Identificação de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis através de PCR-RFLP do gene recA

Identification of Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis through PCR-RFLP of the rec-A gene

ARTIGOS ARTICLES

Identificação de Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis através de PCR-RFLP do gene recA

Identification of Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis through PCR-RFLP of the rec-A gene

Samira O. M. El Tassa^I; Valmir Duarte^II

^IMinistério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento, Superintendência Federal de Agricultura, Pecuária e Abastecimento no Rio Grande do Sul, Av. Loureiro da Silva, 515, CEP 90010-420, Porto Alegre, RS, fax: [phone], e-mail: [e-mail]

^IIDepartamento de Fitossanidade, Faculdade de Agronomia, UFRGS, Cx. Postal 15100, CEP 90001-970, Porto Alegre, RS, fax: [phone], e-mail: [e-mail]

RESUMO

Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis foi proposta como o principal agente causal da canela preta da batata (Solanum tuberosum) no Brasil. Com o objetivo de identificar essa subespécie, oligonucleotídeos iniciadores foram selecionados a partir de regiões heterólogas do gene recA existentes entre P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-41 e outras pectobactérias disponíveis no GenBank e P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1. No entanto, os oligonucleotídeos iniciadores apresentaram baixa especificidade. O produto da PCR do gene recA, um fragmento de ± 730 pb, de 38 estirpes de P. chrysanthemi e das diferentes subespécies de P. carotovorum, foi digerido com as endonucleases de restrição TasI e HhaI. Estas enzimas foram selecionadas com base na seqüência do gene recA das estirpes P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416 (581 pb) e P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1 (626 pb). A análise do PCR-RFLP com as enzimas TasI e HhaI gerou sete e 12 padrões, respectivamente. A combinação dos resultados permitiu a separação em 13 grupos distintos e a discriminação de P. carotovorum subsp. brasiliensis.

Palavras-chave adicionais: pectobactérias, canela preta, podridão-mole, batata, Solanum tuberosum.

ABSTRACT

Pectobacterium carotovorum subsp. brasiliensis has been proposed to be the major causal agent of blackleg of potato (Solanum tuberosum) in Brazil. In order to identify this subspecies, primers were selected from heterologous regions of recA genes present in P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-41, P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1, and other DNA sequences of pectobacteria available in the GenBank. These primers, however, showed low specificity. The recA gene PCR product, a DNA fragment of ± 730 bp, from 38 strains of P. chrysanthemi, subspecies of P. carotovorum, was digested with TasI and HhaI restriction enzymes. These enzymes were selected based on the sequences of recA gene from strains of P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416 (581 pb) and P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1 (626 pb). The restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP) analysis with TasI and HhaI enzymes generated seven and 12 patterns, respectively. Analysis of the combined results allowed for the separation of 13 distinct groups and differentiation of P. carotovorum subsp.brasiliensis.

Additional keywords: pectobacteria, blackleg of potato, potato, Solanum tuberosum.

INTRODUÇÃO

Pectobacterium carotovorum subsp. atrosepticum (van Hall) Hauben et al., P. carotovorum subsp. carotovorum (Jones) Hauben et al., P. chrysanthemi (Bulkholder et al.) Brenner et al. emend. Hauben et al. e, mais recentemente, P. carotovorum subsp. brasiliensis Duarte et al. (Duarte et al., 2004) são as bactérias responsáveis por causar podridão-mole em tubérculos e/ou canela-preta em plantas de batata (Solanum tuberosum L.) (Pérombelon & Kelman, 1987; Duarte et al., 2004). Esta última subespécie foi proposta conforme estudos que mostraram que estirpes brasileiras, isoladas de lavouras do Rio Grande do Sul, inicialmente identificadas como P. carotovorum subsp. atrosepticum (Oliveira et al., 2003), apresentaram perfis genéticos, bioquímicos, fisiológicos e sorológicos diferentes dos esperados para essa subespécie (Duarte et al., 2004). Levantamento posterior, em tubérculos-semente também produzidos nesse estado, mostrou a ausência de P. carotovorum subsp. atrosepticum e uma alta incidência de P. carotovorum subsp. brasiliensis (El Tassa & Duarte, 2004).

A aparente ausência de P. carotovorum subsp. atrosepticum (El Tassa & Duarte, 2004), principal agente causador de canela preta em outros países, e a presença de P. carotovorum subsp. brasiliensis em batata, faz com que as ferramentas para diagnóstico disponíveis no mercado, como anticorpos monoclonais (De Boer & McNaughton, 1987) e oligonucleotídeos iniciadores específicos (De Boer & Ward, 1995; Bertheau et al., 1998) não possam ser utilizadas em programas de certificação no Brasil. Testes bioquímicos e fisiológicos demandam tempo, são trabalhosos e, além disso, a ocorrência de formas intermediárias dificulta a interpretação dos resultados, impossibilitando muitas vezes a identificação correta dessas bactérias (Stanguellini & Meneley, 1975; Jabuonski et al., 1986; Pérombelon & Van Der Wolf, 1998). Novas alternativas baseadas no sequenciamento de genomas bacterianos e no emprego de vários marcadores moleculares têm fornecido mais informações sobre a especificidade dos genomas. Assim como 16S e 23S rDNA, o gene recA, que codifica a enzima recombinase A, pode servir como marcador para a identificação de patógenos bacterianos (Ludwing & Schleifer, 1999). RecA é uma proteína multifuncional envolvida na recombinação homóloga, reparo do DNA e na resposta SOS (Eisen, 1995). Comparações da seqüência da proteína RecA e do gene recA têm sido usadas para especular o relacionamento filogenético entre gêneros e espécies (Lloyd & Sharp, 1993; Eisen, 1995; Karlin et al., 1995). Caracterização genotípica, baseada na análise de PCR-RFLP do gene recA, foi feita com membros do gênero Erwinia/Pectobacterium (Waleron et al., 2002). Essa análise resultou na identificação de espécies e subespécies, bem como de estirpes de P. carotovorum subsp. carotovorum e P. chrysanthemi.

Dessa forma, este trabalho teve por objetivo identificar P. carotovorum subsp. brasiliensis através da análise da seqüência e PCR-RFLP do gene recA.

MATERIAL E MÉTODOS

Estirpes

As estirpes usadas neste estudo estão listadas na Tabela 1.

Extração de DNA

Células bacterianas, cultivadas em meio de cultura Nutriente Agar, com 24-48 h, foram transferidas para 250 ml de tampão de extração (100mM tris-HCl pH 8,0; 25 mM EDTA; 1% SDS e 5 µg de proteinase K), com o auxílio de um palito de dente e incubadas por 3 h a 56 °C em banho-maria. Posteriormente, adicionou-se 250 µl de acetato de amônio 7,5 M e procedeu-se a centrifugação a 14.000 g por 10 min. O sobrenadante foi transferido para outro tubo, adicionado igual volume de isopropanol e incubado durante a noite a -20 °C. O precipitado obtido após centrifugação por 25 min a 14.000 g a 4 °C, foi lavado com etanol 70%, seco a temperatura ambiente, dissolvido em 50 µl de água ultra pura e armazenado a -20 °C (De Boer & Ward, 1995).

PCR e sequenciamento

O DNA extraído dos isolados foi submetido a PCR, utilizando os seguintes oligonucleotídeos iniciadores (5' ® 3'): (GGT AAA GGG TCT ATC ATG CG) / (CCT TCA CCA TAC ATA ATT TGG A) (Waleron et al., 2002) que produzem um fragmento de 730 pb do gene recA. As reações foram feitas em um volume final de 50 µl, onde foi usado 1µM de cada oligonucleotídeo iniciador; tampão de reação (10 mM Tris pH 8,3; 50 mM KCl); 2,5 mM de MgCl₂; 0,25 mM de cada dNTP (Invitrogen); 1,0 unidade de Taq DNA polimerase (Invitrogen) e cerca de 100 ng de DNA (Waleron et al., 2002). As amplificações foram conduzidas em termociclador MJ Research (PTC-100), nas seguintes condições: 95 °C/3 min, (94 °C/1 min, 47 °C/1 min, 72 °C/2 min) 32X, 72 °C/5 min. Os produtos das amplificações foram separados por eletroforese juntamente com marcador de peso molecular 100 pb (Promega), a 4V/cm por 2 h, em gel de agarose 1%, corado com brometo de etídeo, visualizado sob luz ultra-violeta e fotografado através de sistema de análise de gel computadorizado (Kodak Digital Science 1D). Posteriormente, 45µl do produto da reação de duas estirpes (P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416 e P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1) foram encaminhados para sequenciamento no Core Molecular Biology Facility York University (North York, Ontário, Canadá).

Seleção de oligonucleotídeos iniciadores e PCR

As seqüências obtidas foram avaliadas quanto à homologia entre si e com outras seqüências disponíveis na base de dados do GenBank usando o programa BLASTN. Oligonucleotídeos iniciadores foram selecionados a partir de regiões heterólogas da seqüência de DNA, entre P. carotovorum subsp. brasiliensis e as demais estirpes.

A PCR usando estes oligonucleotídeos iniciadores teve as mesmas condições descritas anteriormente. No entanto, visando melhorar a especificidade da reação, diferentes temperaturas de anelamento (47 68 °C) e número de ciclos (25 e 30) foram testados.

PCR RFLP do gene recA

A PCR foi feita como descrita anteriormente. O DNA presente na reação (40 µl) foi precipitado com 4,5 µl de acetato de amônio 3M e 44,5 µl de isopropanol a 20 °C durante a noite. O precipitado foi centrifugado a 17.000 g por 10 min, lavado com 500 µl de etanol 70%, centrifugado novamente na mesma condição anterior, seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 10 µl de água ultrapura. O DNA foi digerido com duas endonucleases de restrição [HhaI (Invitrogen) e TasI (Fermentas)], as quais foram selecionadas com base na seqüência de nucleotídeos do gene recA das estirpes P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416 e P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1, usando o programa Webcutter (Heiman, 2003). A digestão foi feita durante a noite (aproximadamente 12 h) num volume final de 10 ml contendo 2,5 U de cada endonuclease usando o tampão e temperatura [37 °C (HhaI) e 65 °C (TasI)] recomendados pelo fabricante. Os fragmentos foram separados em gel de agarose 2,5%, juntamente com marcador de peso molecular 50 pb (Amersham Biosciences), através de eletroforese de 4 V/cm por 8 h, corado com brometo de etídeo, visualizado sob luz ultra-violeta e fotografado através do sistema de análise de gel computadorizado (Kodak Digital Science 1D). Os padrões de PCR-RFLP, para cada enzima, foram baseados no número de bandas e sua posição. Os grupos de RFLP foram formados pela análise combinada dos padrões obtidos.

RESULTADOS

Sequenciamento do gene recA

A PCR com os oligonucleotídeos iniciadores do gene recA produziu um fragmento de aproximadamente 730 pb para as estirpes analisadas, sendo que o seqüenciamento dos fragmentos das estirpes P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416 e P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1, resultou em seqüências de 581 e 626 pb, respectivamente. A homologia entre as duas seqüências foi de 90%. No entanto, a homologia entre a seqüência do gene recA da estirpe P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416 com as outras seqüências do mesmo gene disponíveis no GenBank, variou de 90 a 99% com as estirpes das subespécies de P. carotovorum. A maior homologia foi verificada com as estirpes de P. carotovorum subsp. carotovorum.

Seleção de oligonucleotídeos iniciadores e PCR

Oligonucleotídeos iniciadores, recAF e recAR, foram selecionados a partir de regiões da seqüência de P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416 de baixa homologia quando comparada com as outras seqüências disponíveis no GenBank e com P. carotovorum subsp. carotovorum BAB1. Um fragmento, de tamanho esperado, de 429 pb foi amplificado do DNA das estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis. No entanto, quando as temperaturas de anelamento variaram entre 47 - 60 °C, algumas estirpes de P. carotovorum subsp. carotovorum tiveram o mesmo fragmento amplificado. Em temperaturas superiores a 60 °C, estas estirpes não tiveram o fragmento amplificado, juntamente com algumas P. carotovorum subsp. brasiliensis (Figura 1).

PCR-RFLP do gene recA

A menor diferenciação dos padrões de RFLP foi observado com TasI, com somente sete padrões com as estirpes testadas (Tabela 2). A maior diferenciação foi obtida com a enzima HhaI, com 12 padrões. O resultado da análise dos padrões (Figura. 2) combinados de PCR-RFLP com o produto do gene recA, usando as enzimas HhaI e TasI, revelarou a presença de 13 diferentes grupos de RFLP (Tabela 2). Estes grupos foram consistentemente diferentes e característicos para as espécies e subespécies testadas, com exceção da estirpe P. carotovorum subsp. carotovorum PPR5 que está presente no mesmo grupo das estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis. A maior diversidade do gene foi observada entre seis estirpes de P. carotovorum subsp. carotovorum, com cinco grupos de RFLP. Por outro lado, as 19 estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis testadas estão distribuídas em três grupos. Três estirpes de P. carotovorum, caracterizadas pela ausência de crescimento a 37 °C, possuem o mesmo padrão de algumas estirpes de P. carotovorum subsp. carotovorum, ficando incluídas no mesmo grupo de RFLP. Estas estirpes já haviam sido identificadas pelo sistema Biolog (Hayward, EUA) como P. carotovorum subsp. carotovorum (El Tassa & Duarte, 2004) e a análise de rep-PCR mostrou que elas estão presentes no mesmo grupo de P. carotovorum subsp. carotovorum (El Tassa & Duarte, 2003).

DISCUSSÃO

Segundo Duarte et al. (2004), análises sorológicas e de composição de ácidos graxos confirmaram que estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis diferem de P. carotovorum subsp. atrosepticum. O sítio de restrição da endonuclease SexAI na região IGS de P. carotovorum subsp. brasiliensis, aparentemente ausente nas outras subespécies e espécies de pectobactérias, foi usado para desenhar um oligonucleotídeo iniciador específico para P. carotovorum subsp. brasiliensis (Duarte et al., 2004). Mas quando este oligonucleotídeo foi usado na PCR para identificação de um número maior de estirpes de pectobactérias em batata, algumas P. carotovorum subsp. carotovorum apresentaram um fragmento do mesmo tamanho (El Tassa & Duarte, 2004). Isto sugere que estas estirpes podem apresentar o sítio de restrição da enzima SexAI na mesma posição que P. carotovorum subsp. brasiliensis.

Dessa forma, um dos objetivos do presente trabalho foi selecionar oligonucleotídeos iniciadores específicos para P. carotovorum subsp. brasiliensis, que pudessem ser utilizados como ferramenta para sua detecção em trabalhos epidemiológicos e de controle. No entanto, o gene escolhido como alvo, recA, não se mostrou adequado para esta proposta. A falta de especificidade dos oligonucleotídeos iniciadores selecionados pode ser explicada pelo uso da endonuclease de restrição HhaI. O oligonucleotídeo iniciador recAF foi selecionado a partir de uma região que continha o sítio de restrição para essa enzima em outras estirpes de pectobactérias e não para P. carotovorum subsp. brasiliensis ATCC BAA-416. No entanto, a análise de RFLP do gene recA revelou que algumas estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis (ATCC BAA-418, cbc2, pmar2, pab10, cbc1, bapb6, bapb8, epb11, cmac19) contém o sítio de restrição para a enzima HhaI na mesma posição. Isto explica a ausência de amplificação com temperaturas de anelamento mais altas, com algumas estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis. Assim, estes oligonucleotídeos iniciadores não podem ser usados para detecção de P. carotovorum subsp. brasiliensis.

Por outro lado, PCR-RFLP do gene recA, com as endonucleases HhaI e TasI, evidenciou a formação de grupos distintos entre as subespécies analisadas, principalmente para P. carotovorum subsp. brasiliensis, apesar de uma estirpe de P. carotovorum subsp. carotovorum estar presente no mesmo grupo. Estes resultados corroboram os obtidos anteriormente com rep-PCR (El Tassa & Duarte, 2003) onde as estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis formaram um grupo homogêneo e separado das demais subespécies. Da mesma forma, evidencia a heterogeneidade de estirpes de P. carotovorum subsp. carotovorum. No entanto, o uso de outras enzimas de restrição e a análise combinada dos padrões de PCR-RFLP, poderão dar maior evidência da distinção entre as espécies e subespécies de pectobactérias.

A caracterização genotípica, realizada por Waleron et al. (2002), de estirpes do gênero Erwinia/Pectobacterium, através de PCR-RFLP do gene recA, identificou 57 grupos de RFLP, sendo 42 dentro do gênero Pectobacterium. Assim como no presente trabalho, o maior número de grupos de RFLP foi obtido com P. carotovorum subsp. carotovorum. Da mesma forma, Seo et al. (2002) identificaram dez grupos de RFLP, do gene recA, entre 92 estirpes de P. carotovorum subsp. carotovorum isoladas de diferentes hospedeiros. Um alto nível de variabilidade nesta subespécie já foi observado em estudos sorológicos (De Boer & McNaughton, 1987) e em análises de RFLP de seqüências de genes de enzimas pectolíticas (Darrasse et al., 1994). Em contraste, neste trabalho as 19 estirpes de P. carotovorum subsp. brasiliensis estão distribuídas em apenas três grupos de RFLP. A baixa variabilidade nesta subespécie também tem sido observada com análise de rep-PCR (El Tassa & Duarte, 2003).

O conhecimento da diversidade é um importante pré-requisito para o desenvolvimento de métodos para identificação e detecção dessas fitobactérias, bem como para classificação taxonômica, estudos epidemiológicos e desenvolvimento de estratégias para o controle da doença, principalmente no que diz respeito à seleção de genótipos e desenvolvimento de variedades resistentes em programas de melhoramento. Isto é particularmente importante quando diferentes espécies e subespécies, bastante relacionadas, causam doença no mesmo hospedeiro, como é o caso das pectobactérias em batata.

Dessa forma, PCR-RFLP do gene recA pode ser usado para a identificação de P. carotovorum subsp. brasiliensis, bem como para estudar a variabilidade de estirpes de pectobactérias.

Aceito para publicação em 22/07/2005

Autor para correspondência: Valmir Duarte

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Mar 2006
• Data do Fascículo
  Fev 2006

Histórico

• Aceito
  22 Jul 2005
• Recebido
  22 Jul 2005