Estudo experimental da influência das dimensões dos grânulos de hidroxiapatita na integração óssea

Influence od dimensions of hydroxiapatite granules upon bone integration: an experimental study

ARTIGO ORIGINAL

Estudo experimental da influência das dimensões dos grânulos de hidroxiapatita na integração óssea

Influence od dimensions of hydroxiapatite granules upon bone integration: an experimental study

Adriana Santos Barone Moreira^I; Monica Tempeste Pastoreli^II; Luiz Henrique Fonseca Damasceno^III; Helton Luiz Aparecido Defino^IV

^IPós Graduanda do Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor

^IIMédica do Departamento de Clínica Médica do Hospital das Clínicas

^IIIPós Graduando Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor

^IVProfessor Associado do Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Foi realizado estudo experimental em ratos Wistar para a avaliação da integração óssea dos grânulos de hidroxiapatita de diferentes tamanhos (212µ, 500µ e 1000µ). Os animais foram divididos em três grupos experimentais (dois grupos com 15 animais e um grupo com 25 animais) e foram sacrificados com 30, 90 e 180 dias após a implantação da hidroxiapatita, que foi utilizada para o preenchimento de falha óssea produzida no fêmur. Dez animais formaram o grupo controle, cujo falha produzida no fêmur não foi preenchida com a HA. Os animais foram avaliados por meio de estudo radiológico e histológico, utilizando-se microscopia de luz para a avaliação da interface entre o tecido ósseo e a hidroxiapatita.

Foi observado que os grânulos de hidroxiapatita utilizados para o preenchimento da falha óssea foram biocompatíveis e que a restauração da falha óssea ocorreu mais rapidamente nas falhas ósseas preenchidas com a HA que apresentava grânulos de menor diâmetro (212µ).

Descritores: Osseointegração; Hidroxiapatita; Ratos wistar.

SUMMARY

This trial was performed in Wistar rats to evaluate bone integration of hydroxyapatite (HA) granules of different sizes (212 µm, 500 µm, and 1000 µm). The animals were divided into three experimental groups, that is, two groups of 15 animals and one group of 25 animals, which were killed, respectively, 30, 90 and 180 days after the implantation of the hydroxyapatite employed to fill the bone defects produced in the rats' femurs. Additionally, a control group included ten rats whose induced femur defects were not filled with HA. All animals were radiologically and histologically examined by light microscopy, in order to evaluate the bone tissue / hydroxyapatite interface.

It was seen that the hydroxyapatite granules employed to fill the bone defects were biocompatible and that the bone defect was restored faster in the bone defects filled with HA whose granules had smaller diameters (212 µm).

Key words: Osseointegration; Durapatite; Rats, Wistar.

INTRODUÇÃO

A procura de substitutos dos enxertos ósseos, capazes de promover a osteointegração, o restabelecimento, a remodelação e o reforço das estruturas ósseas, tem estimulado a pesquisa de materiais sintéticos capazes de substituir os enxertos ósseos^(1,6). Os enxertos ósseos apresentam eficiência mecânica e biológica, mas as limitações relacionadas à sua utilização estão relacionadas com as complicações do local de sua retirada, e com a sua escassez nos pacientes submetidos a múltiplos procedimentos^(2,11,15).

A cerâmica de hidroxiapatita tem sido estudada por tratar-se de uma substância bioativa não tóxica, que provoca pouca reação tecidual, apresentando-se como um importante recurso para a substituição óssea^(13,15). Seu emprego tem sido muito diversificado, tendo sido utilizada para o preenchimento de falhas ósseas e reconstrução de defeitos ósseos provocado por ressecções cirúrgicas; revestimento de componentes metálicos para fixação ou no revestimento da superfície de metais^(2,5,8).

A hidroxiapatita tem sido objeto de nosso estudo, e esse trabalho teve como principal objetivo a avaliação experimental da integração óssea da hidroxiapatita, considerando-se a utilização de grânulos de diferentes dimensões desse material, com a finalidade de observar a possível influência do tamanho dos grânulos de hidroxiapatita na velocidade e qualidade do processo de integração óssea.

MATERIAL E MÉTODOS

Material

Foram utilizados 55 ratos machos da raça Wistar, com peso variando de 200 a 300g, fornecidos pelo Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.

A hidroxiapatita utilizada para o estudo foi a GEN-PHOS¹ granulada, que é uma hidroxiapatita sintética não reabsorvível, tendo sido utilizado três diferentes tipos dessa hidroxiapatita com relação ao tamanho dos seus grânulos, as quais denominamos: Tipo I (0.212µ), Tipo II (0.500 µ) e Tipo III (1.00 µ). (Figura 1)

Métodos

A região ântero-lateral do fêmur direito e esquerdo dos ratos foi utilizada para o estudo. Após a exposição cirúrgica dos fêmures, era confeccionada uma canaleta óssea medindo 5 mm de comprimento e 2 mm de largura que era preenchida com hidroxiapatita.No grupo controle, a falha óssea era realizada do mesmo modo e não era preenchida com a hidroxiapatita. (Figura 2)

Os animais foram operados no setor de Medicina Experimental do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, e anestesiados com Nembutal ¹⁽⁵⁾ na dose de 33 mg/Kg, por meio de injeção intra-peritoneal. Após a anestesia, era realizada a tricotomia, assepsia e antissepsia dos membros inferiores com PVPI degermante ¹ e álcool iodado.

Os fêmures eram abordados por meio de incisão longitutinal de cerca de 2 cm na face lateral das coxas, tendo sido produzida uma falha óssea de 5mm de comprimento e 2 mm de largura, que estendia até a medula óssea.

A falha óssea era completamente preenchida com a hidroxiapatita, e o tipo de hidroxiapatita utilizada dependia do grupo experimental a que pertenciam os animais.

Após o preenchimento da falha óssea, os planos musculares eram suturados em blocos com pontos separados, utilizando-se fio Catgut Cromado 3-0 ³⁽⁶⁾, e a pele era suturada com fio Mononylon 4-0 ⁴⁽⁷⁾. No pós operatório imediato todos os animais foram liberados para deambulação sem restrição e receberam 5.000 U intra-muscular de Benzil Penicilina Potássica ⁵(8) nos 3 primeiros dias de pós-operatório.

Os animais foram divididos em 3 grupos experimentais, sendo que dois deles eram compostos por 15 animais e um por 25 animais.Os animais foram sacrificados com 30 dias após o procedimento cirúrgico (grupo I), 90 dias (grupo II) e 180 dias (grupo III).

Com objetivo de avaliar-se os diferentes tipos de hidroxiapatita, no mesmo animal, três combinações da aplicação de hidroxiapatita foram realizadas: Tipo I e Tipo II; Tipo II e Tipo III; e Tipo III e Tipo I, tendo sido cada tipo utilizado em um dos fêmures dos animais. Foram utilizados 15 animais para cada tipo de combinação da aplicação da hidroxiapatita, sendo que 5 animais de cada tipo, eram sacrificados com 30 dias de pós operatório, 5 com 90 dias e 5 com 180 dias de pós operatório. (Tabela 1)

O grupo III era composto por 25 animais, sendo que 10 pertenciam ao grupo controle, nos quais a falha óssea não foi preenchida com a hidroxiapatita.

A avaliação da integração da hidroxiapatita com o tecido ósseo foi realizada por meio de estudo histológico com microscopia de luz, e nos animais do grupo III foi também realizado estudo radiológico, utilizando-se filme de mamografia ⁶ posicionado a um metro da ampôla do aparelho, com técnica de 38 Kv e MAS 6.4. As radiografias nos animais do grupo III foram realizadas imediatamente após a cirurgia, com 30, 90 e 180 dias de pós- operatório.

As radiografias foram avaliadas por radiologista do Serviço de Radio Diagnóstico do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina Ribeirão Preto. Os parâmetros utilizados para a realização do estudo radiológico nas falhas ósseas produzidas consistiram em analisar a presença de formação óssea na falha, sendo que esse parâmetro foi graduado em 25%, 50% e 75% da formação óssea na falha e completo preenchimento da falha com tecido ósseo. Outro parâmetro analisado nesse estudo foi a verificação do remodelamento ósseo no interior da falha do fêmur, sendo esse parâmetro graduado em ausência de remodelamento na falha, remodelamento do canal medular, remodelamento parcial da cortical e presença de reação periostal.

Com auxílio de um Paquímetro Eletrônico ⁸, as falhas ósseas eram mensuradas nas radiografias ( pós-operatório imediato, 30, 90 e 180 dias de pós operatório), nos maiores eixos das posições ântero-posterior e perfil.

O estudo histológico foi realizado nos três grupos experimentais, de acordo com o período estabelecido para o sacrifício ( 30, 90 e 180 dias de pós operatório). Os fêmures do grupo controle foram submetidos somente ao estudo histológico no período de 180 dias.

Foram realizados cortes histológicos de 6µ e corados pela técnica da hematoxilina-eosina e Tricrômico de Gomori para o estudo da interface do tecido ósseo e hidroxiapatita.

Os parâmetros utilizados no estudo histológico consistiram na análise da presença de remodelação do defeito produzido no fêmur, que foi graduado em: ausência de união óssea, presença de união fibrosa, presença de união osteocondral e completa reorganização da falha óssea. Outros parâmetros analisados estavam relacionados ao ao estudo do osso cortical (formação e organização do osso cortical) e do osso esponjoso (atividade celular, formação óssea e reorganização).

As medidas obtidas através da mensuração das falhas ósseas com o uso do paquímetro eletrônico foram submetidas à análise estatística, tendo sido utilizado o teste não paramétrico de Wilcoxom, para comparar mais de dois tratamentos, usando níveis de significância de 5%.

RESULTADOS

Avaliação radiológica

A avaliação radiológica realizada no período pós-operatório imediato mostrou as falhas ósseas preenchidas com a hidroxiapatita, tendo sido possível identificar os três diferentes tipos utilizados , enquanto que no grupo controle a falha óssea apresentava os limites bem precisos . (Figura 3)

Com 30 dias de pós-operatório os diferentes grupos experimentais ainda podiam ser identificados de acordo com o tamanho dos grânulos da hidroxiapatita. O defeito do fêmur já apresentava respectivamente 100% e 75% de formação óssea em 60% e 40% das falhas ósseas preenchidos com a HA do tipo I. Nos orifícios preenchidos com a HA do tipo II foi observado 75% de formação óssea em 50% das falhas ósseas, tendo sido observado 50% de formação óssea em 50% das falhas ósseas preenchidas com a HA do tipo III. No grupo controle 100% de formação óssea foi observado em 40% das falhas ósseas. O remodelamento do canal medular foi observado em 60% das falhas ósseas dos fêmures preenchidos com a hidroxiapatita do tipo I, e em 30% e 20% nas falhas ósseas preenchidas com a hidroxiapatita dos tipos II e III, respectivamente. O remodelamento completo da cortical foi observado em 20% dos fêmures preenchidos com a hidroxiapatita tipo I, enquanto que o tipo II apresentou remodelamento parcial da cortical em 50% dos fêmures e o tipo III em 40% dos casos. O grupo controle apresentou remodelamento completo da cortical em 60% dos animais . A reação periostal foi observada em todos grupos experimentais.

Na avaliação radiológica com 90 dias de pós-operatório ainda era possível a diferenciação dos tipos de hidroxiapatita utilizada. A reação periostal ainda estava presente em todos os grupos experimentais . Foi observado o completo preenchimento da falha óssea em 60% dos fêmures preenchidos com a hidroxiapatita do tipo I, em 30% preenchidos com a HA do tipo II e tipo III. No grupo controle todos as falhas apresentavam a formação óssea máxima. O remodelamento completo da cortical foi observado em 70% das falhas preenchidas com a HA do tipo I, 20% do tipo II e 40% do tipo III, sendo completo em todos os animais do grupo controle.

Na avaliação radiológica com 180 de pós-operatório a identificação dos diferentes tipo de hidroxiapatita não era nítida como nos grupos anteriores. A reação periostal ainda estava presente, porém em menor quantidade. Todos os grupos experimentais, incluindo o grupo controle, apresentavam preenchimento total das falhas ósseas com tecido ósseo e remodelamento completo da cortical em 100% dos animais. (Figura 4,5,6 e 7)

O resultado do estudo da mensuração das falhas ósseas nas radiografias, por meio da utilização do paquímetro nos animais do grupo III, mostrou que houve redução do tamanho das falhas ósseas em todos os casos. A redução do tamanho das falhas ósseas foi considerado estatisticamente significativo no período de 180 dias de pós operatório em relação período pós operatório imediato, enquanto que nos outros período do estudo (30 e 90 dias) a redução das falhas não foi estatisticamente significativa (Tabela 2)

Avaliação Histológica

A avaliação histológica com 30 dias de pós-operatório evidenciou união osteocondral em 80% das falhas preenchidas com a hidroxiapatita do tipo I e em 90% das falhas preenchidas com a hidroxiapatita tipo II (Figura 8,9 e 10). Foi observado reorganização do osso esponjoso com a presença de osteoclastos em 30% das falhas preenchidas com a hidroxiapatita tipo I e em 10% nas falhas onde utilizou-se a hidroxiapatita tipo II. O osso cortical estava sendo formado em 90% dos fêmures preenchidos com a hidroxiapatita tipo I e em 70% dos casos que utilizou-se o tipo II. Nos fêmures preenchidos com a hidroxiapatita tipo III, foi observado união fibrosa na falha com início de formação de osso esponjoso e cortical em 50% dos casos, sendo que o restante não apresentava indícios de união óssea, bem como presença de atividade celular ou início de formação de osso esponjoso ou cortical.(Figura 11,12 e 13)

Com 90 dias de pós-operatório foi observado a união óssea na falha em 90% dos fêmures preenchidos com grânulos de hidroxiapatita do tipo I e II e união osteocondral em 100% das falhas que foram preenchidas com hidroxiapatita do tipo III. O osso esponjoso estava completamente organizado em 70% das falhas preenchidas com as hidroxiapatita tipo I e II e parcialmente organizado em 70% das falhas preenchidas com a hidroxiapatita do tipo III.

O osso cortical estava parcialmente organizado em 90% dos casos nos quais foi utilizado o grânulo do tipo I e em 50% dos fêmures preenchidos com grânulos do tipo I ou II.

Na avaliação com 180 dias de pós-operatório a reorganização da falha óssea foi observada em 100% dos casos nos quais foi utilizada a hidroxiapatita tipo I e tipo II, e em 80% dos fêmures preenchidos com a hidroxiapatita do tipo III. Observou-se completa reorganização do osso esponjoso para todas falhas estudadas. A parte cortical estava completamente reorganizada em 70% dos casos preenchidos com os grânulos do tipo I e tipo II e em 60% dos casos preenchidos com o tipo III. Os diferentes tipos de grânulos de hidroxiapatita utilizados ainda podiam ser vistos, porém notou-se uma diminuição na quantidade de grânulos de hidroxiapatita do tipo I (0.212µ) em relação aos períodos anteriores para o mesmo tipo de hidroxiapatita utilizada.

DISCUSSÃO

A influência das dimensões dos grânulos de HA na sua integração com o tecido ósseo tem sido relativamente pouco estudada, considerando-se a atenção que tem sido dispensada nos últimos anos ao estudo dos materiais cerâmicos empregados na substituição do tecido ósseo.

A hidroxiapatita utilizada em nosso estudo é uma biocerâmica sintética, semelhante a que utilizamos em estudos anteriores⁽³⁾, sendo essa HA sinterizada a uma temperatura de 1.100ºC, e possuindo poros que variam de 1 a 10µ. Esse tipo de HA difere da hidroxiapatita natural, que é oriunda dos corais, e que são submetidas à uma conversão química por meio de trocas hidrotermais.

Optamos em nosso trabalho, como outros autores^(10,12), pela utilização do rato como animal de experimentação, principalmente pela disponibilidade d aquisição desses animais, e pela sua resistência aos procedimentos cirúrgicos realizados. No entanto, apesar do modelo experimental ter sido adequado para atender às necessidades do estudo, deve ser lembrado o fato de que a medula óssea do animal utilizado difere do osso esponjoso humano⁽³⁾, assim como ocorre nos coelhos, os quais foram utilizados por outros autores⁽⁹⁾ em estudos experimentais com HA.

Observamos em nosso estudo que as três dimensões de grânulos de HA utilizados (212 µ, 500 µ e 1000µ) foram satisfatória para que ocorresse o total preenchimento da falha óssea após seis meses. No entanto, observamos que o preenchimento da falha óssea ocorreu em menor período de tempo com a utilização dos grânulos menores (212 µ). Kurada⁽⁹⁾ em estudo experimental em coelhos e utilizando grânulos de HA variando de 300 a 2000 µ, observou também maior neoformação óssea nas falhas ósseas preenchidas com os grânulos de menor tamanho.

Shapoff et al.⁽¹⁴⁾ consideram que as partículas com tamanho entre 100 a 300 µ apresentam reabsorção mais rápida, maior área de superfície e atuam como material osteocondutor. Esses autores acreditam que a utilização de partículas de menor tamanho impediria a migração e o crescimento intrínseco das células ou vasos sanguíneos, e a conseqüente formação óssea. Ushida et al.⁽¹⁵⁾ observaram também em estudo experimental que as partículas de 300 µ foram as mais apropriadas, tendo sido as partículas menores (40 µ) observadas ao longo dos prolongamentos dos corpos celulares. Os grânulos com dimensões entre 10 a 50 µ poderiam ser fagocitados por células como os macrófagos ou fibroblastos, devido às suas dimensões reduzidas^{(10, 14)}. Não foi observado processo de fagocitose em nosso estudo, estando a nossa observação de acordo com os relatos acima mencionados.

Na avaliação radiológica foi observado que a definição dos grânulos de HA ficava mais discreta e evidente nas falhas ósseas preenchidas com os grânulos menores (212µ), estando esse fato provavelmente relacionado com o crescimento intrínseco do tecido ósseo e atividade osteoclástica associada à incorporação da HA^(7,11,12).

Semelhante às observações de Croci et al.⁽²⁾ o remodelamento ósseo ocorreu inicialmente no canal medular, seguido pelo remodelamento do osso cortical. Esse fato foi observado em ambos os grupos experimentais, tendo sido observado mais precocemente nas falhas preenchidas com os grânulos menores (212 µ) e em períodos mais tardios nas falhas preenchidas com grânulos maiores (1000 µ ). No final do seguimento radiológico foi observado uma diminuição, apesar de não ser significativa, dos grânulos de menor tamanho (212 µ )no interior das falhas. Não tendo sido observado diminuição dos grânulos de maior tamanho no interior das falhas ósseas.

A reação periostal foi observada somente após 30 dias, tornando-se mais intensa no período de 90 dias e menos evidente nas radiografias realizadas com 180 dias após o procedimento cirúrgico. Em estudos anteriores⁽³⁾ observamos essa reação periostal somente no primeiro mês de pós-operatório e atribuímos a sua presença ao trauma cirúrgico. No entanto, essa explicação para o aparecimento da reação periostal não seria convincente para as observações do estudo atual, permanecendo esse achado sem explicação convincente.

O grupo controle apresentou em todos os animais, completo preenchimento da falha óssea e completo remodelamento do osso cortical durante a avaliação radiológica realizada com 90 dias de pós-operatório. Foi também observado que nas falhas ósseas preenchidas com a HA o crescimento do tecido ósseo neoformado ocorreu mais tardiamente, quando comparado com o grupo controle. Esses achados poderiam estar relacionados com as pequenas dimensões da falha óssea (5 mm), mas a realização de falhas de maiores dimensões, colocaria em risco a estrutura do osso, que poderia apresentar fraturas, comprometendo a realização do estudo.

Considerando-se as restrições impostas pelo modelo experimental e que já foram apresentadas, foi possível observar que a hidroxiapatita utilizada no estudo foi biocompatível e permitiu a reparação da falha óssea, ainda que em período maior que o observado no grupo controle, tendo sido observado que a reparação da falha óssea ocorreu em menor período de tempo nas falhas ósseas em que os grânulos de HA de menor dimensão foram utilizados.

CONCLUSÕES

A hidroxiapatita utilizada no estudo foi biocompatível e permitiu a remodelação da falha óssea produzida no animal. A remodelação da falha óssea ocorreu em menor período de tempo nas falhas ósseas preenchidas com os grânulos de HA de menor tamanho ( 212 µ). Nos animais controles em que a falha óssea não foi preenchida com a HA a remodelação da falha óssea ocorreu em menor período de tempo, segundo a avaliação radiológica.

Trabalho recebido em 14/04/2003

Aprovado em 28/07/2003

Trabalho realizado com auxílio do CNPQ

Trabalho realizado no Departamento de Biomecânica, Medicina e Reabilitação do Aparelho Locomotor da Faculdade de Medicina e Ribeirão Preto-USP

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Mar 2004
• Data do Fascículo
  Dez 2003

Histórico

• Aceito
  28 Jul 2003
• Recebido
  14 Abr 2003