Campylobacter jejuni e Campylobacter coli EM CARCAÇAS DE FRANGO RESFRIADAS E CONGELADAS

Campylobacter jejuni AND Campylobacter coli IN CHILLED AND FROZEN CHICKEN CARCASSES

Resumo

Espécies de Campylobacter spp. termotolerantes são agentes de surtos de campilobacteriose em humanos e os produtos de origem avícola são considerados uma importante fonte de infecção. Foram identificados Campylobacter jejuni e Campylobacter coli em carcaças de frango resfriadas e congeladas coletadas em três abatedouros entre 2014 e 2015. A detecção de Campylobacter spp. foi realizada por microbiologia convencional e a identificação de C. jejuni e C. coli por multiplex-PCR. Dentre as amostras avaliadas verificou-se Campylobacter spp. termotolerante em 63,8%, sendo 72,2% em carcaças resfriadas e 55,5% em carcaças congeladas. Destas, 83,3% foram positivas para C. jejuni e 66,6% para C. coli, enquanto 50% foram positivas para ambas as espécies. A presença de Campylobacter spp. termotolerante em carcaças de frangos de corte prontas para consumo representa uma importante fonte de transmissão destes patógenos para humanos.

Palavras-chave:
abatedouros avícolas; campilobacteriose; termotolerantes

Abstract

Species of thermophilic Campylobacter spp. are agents of campylobacteriosis outbreaks in humans, and poultry products are implicated as major sources of infection. The detection of Campylobacter spp. was performed by conventional microbiology in poultry carcasses collected in slaughterhouses and species were identified by multiplex-PCR. Thermophilic Campylobacter spp. was verified in 63.8% of the samples, being 72.2% in chilled carcasses and 55.5% in frozen carcasses. Of these, 83.3% were positive for C. jejuni and 66.6% to C. coli, while 50% were positive for both. The presence of thermophilic Campylobacter spp. in ready-to-eat poultry products represents a potential source of human campylobacteriosis.

Keywords:
campylobacteriosis; poultry slaughterhouses; thermophilic bacteria

Introdução

A campilobacteriose é uma zoonose emergente de origem alimentar com envolvimento principal de cepas termofílicas Campylobacter jejuni, C. coli, C. lari e C. upsaliensis. Os sintomas clássicos da infecção incluem diarreia, frequentemente hemorrágica, dor abdominal, febre, mialgia e raramente vômito^(1,2,3). A doença é reconhecida como um problema de saúde pública e cerca de 76 milhões de ocorrências nos Estados Unidos, com identificação predominante de C. jejuni e C. coli em surtos^(4,5).

Estima-se que entre 50 e 80% das infecções em humanos teria origem avícola, sendo aves e produtos derivados considerados fontes primárias de campilobacteriose^(1,5). Apesar de serem termofílicas em seus requisitos de crescimento, C. jejuni e C. coli não resistem a altas temperaturas e, consequentemente, não sobrevivem em alimentos pasteurizados ou adequadamente cozidos⁽⁶⁾, além de serem sensíveis à dessecação⁽⁷⁾. Entretanto, a superfície das carcaças e miúdos de aves permanecem úmidas durante a comercialização, protegendo as bactérias da dessecação e tornando estes produtos possíveis veículos de Campylobacter spp. ao homem⁽⁸⁾.

Existe uma carência de notificações de campilobacteriose e estima-se que a taxa real de infecção seja entre 7,6 a 100 vezes superior à relatada⁽⁹⁾. No Brasil não existem programas nacionais de vigilância que investiguem a campilobacteriose a campo ou padrões microbiológicos para alimentos visando Campylobacter spp., possibilitando a ocorrência de surtos de origem alimentar. Neste trabalho são identificadas espécies termotolerantes de Campylobacter spp., associadas a Doenças Transmitidas por Alimentos (DTAs), em carcaças resfriadas e congeladas, prontas para consumo humano.

Material e Métodos

O trabalho foi realizado entre 2014 e 2015 em três abatedouros de frangos de corte com duas coletas em cada um, amostrando-se carcaças coletadas logo após resfriamento em chiller, resfriadas a 4^oC por 4 horas e congeladas a -12 ^o C por 24 horas, em triplicata, totalizando 54 carcaças. No laboratório as amostras foram rinsadas com 400 mL de água peptonada tamponada (APT, Oxoid^®) e homogeneizados por 30 segundos.

A detecção de Campylobacter spp. seguiu a ISO 10272-1⁽¹⁰⁾, utilizando-se Campylobacter coli ATCC 33559 como controle positivo e Escherichia coli ATCC 25922 e Proteus mirabilis ATCC 35659 como controles negativos. Para o enriquecimento 1 mL de cada amostra foi inoculado em 9 mL de caldo Bolton e incubados em microaerofilia (Microaerobac Probac^®) a 37 ± 1 °C por 4 horas, sendo posteriormente transferidos para 41,5 ± 1 °Cpor 44 ± 4h.

Após, do caldo Bolton inoculou-se 10 µL nos ágares Charcoal Cefopezarona Desoxicolato Modificado (mCCDA) (CM739,Oxoid^®,UK) e Columbia sangue (CBA) (CM331B, Oxoid^®,UK) com suplemento seletivo contendo Cefoperazona 32mg/L e Amfotericina B 10mg/L (SR155, Oxoid^®,UK), sendo as placas incubadas a 41,5 ± 1 °C por 44 ± 4h, em microaerofilia. Colônias compatíveis com Campylobacter spp. foram estriadas em Ágar Columbia Sangue (CBA), incubadas a 41,5 ± 1 °C por 24 a 48 horas (microaerofilia) e realizados coloração de Gram, motilidade, oxidase e catalase. Após, as colônias foram armazenadas em Caldo Brucella (CM0169, Oxoid) com glicerol e congeladas a - 20 ºC até os ensaios de PCR.

A extração de DNA e o multiplex-PCR foram realizadas conforme Borsoi et al.⁽¹¹⁾. As amostras foram centrifugadas a 12.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante descartado e o pellet obtido suspenso em 800 µL de água ultrapura, homogeneizado e centrifugado a 12.000 rpm por cinco minutos. Este procedimento foi realizado quatro vezes e o material ressuspenso em 200 µL de água ultrapura. Em seguida, as amostras foram colocadas em bloco térmico entre 96 ºC e 98 ºC por 10 minutos, centrifugadas a 12.000 rpm por 10 minutos e o sobrenadante armazenado para as análises por multiplex-PCR.

Utilizou-se o multiplex-PCR proposto por Denis et al.⁽¹²⁾ adaptado por Perdoncini et al.⁽¹³⁾ para diferenciar C. jejuni e C. coli, com três pares de primers para cada reação, baseados na sequência para região 16rRNA comum entre as espécies, como segue: MD16S1 (5'-ATC TAA TGG CTT AAC CAT TAA AC - 3') e MD16S2 (5' -GGA CGG TAA CTA GTT TAG TAT T - 3'), com 857pb. A identificação das espécies C. jejuni e C. coli foram baseadas no gene mapA e ceuE, respectivamente, com a sequência de primers MDmapA1 (5' -CTA TTT TAT TTT TGA GTG CTT GTG - 3') e MDmapA2 (5'-GCT TTA TTT GCC ATT TGT TTT ATT A - 3') para o gene mapA e COL3 (5' -AAT TGA AAA TTG CTC CAA CTA TG - 3') e MDCOL2 (5' -TGA TTT TAT TAT TTG TAG CAG CG-3') para o gene ceuE.

As reações ocorreram em termociclador (Biocycler-Peltier Thermal Cycler) com desnaturação inicial de 95 º C por 10 minutos; 35 ciclos a 95 ºC por 30 segundos; anelamento a 59 ºC por 1 minuto e 30 segundos; extensão a 72 ºC por 1 minuto e extensão final a 72 ºC por 10 minutos. A eletroforese dos amplicons foi realizada em gel de agarose a 1,5% (Invitrogen), corado com brometo de etídio e visualizado por foto documentação com transluminador ultravioleta (UV) (ATTO®).

Resultados e Discussão

Verificou-se positividade para Campylobacter jejuni e/ou C. coli em 63,8% das amostras avaliadas.

Tabela 1
Ocorrência de Campylobacter jejuni e/ou C. coli em carcaças de frango resfriadas e congdadas coletadas em abatedouros avícolas

Abatedouro	Carcaças Resfriadas (%)	Carcaças Congeladas (%)	Total (%)
A	33,3%(l8/54)	0% (0/54)	16,66%
E	100% (54/54)	66,6% (36/54)	83,33%
C	83,3% (45/54)	100% (54/54)	91,7%
TOTAL	72,2% (39/54)	55,5% (30/54)	63,8%

A ocorrência de Campylobacter spp. termotolerantes em carcaças resfriadas foi 72% e 55% em carcaças congeladas, indicando o risco potencial de infecções em humanos que venham a consumir estas carcaças. Estes resultados são superiores aos citados por Mulinari et al.⁽¹⁴⁾, que identificou Campylobacter spp. em 43,2% carcaças de frangos e em 7,7% dos cortes avaliados, sendo que esta alta porcentagem pode ser extrapolada para os demais estabelecimentos da região, que abatem diariamente cerca de 1 milhão de frangos de corte, advertindo sobre a subnotificação da contaminação pelo agente. Dados do FDA⁽¹⁵⁾ mostram entre 30 e 100% das aves portadoras da bactéria e 20 a 100% de contaminação nos produtos do varejo, em consonância com Medeiros et al.⁽¹⁶⁾, que identificaram Campylobacter spp. em 28% de amostras em abatedouros, 38% em supermercados e 7 % em feiras livres.

Sabe-se que o habito culinário da população envolve o cozimento de produtos avícolas, supondo-se que esta ação tenha efeito deletério sobre Campylobacter spp. Entretanto, o risco de contaminação cruzada permanece devido a manipulação das carcaças resfriadas e congeladas.

Franco et al.⁽¹⁷⁾ citam que C. jejuni sobrevive em ambientes e alimentos refrigerados melhor do que em temperatura ambiente, contrariando as características tradicionais de outras bactérias. Neste sentido, Maziero e Oliveira⁽¹⁸⁾ analisaram carne de frango após a embalagem no frigorífico, 4 dias a 4 °C e 28 dias a 20 °C negativos e concluíram que houve diferença significativa em UFC/g de Campylobacter spp. entre amostras frescas e armazenadas sob refrigeração ou congelamento, indicando a sobrevivência da bactéria em carnes resfriadas.

Esta viabilidade de Campylobacter spp. em amostras resfriadas denota um risco extra de contaminação cruzada dada a capacidade da bactéria em resistir à um método tradicional de conservação de alimentos, o que foi demostrado também por Bhaduri e Cottrell⁽¹⁹⁾ ao citar a sobrevivência de C. jejuni a 4 °C e -20 °C em carne de frango artificialmente contaminada e irradiada e mostrar que embora a refrigeração tenha reduzido contagens da bactéria após 3 e 7 dias, células viáveis ainda foram detectadas após 14 dias de estocagem.

Já a sobrevivência de Campylobacter spp. em amostras congeladas é relatada por Lee et al.⁽²⁰⁾ ao citar que Campylobacter spp. pode ser inativado em temperaturas a partir de 15 ºC negativos. Entretanto, para os autores, o congelamento não eliminaria o patógeno em alimentos previamente contaminados, o que foi demonstrado no presente trabalho, onde 55% das carcaças de frango congeladas conservaram células de Campylobacter spp. viáveis.

A contaminação cruzada devido à manipulação inadequada de alimentos no ambiente doméstico é uma fonte importante de infecção⁽²¹⁾. A positividade encontrada nesse estudo e os resultados demonstrados por outros autores, evidenciando a contaminação por Campylobacter spp. nos produtos avícolas é preocupante, visto que a dose infectante para Campylobacter spp. é baixa. Além disto, as espécies identificadas são termotolerantes, e consequentemente passíveis de causar DTAs. Por tratar-se de um produto resfriado e/ou congelado, onde microrganismos deste gênero podem sobreviver às condições de armazenamento, deve-se reforçar a prevenção das infecções por Campylobacter spp. com instruções claras ao consumidor final, bem como a aplicação das Boas Práticas de Fabricação e a indicação de cozimento adequado a estes produtos.

Também, como a contaminação em produtos finais é reflexo da contaminação por Campylobacter spp. na cadeia avícola e consequentemente nos abatedouros, necessita-se com urgência que a pesquisa e quantificação desta bactéria conste dos programas sanitários federais, bem como da legislação para alimentos prontos para consumo.

Conclusão

Verificou-se cepas termotolerantes de Campylobacter spp. em 63,8% das carcaças de frangos congeladas e resfriadas, indicando estes produtos prontos para consumo como fontes potenciais de campilobacteriose em humanos.

Agradecimento

Ao apoio financeiro da Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio Grande do Sul (FAPERGS, Programa Pesquisador Gaúcho - PqG - Edital FAPERGS nº 004/2012) para a compra de meios de cultura, reagentes e kits de PCR.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  2017

Histórico

• Recebido
  22 Jul 2016
• Aceito
  26 Jul 2017