CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE AMOSTRAS DE Haemophilus parasuis ISOLADAS DE SUÍNOS NA REGIÃO SUL DO BRASIL

BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF Haemophilus parasuis STRAINS ISOLATED FROM PIGS IN SOUTHERN BRAZIL

CARACTERIZAÇÃO BIOQUÍMICA DE AMOSTRAS DE Haemophilus parasuis ISOLADAS DE SUÍNOS NA REGIÃO SUL DO BRASIL¹

BIOCHEMICAL CHARACTERIZATION OF Haemophilus parasuis STRAINS ISOLATED FROM PIGS IN SOUTHERN BRAZIL

Maria Aparecida Vasconcelos Paiva Brito² José Renaldi Feitosa Brito³ Cátia Silene Klein⁴

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi caracterizar amostras não hemolíticas de bactérias do gênero Haemophilus isoladas de suínos. As bactérias foram isoladas de material clínico de animais com suspeita da doença de Glässer, de leitões aparentemente sadios provenientes de quatro rebanhos com suspeita clínica desta doença e de casos de poliartrites. Além das características culturais e morfotintoriais, foram utilizados os seguintes testes para a identificação: dependência de NAD(fator V), CAMP, produção de hemolisina, indol, urease e catalase, redução do nitrato e produção de ácido dos carboidratos: glicose, sacarose, arabinose e manose. Dezessete dentre 24 amostras foram classificadas como Haemophilus parasuis (dez isoladas de animais clinicamente doentes e sete de leitões normais). Cinco destas amostras foram classificadas nos sorogrupos 2, 4, 7, ND4 e uma foi não tipável. Quatro das 24 amostras apresentaram características do grupo taxonômico C (teste de arabinose positivo) e três produziram urease. Os testes realizados não permitiram distinguir as amostras urease positivas do gênero Haemophilus das amostras não hemolíticas de Actinobacilius pleuropneumoniae. Mais de 60% das amostras apresentaram sensibilidade in vitro a: ampicilina, cefalotina, cloranfenicol, danofioxacina, nitrofurantoína, penicilina G, polimixina B e tetraciclina.

Palavras-chave: doença de Glässer, Haemophilus parasuis, susceptibilidade a antimicrobianos, identificação bacteriana.

SUMMARY

The aim of this work was to characterize non haemolytic strains of the genus Haemophilus isolated from pigs. The strains were either isolated from pigs with Glässer's disease or from apparently healthy piglets, from four herds supposediy affected by the disease and from pigs with poliarthritis. The strains were characterized by dependence on NAD (V factor), CAMP test, hemolysin, indole, urease and catalase production, nitrate reduction and acid production from glucose, sucrose, arabinose and mannose. Seventeen out of the 24 strains were classified as Haemophilus parasuis (10 isolates from clinically affected animals and seven from healthy piglets). Five of these strains were identified as serovars 2, 4, 7, ND4 and one was nontypeable. Four out of the 24 strains produced acid from arabinose and were tentativelly allocated on taxonomic group C. Three strains produced urease, but the tests did not accuratelly differenciate them from Actinobacilius pleuropneumoniae. In vitro antimicrobial susceptibility test showed that more than 60% of the strains were sensitive to: ampicillin, cephalothin, chloramphenicol, danofioxacin, nitrofurantoin, penicillin, polymyxin B and tetracycline.

Key-words: Glässer's disease, Haemophilus parasuis, antimicrobial susceptibility, bacterial identification.

INTRODUÇÃO

Haemophilus parasuis é um microrganismo que pode ser encontrado na cavidade nasal de suínos sadios e também como agente etiológico da doença de Glässer, que se caracteriza por poliserosite fibrinosa, artrite e septicemia. É também isolado, ocasionalmente, de animais com septicemia ou associado a lesões pneumônicas (RILEY et al., 1977; NICOLET, 1986; PEET et al., 1988; RAPP-GABRIELSON & GABRIELSON, 1992). Em rebanhos "specific pathogen free", onde H. parasuis não é um patógeno comum, os animais são mais susceptíveis e infecções graves têm sido relatadas (SMARTet al., 1986).

Bactérias do gênero Haemophilus isoladas de suínos incluem H. parasuis e as espécies dos grupos taxonômicos C, D, E, F e "minor", ainda sem designação de nome (KILIAN, 1976; MOLLER & KILIAN, 1990). A diferenciação das espécies é feita por testes bioquímicos, havendo grande diversidade de resposta aos testes utilizados (KILIAN, 1976; RAPP et al., 1985, MOLLER & KILIAN, 1990; RAPP-GABRIELSON & GABRIELSON, 1992; GUTIERREZ et al., 1993).

Amostras não hemolíticas de Haemophilus spp suspeitas de pertencerem à espécie parasuis foram isoladas de suínos com sintomalogia clínica da doença de Glässer, na Região Sul do Brasil (SOBESTIANSKY et al., 1988). Subseqüentemente, diversos organismos com essa característica foram isolados no laboratório de Bacteriologia do Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves da EMBRAPA. Não há, contudo, referências sobre a identificação e caracterização desses microrganismos no nosso país. O objetivo deste trabalho foi de descrever a caracterização e a determinação do padrão de susceptibilidade a antimicrobianos dessas amostras.

MATERIAIS E MÉTODOS

Bactérias. As amostras foram isoladas da cavidade nasal de leitões normais com idade entre sete e oito semanas, provenientes de quatro rebanhos com história clínica da doença de Glässer (10 amostras); de líquido sinovial de suínos com aproximadamente seis meses de idade com poliartrites (duas amostras) e de casos clínicos da doença de Glässer (12 amostras).

Exames bacteriológicos. Para o isolamento primário, secreções nasais, líquido sinovial e fragmentos de pulmão e de cérebro foram colhidos com assepsia e semeados diretamente em placas de ágar-sangue (5% v/v de sangue desfibrinado de carneiro). Após a semeadura, passou-se sobre o inoculo uma estria de um cultivo de Staphylococcus aureus β-hemolítico. As culturas foram incubadas a 37°C, em ambiente úmido e atmosfera de 5% de CO₂. Após 48 horas de incubação as colônias com 0,5 a 1,0mm de diâmetro, circulares e translúcidas, foram selecionadas e transferidas para outra placa de ágar-sangue, repetindo-se a estria da cultura de S. aureus.

Repetiram-se os mesmos procedimentos de incubação e, após 48 horas, os cultivos que apresentaram colônias pequenas, não hemolíticas, apenas na vizinhança do crescimento de S. aureus, e que se apresentaram microscopicamente na forma de bastonetes pequenos ou de cocobacilos gram negativos, foram selecionados. A partir do cultivo em ágar-sangue, fizeram-se subcultivos em meio de Triptose ágar (Difco) contendo 10% de soro bovino e de 10 a 50 µg/ml de NAD ( β-Nicotinamida Adenina di-Nucleotídio, fator V). O crescimento bacteriano foi, então, suspenso em soro bovino estéril contendo 7,5% (p/v) de glicose e liofilizado. Um total de 24 amostras isoladas foram caracterizadas bioquimicamente.

Cinco dessas amostras foram enviadas à Dra. V. J. Rapp-Gabrielson (North Dakota State University, USA) para determinação de sorotipo.

Testes bioquímicos. As amostras foram submetidas aos seguintes testes: dependência de NAD, teste de CAMP, produção de hemolisina, indol, urease e catalase, redução de nitrato e fermentação dos carboid ratos: glicose, sacarose, ribose, arabinose e manose. Os testes foram realizados de acordo com as recomendações de KILIAN & FREDERIKSEN (1981). Os tubos para os testes de fermentação dos carboidratos foram inoculados com duas gotas de uma suspensão das bactérias feita em PBS pH 7,4 de cultivos em placas de tryptose ágar (Difco) contendo NAD e soro bovino. Tubos do meio básico (phenol red broth base, Difco) sem os carboidratos, foram igualmente inoculados e incubados em paralelo, para comparação da leitura.

As amostras-padrão dos sorotipos 2, 3 e 7 de H. parasuis, recebidas da Dra. V. J. Rapp-Gabrielson, foram utilizadas como controle dos testes bioquímicos.

Teste de susceptibilidade a antimicrobianos. Seguiu-se o método descrito por BARRY & THORNSBERRY (1985), utilizando-se ágar Mueller-Hinton contendo 10% de soro bovino e 50 µg/ml de NAD e discos de papel de filtro, com os antimicrobianos adsorvidos. As leituras dos halos de inibição foram feitas após 24 horas de incubação. Foram testados os seguintes antimicrobianos: ampicilina, cefalotina, cloranfenicol, lincomicina, nitrofurantoína, penicilina G, polimixina B, sulfametrina, sulfonamidas, tetraciclina e tiamulin.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Os resultados dos testes de caracterização bioquímica das amostras são apresentados na Tabela 1. Três das 24 amostras, isoladas de pulmão, cérebro e líquido de articulação, produziram urease. A produção de urease pelos Haemophilus spp de suínos, tem sido detectada somente para o grupo "minor"(RAPP et al., 1985; MOLLER & KILIAN, 1990; GUTIERREZ et al., 1993). As características das amostras do grupo "minor" são semelhantes a amostras não hemolíticas de Actinobacilius pleuropneumoniae, anteriormente conhecida como H. pleuropneumoniae e posteriormente transferida para o gênero Actinobacillus com base em homologia de DNA e conteúdo G-C (POHL et al., 1983). As quatro amostras urease positivas deram resultado negativo no teste de CAMP. Estudos dos caracteres de A. pleuropneumoniae por MOLLER & KILIAN (1990) mostraram que 100% das amostras davam o teste de CAMP positivo, mesmo as não hemolíticas. Este resultado não foi confirmado por GUTIERREZ et al. (1993), que relataram o teste de CAMP positivo em somente 80,5% de 72 amostras. Para diferenciar as espécies do grupo "minor" das de A. pleuropneumoniae estes autores utilizaram testes de fermentação de carboidratos. Resultados concordantes foram encontrados para manitol (100% das amostras do grupo "minor" são negativas) e rafinose (100% são positivas) (MOLLER & KILIAN 1990; GUTIERREZ et al., 1993). Como estes dois açúcares não foram avaliados, novos testes serão necessários para verificar se estas amostras não hemolíticas e produtoras de urease pertencem ao grupo taxonômico "minor". Tem sido relatado o isolamento de Haemophilus do grupo "minor" de pulmão de suíno, com e sem lesões de pneumonia (LITTLE & HARDING, 1971; MORRISON et al., 1985) mas o papel destes como agente da doença não está definido.

Todas as 20 amostras não produtoras de urease, produziram catalase mas não indol. Esses resultados descartam a possibilidade de classificação destas amostras no grupo taxonômico D e E (dão reação de catalase negativa) ou F (produzem indol) (MOLLER & KILIAN 1990).

Maior dificuldade existe para separar as amostras de H. parasuis daquelas do grupo taxonômico C. MOLLER & KILIAN (1990) testaram 28 amostras de H. parasuis e quatro amostras do grupo taxonômico C, para 41 caracteres. As diferenças entre as duas espécies só foram detectadas com as provas de β-galactosidase, redução do nitrito e fermentação da arabinose e rafinose. Neste trabalho, quatro das amostras testadas fermentaram a arabinose e podem, portanto, ser classificadas no grupo taxonômico C. Três delas foram isoladas da cavidade nasal de leitão sadio e a outra de líquido de articulação de um animal com poliartrite. Espécies do grupo C também têm sido consideradas apatogênicas, mas já foram isoladas de pulmão de suíno com lesões de pneumonia (MOLLER & KILIAN, 1990).

As 17 amostras restantes apresentaram características compatíveis com H. parasuis (KILIAN, 1976; RAPP et al., 1985, MOLLER & KILIAN, 1990). Cinco delas, remetidas a Dra. V. J. Rapp-Gabrielson, foram confirmadas como H. parasuis e classificadas sorologicamente nos sorotipos 2, 4, 7 e ND4. A outra não foi tipável (RAPP-GABRIELSON & GABRIELSON, 1992).

Os testes de susceptibilidade a antimicrobianos mostraram um padrão variável (Tabela 2). Acima de 65% das amostras foram sensíveis a ampicilina, cefalotina, cloranfenicol, danofioxacina, nitrofurantoína, penicilina G, polimixina B e tetraciclina.

Nenhuma amostra foi sensível a lincomicina ou estreptomicina e menos de 50% das amostras foram sensíveis a eritromicina, Sulfametrina, sulfonamidas e tiamulin. NICOLET (1986) relaciona a maior susceptibilidade de H. parasuis a penicilina, ampicilina, cloranfenicol, trimetoprim-sulfonamida e tetraciclinas. Estreptomicina e sulfonamidas estavam entre os menos eficientes in vitro.

Embora o número de testes bioquímicos realizados tenha sido pequeno quando comparado a outros trabalhos (KILIAN, 1976; RAPP et al., 1985; MOLLER & KILIAN, 1990; GUTIERREZ et al., 1993) foi possível identificar a presença de H. parasuis de casos de pneumonia e de poliserosite. Um maior número de características devem ser testadas para separar com segurança as espécies do grupo "minor" das de A. pleuropneumoniae. Quatro das amostras foram classificadas como do grupo taxonômico C, mas outras observações devem ser realizadas para confirmar esta indicação. Devido à variedade de patogenicidade relatada (NICOLET, 1986) entre as amostras de H. parasuis, estudos são necessários para caracterizar a virulência das amostras.

²Farmacêutico-Bioquímico, MSc. PhD, EMBRAPA/CNPGL Rodovia MG 133, Km 42, 36155-000, Coronel Pacheco. MG, autor para correspondência.

³Médico-Veterinário, MSc, PhD, EMBRAPA/CNPGL.

⁴Biólogo, Assistente de Pesquisa, EMBRAPA/CNPSA BR 153, Km 110, 89700-000 - Concórdia - SC.

Recebido paia publicação em 06.07.94. Aprovado em 09.08.94

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¹

Trabalho realizado no Centro Nacional de Pesquisa de Suínos e Aves (CNPSA).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Ago 2014
• Data do Fascículo
  Dez 1994

Histórico

• Recebido
  06 Jul 1994
• Aceito
  09 Ago 1994