LCD-6^A, com detecção amperométrica. Para a separação das monoaminas, foi usada uma coluna de fase reversa (Shim-Pack CLC-ODS, 25cm). A fase móvel foi preparada com ácido cítrico monohidratado 150mM, octil sulfato de sódio 67mM, tetrahidrofurano 2%, acetonitrila 45, utilizando água deionizada. O pH da fase móvel foi ajustado para 3,0 com NaOH 10mM. A quantificação dos picos obtidos foi feita com o auxílio de uma curva padrão. Valores absolutos foram corrigidos quanto à recuperação das cânulas e expressões de variação em relação aos valores basais.

Para estudo estatístico foi utilizada a análise de variância (ANOVA) para múltiplas comparações e o teste t-Student's como teste post hoc. As diferenças foram consideradas estatisticamente significativas quando p<0,05.

RESULTADOS

A Tabela 1 mostra que doses convulsivas de pilocarpina diminuíram de maneira significativa os níveis de dopamina (DA) de 64% em 1h [T(10) = 7,025, p<0,0001], e de 48% em 24h [T(10) = 5,789, p<0,0002]; do ácido dihidroxifenilacético (DOPAC) de 35% em 1h [T(10) = 3,575, p<0,0051], e de 28% em 24h [T(9) = 3,361, p<0,0084], e que aumentaram a concentração do ácido 4-hidroxi-3-metoxi-fenilacético (HVA) em 119%, em 1h [T(8) = 2,495, p<0,0372], e em 30% no período de 24 h, [T(9) = 23,307, p<0,0001].

Por sua vez, na Tabela 2, foi observada redução significativa da concentração da serotonina (5-HT) de 77% em 1h [T(9) = 4,226; p<0,0022] e de 57% em 24h [T(9) = 3,149; p<0,0118]. Também houve redução nos valores do seu metabólito ácido 5-hidroxiindolacético (5-HIAA) em 64% em 1h [T(8) = 3,924; p<0,0044], e 65% em 24h [T(10) = 4,885; p<0,0006].

A Figura 1 mostra a comparação, em valores percentuais, percentagem das concentrações das monoaminas DA e 5-HT e dos metabólitos DOPAC, HVA e 5-HIAA em corpo estriado de ratos jovens durante os períodos de 1 e 24h após estado epiléptico induzido por pilocarpina.

DISCUSSÃO

A pilocarpina promoveu a indução de convulsões que se desenvolveram para o estado epiléptico de forma grave e de longa duração. Poucos animais sobreviveram. Os animais que apresentaram convulsões, estado epiléptico e não sobreviveram até à primeira hora e às 24h de observação, foram estudados quanto às prováveis modificações dos neurotransmissores, nessas condições. Foi vista redução, de forma rápida e drástica, nos níveis de DA, 5-HT, DOPAC, 5-HIAA, e concentração aumentada de HVA. Algumas pesquisas têm focalizado o efeito epileptogênico da administração de alta dose de pilocarpina durante a ontogênese em ratos, na intenção de determinar os efeitos de doses convulsivas nos animais em desenvolvimento^16-18. Além disso, estes estudos investigam a origem e a propagação das convulsões no cérebro em desenvolvimento, a fim de esclarecer o mecanismo do processo convulsivo. No presente estudo foram utilizados ratos com 21 dias de idade submetidos ao modelo de convulsão com pilocarpina sozinha (400mg/Kg).

Nossos resultados mostraram que o tratamento agudo com pilocarpina resultou em morte de 68% dos animais durante 1h e também com 24h de observação, revelando um porcentual de ocorrência de morte semelhante nos animais jovens independentemente do tempo de observação. O mesmo fato parece não ocorrer nos ratos adultos, Alguns estudos têm sugerido, na fase aguda das convulsões, relação quase imediata da acetilcolina com outros sistemas de neurotransmissão (adrenérgico, dopaminérgico e serotonérgico), uma vez que têm sido observados efeitos rápidos nas concentrações de noradrenalina, dopamina e serotonina^7,14. Nos ratos jovens, em particular, a influência da imaturidade na relação entre os sistemas pode promover ações semelhantes do sistema colinérgico na fase aguda das convulsões independentemente do tempo, limitando a participação de mecanismos atenuantes da ativação colinérgica, provavelmente existentes no cérebro maduro.

Como relatado anteriormente, os níveis de monoaminas e metabólitos durante o estado epiléptico foram alterados nos ratos com 21 dias, observando-se redução nos níveis de DA, DOPAC, 5-HT, e 5-HIAA. O metabólito da dopamina HVA teve sua concentração aumentada em ambos os períodos de observação. Estes dados corroboram, em parte, os de El-Etri et al.,⁷ que encontraram, em ratos adultos convulsivos após 24h de observação, aumento nos níveis de DA e 5-HT e de seus metabólitos DOPAC, HVA e 5-HIAA. Entretanto, após 1h de observação, os níveis de DA e 5-HT não se alteraram, mas seus metabólitos sofreram aumento significativo nas suas concentrações.

Nossos achados apontaram para uma redução nos neurotransmissores e metabólitos, exceto para o HVA, durante a fase aguda das convulsões, até as primeiras 24 horas, indicando que, após a ativação colinérgica sabidamente necessária para desencadear o processo^17,18, os níveis dos neurotransmissores foram semelhantes.

Acreditamos que mais estudos devam ser feitos, em tempos variados após o desenvolvimento do estado epiléptico e em diferentes idades, para maior conhecimento dos sistemas de neurotransmissores envolvidos em todo processo convulsivo.

Recebido 24 Setembro 2002, recebido na forma final 19 Dezembro 2002

Aceito 14 Janeiro 2003

Dra. Marta Maria de França Fonteles - Departamento de Farmácia e Laboratório de Neurofarmacologia do Departamento de Fisiologia e Farmacologia da UFC - Rua Cônsul Gouveia 469 - 60335-390 Fortaleza CE - Brasil. FAX: [phone]. E-mail: [e-mail]

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Jul 2003
• Data do Fascículo
  Jun 2003

Histórico

• Aceito
  14 Jan 2003
• Recebido
  19 Dez 2002