Um método para determinar resíduos de antibióticos beta-lactâmicos em leite por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) foi desenvolvido e validado. Amostras brancas foram adicionadas de padrão e desproteinizadas. O extrato foi purificado por extração em fase sólida C18, os antibióticos eluídos com acetonitrila:água (50:50 v/v) e posteriormente derivatizados com anidrido acético e solução de 1-metil-imidazol contendo HgCl2. A análise cromatográfica foi realizada utilizando coluna C18, fase móvel composta por acetonitrila e tampão fosfato pH 6,5, na presença de Na2S2O3 em gradiente e detecção a 325 nm. O método foi seletivo para ampicilina, penicilina G e penicilina V, sendo este último utilizado como padrão interno. As médias de recuperação para ampicilina e penicilina G situaram-se, respectivamente, na faixa de 60,0% a 104,9% e de 82,7% a 109,2%, com coeficientes de variação na faixa de 11,1% a 24,6%, e de 2,1% a 25,2%, indicando exatidão e precisão. Limites de detecção e quantificação de 4,0 µg/L para ampicilina e de 3,0 µg/L para penicilina G foram determinados.