Uso de microssatélites em estudos de biologia da conservação

Use of microsatellite markers in conservation biology studies

Resumo

Os níveis de variabilidade genética populacionais podem ser determinados por marcadores moleculares, como RAPD e AFLP usados em estudos de fingerprinting, ou microssatélites, que são bastante utilizados em estudos de estrutura genética populacional, respondendo a questões ecológicas essenciais para a adoção de medidas conservacionistas. Atualmente são conhecidos microssatélites de regiões codificantes do genoma (SSR-EST), que têm como vantagem a transferabilidade entre espécies próximas em contraste aos microssatélites de regiões anônimas. Esta revisão visa divulgar esta nova modalidade de microssatélites, os SSR-ESTs, que estão sendo cada vez mais utilizados como ferramenta molecular eficiente para estudos populacionais com enfoque em conservação.

Palavras-chaves:
SSR; marcadores moleculares; genética de populações

Abstract

The levels of genetic population variability can be determined by molecular markers, as RAPD and AFLP in fingerprinting studies, or microsatellites, that are used in studies of population genetic structure, answering ecological questions that are essential for the adoption of conservation measures. Nowadays coding region microsatellites were discovered (SSR-EST), and they have the advantage of transferability between related species in contrast to the microsatellites of anonymous regions. This review aims the spreading of this new modality of microsatellites, SSR-ESTs, which are being more and more used as an efficient molecular tool for population studies with approach on conservation.

Key-words:
SSR; molecular markers; population genetics

Introdução aos microssatélites

Dentre os diferentes níveis hierárquicos de biodiversidade, uma importância especial tem sido dado à diversidade genética, que é a base desta hierarquia. Ela geralmente é observada ao nível de espécie, dentro de uma mesma população ou entre diferentes populações. A diversidade genética tem papel importante na conservação de espécies ameaçadas e na manutenção de suas populações ao longo do tempo, pois espécies com baixa variação genética têm geralmente uma redução na habilidade de sobreviver a mudanças ambientais durante o seu processo evolutivo (Frankham, 1995)

As populações naturais possuem em geral altos níveis de variabilidade genética intrapopulacional, que é introduzida continuamente por mutação, migração ou fluxo gênico (Morand et al., 2002), com exceção das espécies que têm reprodução preferencial por endogamia, o que contribui bastante para a diminuição da variabilidade genética em suas populações. Vários estudos já comprovaram que o fluxo gênico em florestas tropicais pode alcançar longas distâncias, sendo importante na manutenção da variabilidade genética (White et al., 2002; Chase et al., 1996), que é fundamental para a manutenção e sobrevivência da espécie e de suas populações, às ameaças causadas principalmente pelo homem (Heuertz et al., 2001).

Tradicionalmente, a diversidade dentro de uma espécie era medida apenas pelas diferenças morfológicas, mas atualmente os métodos de detecção, baseados em dados moleculares, vêm sendo utilizados e considerados como vantajosos sobre os métodos antigos devido ao maior número de caracteres estudados (Ferreira & Grattapaglia, 1998; Karp et al., 1996).

Uma das técnicas mais importantes desenvolvida para estudos de marcadores moleculares é o PCR (Polymerase Chain Reaction - Reação de Polimerase em Cadeia) que consiste numa reação em cadeia por ação da enzima DNA polimerase que copia fragmentos de DNA, desde que exposta a uma fita de DNA- molde, desoxirribonucleotídeos e oligonucleotídeos usados como iniciadores pela enzima polimerásica. O PCR foi inventado em 1983 por Kary Mullis, com base no seu conhecimento sobre seqüenciamento e oligonucleotídeos e, em 1987, junto com o matemático Fred Faloona foi possível provar que o PCR era verossímil e bastante eficiente, marcando o início da era genômica (Mullis & Faloona, 1987).

Dentre os seis principais marcadores moleculares, três não se utilizam do PCR - isoenzimas, RFLP (Restricted Fragment Length Polymorphism - Polimorfismo por Tamanho de Fragmento de Restrição) e minissatélites - e por isso possuem limitações quanto ao número de indivíduos analisados por estudo, principalmente por causa da grande quantidade de material genético necessário e do excessivo trabalho laboratorial com resultados demorados e custosos (Ferreira & Grattapaglia, 1998).

Por outro lado, os outros três são baseados em PCR - RAPD (Random Amplified DNA - DNA Amplificado ao Acaso), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism - Polimorfismo por Tamanho de Fragmento Amplificado) e microssatélites - e permitem a obtenção do resultado mais rapidamente, além de possibilitar estudos populacionais com grande número de indivíduos e também outros tipos de estudo como de genética humana, forenses, de biologia evolutiva e de biologia do desenvolvimento, devido à sensibilidade, velocidade e versatilidade do PCR (Ferreira & Grattapaglia, 1998; White et al., 1989; Williams et al., 1990).

Marcadores dominantes como RAPD e AFLP são usados para fazer análises de fingerprinting em diferentes organismos, inclusive plantas como Eucalyptus (Kirst et al., 2005), Caesalpinia echinata (Cardoso et al., 1998; Cardoso et al., 2005), Euterpe edulis (Cardoso et al., 2000), Veronica alpina (Albach et al., 2006), Viola sp. (Eckstein et al., 2006), Cedrus atlantica (Renau-Morata et al., 2005), Croton alabamensis (Van EE et al., 2006), com o objetivo de avaliar a variação genética e a estruturação populacional. Estas ferramentas são bastante eficientes em estudos com espécies selvagens, pois não necessitam de conhecimento prévio de seqüência de DNA e permitem a análise de uma grande quantidade de indivíduos. Além disso, são técnicas com baixos custos de desenvolvimento e operacional e que necessitam de pouca quantidade de DNA. Porém, uma desvantagem dessas técnicas é de não possuírem definição suficiente para estudos de parentesco ou mapeamento genético, por não possibilitarem a visualização dos alelos por locus, ou seja, a determinação de heterozigotos e homozigotos.

Os microssatélites ou SSR (Simple Sequence Repeats - Repetições Simples de Seqüência) são repetições em tandem de 1 a 6 nucleotídeos, encontrados em todos os procariotos e eucariotos estudados até o momento (Zane et al., 2002). Os microssatélites foram encontrados no genoma de eucariotos no final da década de 80 (Tautz, 1989) e logo os pesquisadores perceberam os altos níveis de polimorfismo deste marcador, comprovando que se tratava de uma nova ferramenta molecular bastante eficiente, com pelo menos o dobro de informação obtida duas vezes mais rapidamente do que outros marcadores (Weber, 1990).

Um dos trabalhos mais significativos da época, provou a hipervariabilidade destes marcadores em Drosophila melanogaster e em baleias e a sua hereditariedade no homem (Tautz, 1989). Já na década de 90, trabalhos encontraram estes marcadores moleculares no genoma de plantas ocorrendo com freqüência similar à encontrada no genoma de vertebrados (Akkaya et al., 1992). Atualmente, sabemos que existem microssatélites tanto no genoma nuclear das plantas (Condit & Hubbell, 1991; Wang et al., 1994) como no genoma de cloroplastos (Powel et al., 1995).

A taxa de mutação do genoma de cloroplasto é baixa, o que era uma barreira para sua utilização em estudos populacionais até serem descobertos microssatélites de repetições mononucleotídicas ao longo deste genoma (Provan et al., 2001). Acredita-se que os marcadores microssatélites de cloroplasto sejam uma ótima ferramenta em estudos de fluxo gênico e padrões de cruzamento (Provan et al., 2001; Provan, 2000; Vendramin et al., 2000). Além de estudos de avaliação da estrutura genética de populações vegetais e modo de herança do cloroplasto (Weising & Gardner, 1999) em gimnospermas Picea abies K (Vendramin et al., 2000), Abies sp (Clark et al., 2000; Vendramin et al., 1999) e em angiospermas Silene paradoxa L (Mengoni et al., 2001), Fraxinus sp (Morand-Prieur et al., 2002) e Caesalpinia echinata (Lira et al., 2003).

Os marcadores microssatélites tornaram-se extremamente difundidos na biologia, apesar do alto custo de desenvolvimento, sendo atualmente utilizados em um grande número de estudos para investigar a estrutura genética de populações, respondendo a perguntas específicas nas áreas da biologia evolutiva e da biologia da conservação (Balloux & Lugon-Moulin, 2002). Isto se dá devido a três características presentes nos microssatélites: (1) a neutralidade, pois representam o genoma inteiro; (2) a abundância com ampla distribuição pelo genoma; e (3) o alto polimorfismo encontrado mesmo em populações que passaram por eventos como gargalos ou em populações que possuem baixo polimorfismo detectado por outros marcadores (Maudet et al., 2002).

Microssatélites são marcadores codominantes, ou seja, podem ser observados ambos os alelos presentes no mesmo locus, possibilitando a sua aplicação em estudos genéticos e ecológicos através da detecção da estrutura genética de populações isoladas e fragmentadas, possibilitando análises do sistema reprodutivo de plantas e animais e suas conseqüências como porcentagem de heterozigosidade nas populações (Morand et al., 2002; Collevatti et al., 2001; Heuertz et al., 2001; White et al., 1999). Através dos oligonucleotídeos complementares às seqüências flanqueadoras das repetições dos microssatélites, são obtidos produtos de tamanhos variados correspondendo às expansões e/ou contrações da região repetitiva (Provan et al., 2001).

A maior limitação ao uso de marcadores microssatélites é o grande trabalho necessário para o desenvolvimento e isolamento dos loci que contêm estes marcadores (Zane et al., 2002), principalmente para plantas, cujo número de repetições de dinucleotídeos é 10 vezes menor do que nos primatas. Para contornar esta situação foram desenvolvidos diferentes métodos de enriquecimento de bibliotecas genômicas (White & Powell, 1997; Edwards et al., 1996; Ostrander et al., 1992). Zane et al. (2002) indicam diferentes tipos de isolamento de microssatélites, porém todos são bastante custosos, o que gera um empecilho para se trabalhar com estes marcadores moleculares. Após seu isolamento, faz-se necessário tornar os iniciadores desenvolvidos para a amplificação via PCR dos loci microssatélites funcionais através da otimização das condições ideais do próprio PCR. Este segundo passo pode tornar-se tão problemático quanto o primeiro passo de isolamento, em termos de dinheiro e tempo gasto (Squirrell et al., 2003).

Tabela 1
Ferramentas para busca de microssatélites em bancos de dados de ESTs. Adaptado de Varshney et al. (2005).
Table 1
Tools for microsatellite research in EST’s databases. Adapted from Varshney et al. (2005).

Programa	Ref.
MIcroSAtellite (MISA)	http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/; Thiel et al. (2003)
SSRFinder	Gao et al. (2003)
BuildSSR	Rungis et al. (2004)
SSR Identification Tool (SSRIT)	Kantety et al. (2002)
Tandem Repeat Finder (TRF)	Benson (1999)
Tandem Repeat Occurrence Locator (TROLL)	Castelo et al. (2002)
CUGIssr	http://www.genome.clemson.edu/projects/ssr/
Sputnik	http://abajian.net/sputnik/index.html
Modified Sputnik	Morgante et al. (2002)
Modified Sputnik II	http://wheat.pw.usda.gov/ITMI/EST-SSR/LaRota/
SSRSEARCH	ftp://ftp.gramene.org/pub/gramene/software/scripts/ssr.pl

Com o estabelecimento de bancos de dados de seqüências expressas do genoma (EST - Expressed Sequence Tags - Partes de Seqüências Expressas ), uma nova modalidade de microssatélites foi descoberta, os microssatélites gênicos ou EST-SSR. O desenvolvimento destes marcadores é relativamente fácil e tem baixo custo porque são utilizadas seqüências disponibilizadas na internet e programas de computador distribuídos gratuitamente para isolar o microssatélite gênico e desenhar os oligonucleotídeos iniciadores do PCR (Varshney et al., 2005). As principais vantagens desta técnica segundo Woodhead et al. (2005) são: 1) regiões codificantes possuem menor taxa de mutação o que diminuiria a ocorrência de alelos nulos e ainda permitiria uma maior transferabilidade destes marcadores entre espécies; 2) o baixo nível de mutação resultaria também em menor homoplasia; 3) alguns trabalhos com espécies cultivadas obtiveram fragmentos mais limpos com bandas melhor definidas do que aquelas obtidas com os microssatélites genômicos.

Microssatélites em regiões não-codificantes e codificantes

O método tradicional para o desenvolvimento de marcadores microssatélites envolve a criação de bibliotecas genômicas de inserto pequeno, a posterior hibridização com oligonucleotídeos repetidos em tandem e o seqüenciamento de clones candidatos, tornando assim o processo lento, trabalhoso e caro (Thiel et al., 2003).

EST (Expressed Sequence Tags - Partes de Sequências Expressas) são porções seqüenciadas de cDNA (DNA complementar), que são cópias do mRNA (RNA mensageiro). Por isso, eles representam parte da porção transcrita do genoma em certas condições e são bastante conservados entre espécies próximas (Poncet et al., 2006). O aumento no número de banco de dados de ESTs disponíveis permitiu a busca de microssatélites derivados de ESTs (SSR-EST), diminuindo assim o tempo e dinheiro necessários para o seu isolamento (Thiel et al., 2003).

O Instituto TIGR (The Institute for Genomic Research - www.tigr.org) possui um banco de dados de ESTs com 232 espécies de plantas, dentre elas estão 10 coníferas, 150 dicotiledôneas e 41 monocotiledôneas. A grande maioria destas espécies é de importância econômica, e por isso é difícil encontrar seqüências de espécies selvagens que não são cultivadas ou não têm interesse econômico cujo estudo visa apenas a sua conservação.

Para a identificação dos microssatélites derivados de ESTs, alguns programas foram criados na linguagem Pearl como o MISA (MIcroSAtellite) que é um módulo de busca com várias características úteis para o controle de qualidade das seqüências de ESTs e para o desenvolvimento de iniciadores que amplificarão os loci contendo microssatélites (Varshney et al., 2005). Na Tabela 1 estão algumas destas ferramentas de busca.

Tabela 2
Resumo de algumas questões ecológicas que podem ser respondidas com marcadores genéticos neutros, separados por tipo de dados necessário. Adaptado de Selkoe & Toonen (2006).
Table 2
Summary of some ecological questions that can be answered with neutral genetic markers, separated for the type of data necessary. Adapted from Selkoe & Toonen (2006).

Necessita de dados de frequência alélica multi-locus*

De qual população estes indivíduos se originaram?

Quantas populações existem?

Necessita de dados de microssatélites ou alto polimorfismo de sequência**

Esta população se expandiu ou se contraiu nos últimos anos?

As populações são diferentes em tamanho no passado e no presente?

Necessita de identificação genotípica multi-locus***

Qual a relação genética entre os indivíduos?

Quais indivíduos migraram?

Quais indivíduos são clones?

Pode ser feito com diferentes marcadores moleculares**

Qual a distância de dispersão média dos descendentes (ou gametas)?

Quais são as relações fonte-sumidoro entre as populações?

Como condições do meio-ambiente causam impacto na estrutura populacional e migra ção?

Qual a dinâmica de extinção e recolonização da metapopulação?

A estrutura populacional ou sua conectividade mudou nos últimos anos?

• ^*
  Estas análises podem necessitar de >10 microssatélites - o número está inversamente correlacionado com o grau de diferenciação genética entre as populações. Espécies com baixa taxa de migração e/ou populações pequenas necessitam de menos loci.
• ^**
  Usando >1 locus diminuirá substancialmente erro amostral interlocus.
• ^***
  Geralmente necessita de microssatélites, mas também é possível com AFLP e RAPD

A avaliação de germoplasmas usando microssatélites derivados de ESTs pode aumentar o poder dos marcadores moleculares permitindo examinar a diversidade funcional em plantas fenotipicamente bem caracterizadas, pois expansões e contrações das repetições destes SSR-ESTs de genes de função conhecida podem ser relacionadas com variação fenotípica ou, melhor ainda, com função biológica (Eujayl et al., 2002).

Com relação às plantas, os microssatélites isolados a partir de seqüências ESTs estão sendo bastante utilizados em espécies cultivadas como trigo, cevada, café, laranja, amêndoa e girassol (Gao et al., 2004; Thiel et al., 2003; Poncet et al., 2006; Chen et al., 2006; Xie et al., 2006; Pashley et al., 2006).

Uma das grandes vantagens destes marcadores provenientes de regiões expressas do genoma é a transferabilidade entre espécies relacionadas em contraste aos microssatélites de regiões anônimas, refletindo a natureza conservadora das regiões codificantes quando comparada às regiões não-codificantes (Varshney et al., 2005b). A posição dos microssatélites gênicos com relação à região codificante resulta em diferentes níveis de polimorfismo, onde as regiões 3’UTR (Untranslated Regions - Regiões Não-Traduzidas) são mais polimórficas no nível de cultivares, as regiões 5’UTR são mais polimórficas entre cultivares e espécies, e a seqüência codificante do gene é mais polimórfica entre espécies e gêneros (Varshney et al., 2005).

Figura 1
Número de artigos referente à pesquisa realizada pela ferramenta Web of Science do site ISI Web of Knowledge [v3.0] (http://isiknowledge.com) utilizando como palavras-chaves conservação (conservation) e DNA.
Figure 1
The number of articles resulting from the research made by the tool search Web of Science of the site ISI Web of Knowledge [v3.0] (http://isiknowledge.com) using the keywords conservation and DNA.

Aplicações dos microssatélites para conservação

Segundo Liu & Cordes (2004), os marcadores moleculares AFLP e microssatélites estão ainda em fase exponencial de crescimento com relação ao número de trabalhos publicados utilizando estas ferramentas e por isso eles parecem ser os principais atores na revolução genômica.

Devido à alta variabilidade dos microssatélites e à possibilidade de se obter marcadores mendelianos multi-alélicos, eles são especialmente úteis para inferir eventos demográficos recentes, inclusive detecção de impactos induzidos pelas comunidades humanas nas populações (Pearse & Crandall, 2004). Os microssatélites emergiram como uma das opções mais populares para estudos genéticos com questões ecológicas, em parte porque eles possuem potencial para determinar estimativas de migração, têm poder para distinguir relativamente altas taxas de migração para panmixia, e podem estimar a relação de parentesco entre os indivíduos (Selkoe & Toonen, 2006).

Os principais marcadores moleculares citados na introdução, que são considerados marcadores neutros, podem ser utilizados em diferentes tipos de estudos ecológicos com o objetivo de responder a perguntas importantes sobre a biologia da espécie e suas populações. Na Tabela 2, temos algumas destas questões ecológicas e o tipo de dados moleculares que são necessários para respondê-las.

Dentre as principais aplicações dos microssatélites estão mapeamento genético, identificação individual por DNA e estudos de parentesco, filogenia, genética de populações e genética da conservação, epidemiologia e patologia molecular, mapeamento de QTLs (Quantitative Trait Loci - Loci de Traços Quantitativos), e seleção assistida por marcador (Chistiakov et al., 2006).

Os microssatélites vêm sendo muito utilizados para responder várias perguntas relacionadas à genética de populações, como análises de fluxo gênico, paternidade e estruturação populacional, que resultam em dados sobre a distribuição da variabilidade genética entre e dentro de populações naturais, que são essenciais para a adoção de medidas de conservação tanto ex situ quanto in situ (Oliveira et al., 2006).

A obtenção de dados sobre a variabilidade genética permite um melhor entendimento de processos populacionais como dispersão e migração, história demográfica de populações como gargalos e efeito fundador, detecção de híbridos entre espécies, fluxo gênico e deriva gênica, filogeografia, ecologia de paisagem como distribuição, movimentos e dispersão dos animais, e ecotoxicologia (deYoung & Honeycutt, 2005).

Figura 2
Número de artigos referente à pesquisa realizada pela ferramenta Web of Science do site ISI Web of Knowledge [v3.0] (http://isiknowledge.com) utilizando como palavras-chaves DNA, microssatélites (microsatellite), AFLP, RAPD, RFLP, isoenzimas (isozyme), minissatélites (minisatellite), juntamente com a palavra conservação (conservation).
Figure 2
The number of articles resulting from the research made by the tool search Web of Science of the site ISI Web of Knowledge [v3.0] (http://isiknowledge.com) using the keywords DNA, microsatellite, AFLP, RAPD, RFLP, isozyme, minisatellite, all with the word conservation.

Publicações atuais sobre conservação

O número de publicações utilizando ferramentas moleculares em estudos de conservação é cada vez maior, de apenas 13 artigos em 1990 aumentou para 710 artigos em 2006. Na figura 1, o gráfico com a evolução do número de artigos publicados bianualmente nos últimos 16 anos mostra três saltos significativos quanto ao número de publicações utilizando o DNA como ferramenta: de 1990 para 1992, com a diferença de 276 artigos; de 1996 para 1998, com diferença de 106 artigos; e de 2002 para 2004, com diferença de 178 artigos. Uma possível explicação para este rápido incremento na quantidade de artigos publicados por ano, é a implementação e o desenvolvimento de novas técnicas que, além de aumentarem a eficiência dos procedimentos, tornaram-se capazes de reduzir seus custos.

De todas estas publicações com DNA, as mais significativas com relação à conservação utilizam microssatélites como ferramenta. E os três principais marcadores moleculares baseados em PCR, RAPD, AFLP e os próprios microssatélites, são os mais representativos, enquanto que os outros marcadores, RFLP, isoenzimas e minissatélites, têm menor difusão para este tipo de estudo.

A Figura 2 mostra a tendência de uma expansão na utilização dos marcadores microssatélites em estudos de conservação, seguidos de forma menos expressiva pelos marcadores AFLP e RAPD. Além disso, pode ser ainda observado o uso cada vez menor dos marcadores RFLP, isoenzimas e minissatélites, devido às suas duas maiores desvantagens: grande quantidade de material necessário e trabalho laboratorial intenso e custoso.

Conclusão

Os microssatélites são ferramentas bastante robustas e importantes para estudos genéticos de diversidade visando a conservação das espécies (Selkoe & Toonen, 2006). Um dos limitantes de uso desta ferramenta é justamente o isolamento dos marcadores microssatélites a partir de DNA genômico em bibliotecas enriquecidas com repetições de di ou trinucleotídeos (Squirrel et al., 2003).

Com o surgimento de bancos de dados de ESTs, que são seqüências codificantes do genoma, e com o constante aumento no número de espécies estudadas e seqüências depositadas, foi possível obter microssatélites presentes nestas regiões do genoma através de uma busca relativamente simples dentro dos bancos de dados. Muitos programas já foram desenvolvidos com o objetivo de facilitar o isolamento destes marcadores (Varshney et al., 2005).

Atualmente a maioria das publicações utilizando-se desta ferramenta visa o mapeamento genético e o estudo da diversidade funcional de espécies cultivadas ou com importância econômica, sendo os microssatélites de regiões anônimas os mais importantes em estudos de fingerprinting e identificação parietal (Varshney et al., 2005). No entanto, os SSR-ESTs representam uma ferramenta adicional para geneticistas populacionais de plantas ou ecologistas moleculares, pois trabalhos examinando a sua transferabilidade entre espécies e os resultados com populações naturais indicam que estes marcadores são muito mais estáveis e fáceis de amplificar do que os microssatélites de regiões anônimas do genoma (Woodhead et al., 2005; Ellis et al., 2006).

Um limitante dos microssatélites gênicos seria justamente a possível seleção que este marcador sofreria, mas Woodhead et al. (2005) perceberam que a diferenciação genética não estava sendo afetada pela seleção, pois os valores de Fst - definido por Pearse & Crandall (2004) como o parâmetro padrão usado para descrever o nível de diferenciação entre subpopulações - baseados em SSR-EST, SSR genômico e AFLP foram parecidos. Aparentemente, portanto, os microssatélites derivados de ESTs parecem ser geralmente neutros podendo ser usados em estudos de efeito demográfico sobre o nível de variação genética, muito comuns em estudos de conservação de espécies (Ellis et al., 2006).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Out 2023
• Data do Fascículo
  Apr-Jun 2006

Histórico

• Recebido
  20 Out 2006