EFEITO DE QUATRO LINHAGENS DE BACILLUS THORINGIENSIS var KURSTAKI EM OVOS E LARVAS DE HAEMONCHUS CONTORTUS

EFFECT OF FOUR STRAINS OF BACILLUS THORINGIENSIS var KURSTAKI ON EGGS AND LARVAE OF HAEMONCHUS CONTORTUS

EFEITO DE QUATRO LINHAGENS DE BACILLUS THORINGIENSIS var KURSTAKI EM OVOS E LARVAS DE HAEMONCHUS CONTORTUS¹

EFFECT OF FOUR STRAINS OF BACILLUS THORINGIENSIS var KURSTAKI ON EGGS AND LARVAE OF HAEMONCHUS CONTORTUS

Terezinha Padilha Charles² Clóvis de Paula Santos³ Joseilde Oliveira Silva-Werneck⁴ José Manoel Cabral de Sousa Dias⁵ Leon Rabinovitch⁶ Tania Guaycurus⁷

RESUMO

Os efeitos ovicida e larvicida de quatro linhagens de Bacillus thuringiensis var. kurstaki foram estudados em bioensaio onde fezes de ovinos contendo ovos de Haemonchus contortus foram incubadas com cultivo em caldo nutritivo constituído por mais de 90% de esporos da bactéria. A cultura foi adicionada a fezes frescas e fezes incubadas por 24 e 48 horas. Após adição da cultura, as fezes eram homogeneizadas e incubadas a 27°C por sete dias. Após este período as larvas eram retiradas através da baermanização e preservadas em formalina para serem quantificadas posteriormente. Duas cepas ocasionaram reduções significativas quando o caldo foi adicionado a fezes frescas ou a fezes incubadas por 24 horas, enquanto uma delas reduziu significativamente o número de larvas recolhidas dos cultivos quando o caldo foi adicionado a fezes incubadas por 24 ou 48 horas. Uma das cepas ocasionou redução significativa apenas quando o caldo foi adicionado em fezes cultivadas por 48 horas.

Palavras-chave: Bacillus thuringiensis, controle biológico, Haemonchus contortus, Nematódeos gastrintestinais, ruminantes.

SUMMARY

Ovicidal and larvicidal effect of Bacillus thuringiensis var. kurstaki on free living stages of trichostrongylid nematodes is being surveyed using a bioassay in which 48-72 hours culture broth (>90% of spores) of the bacteria is added to fresh feces or feces incubated previously for 24 or 48 hours. Treated feces were incubated at 27°C for seven days after which the larvae were recovered through baermanization and formalized for a later counting. Ovicidal effect was observed in two strains and larvacidal effect in four strains.

Key-words: Bacillus thuringiensis, biological control, Haemonchus contortus, gastrointestinal nematodes, ruminants.

INTRODUÇÃO

Os agentes microbianos que promovem redução nas formas de vida livre dos nematódeos poderão contribuir para o controle integrado das verminoses dos ruminantes (WALLER, 1993). Entre as bactérias, Bacillus thuringiensis são as mais estudadas. Observações iniciais de CIORDIA & BIZZELL (1961) demonstraram que um menor número de larvas infectantes foram recolhidos de fezes tratadas com B. thuringiensis var. thuringiensis. BOTTJER et al. (1985) testaram o efeito de trinta variedades de B. thuringiensis, demonstrando que todas foram tóxicas para ovos de Trichostrongylus colubriformis. Mais recentemente BRADFISH et al. (1991) relataram a identificação de diversas variedades de B. tchuringiensis tóxicas para Haemonchus, Trichostrongylus e Ostertagia, e BONE (1992) solicitou patente para Bacillus laterosporus, uma bactéria capaz de inibir a eclosão dos ovos e/ou o desenvolvimento das larvas de nematódeos de ruminantes. Este trabalho relata o efeito de quatro linhagens de Bacillus thuringiensis var. Kurstaki em estágios de vida livre de Haemonchus contortus.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizadas quatro linhagens de Bacillus tchuringiensis, sendo três procedentes do Banco de Germoplasma Microbiano do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia (EMBRAPA - CENARGEN) e uma da Coleção de Culturas do Gênero Bacillus do Departamento de Bacteriologia do Instituto Oswaldo Cruz. Dentre as primeiras, duas foram isoladas de solos brasileiros pela metodologia recomendada pela Organização Mundial de Saúde. Uma delas, a S076, foi isolada em amostra coletada em Padre Bernardo, Estado de Goiás, e a outra, S093, foi isolada de amostra coletada em Uberlândia, Estado de Minas Gerais. A terceira, S128, era originalmente do Instituto Pasteur (Paris, França), assim como a quarta IP/THA-1a/475, depositada na Coleção do Instituto Oswaldo Cruz. Todas as linhagens pertencem a subespécie kurstaki, que corresponde ao sorotipo H3a3b (de BARJAC & FRACHON, 1990; DIAS et al. 1993).

As linhagens foram inoculadas em caldo nutritivo e incubadas em banho-maria a 28°C sob agitação contínua. Quando mais de 90% da cultura era constituída por esporos, o caldo foi homogeneizado e distribuído em amostras de fezes de ovinos. As fezes, contendo mais de 1000 ovos de H. contortus em cada grama (determinado pela técnica de McMaster, de acordo com UENO & GUTIERREZ. 1983), foram obtidas em ovinos infectados experimentalmente com uma cepa local e mantidos no Campo Experimental de Coronel Pacheco da EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Leite, como doadores de ovos. Dez amostras de quatro gramas de fezes frescas, dez amostras incubadas por 24 horas e dez incubadas por 48 horas foram tratadas com a cultura de cada linhagem (3ml de caldo) e dez amostras foram deixadas sem tratamento. As fezes tratadas e não tratadas foram incubadas por um total de sete dias em estufa a 27°C. Após esse período, as larvas foram retiradas através da técnica de Baerman modificada (UENO & GUTIERREZ, 1983). O número de larvas recolhido nos cultivos tratados foi comparado com o número recolhido nos cultivos não tratados, através da análise da variância, após a transformação pela expressão √x, onde x era o número de larvas recolhido. As médias foram comparadas pelo teste de Dunnett, usando o nível de significância de 5% (STEEL & TORRIE, 1960). Para apresentação dos resultados, as médias dos cultivos tratados foram apresentadas como percentual de redução em relação à média dos cultivos não tratados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram observadas diferenças de atividade ovicida e larvicida entre as linhagens estudadas. Os resultados apresentados na Tabela 1 mostram que apenas duas das linhagens testadas (S128 e IP/THA-1a/475) têm efeito ovicida e que todas as linhagens apresentam efeito larvicida. A amostra IP/THA-1a/475 causou uma redução de 60% no número de larvas, quando a bactéria foi aplicada sobre fezes frescas, e 58,3%, quando aplicada sobre fezes com 24 horas de incubação. Na pastagem existem estágios de vida livre em diferentes estágios de desenvolvimento (ovos, larvas de primeiro estágio, larvas de segundo estágio e larvas de terceiro estágio). Logo, estirpes bacterianas com ação nos vários estágios são desejáveis.

A atividades ovicida e larvicida de cepas de B. thuringiensis var. kurstaki contra T. colubriformis foram observadas em experimentos conduzidos em outros laboratórios (BOTTJER et al. 1985; MEADOWS et al. 1989). Existe evidência de que B. thuringiensis causam alteração na permeabilidade dos ovos de T. colubriformis, degeneração das células intestinais e liberação dos lipídios de reserva das formas larvares (BONE et al. 1985; BONE et al. 1986; BONE et al. 1987; BOTTJER & BONE, 1987). O mecanismo de ação das estirpes testadas neste trabalho não é ainda conhecido. Estudos adicionais serão implementados com o propósito de caracterizar esse mecanismo.

²Médico Veterinário, PhD, Pesquisadora da EMBRAPA-Centro Nacional de Pesquisa de Gado de Leite (CNPGL), Rodovia MG 133, Km 42, 36155-000 Coronel Pacheco, MG , autor para correspondência.

³Biólogo, Bolsista do CNPq, EMBRAPA-CNPGL.

⁴Engenheiro Químico, Dr., Pesquisador da EMBRAPA - Centro Nacional de Pesquisa de Recursos Genéticos e Biotecnologia (CENARGEN ), SAIN Parque Rural, 70602-000 Brasília DF.

⁵Engenheiro Agrônomo, Pesquisadora da EMBRAPA-CENARGEN.

⁶Farmacêutico Químico, Livre Docente, Pesquisador Titular do Departamento de Bacteriologia, Instituto Oswaldo Cruz (DB-IOC) Avenida Brasil 4365, Manguinhos, 20930-041 Rio de Janeiro RJ.

⁷Biólogo, MS., Pesquisadora do DB-IOC.

Recebido para publicação em 16.06.94 Aprovado em 12.07.44

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Parte de projeto com o apoio do CNPq.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Ago 2014
• Data do Fascículo
  Dez 1994

Histórico

• Aceito
  12 Jul 1994
• Recebido
  16 Jun 1994