Enzima conversora de angiotensina I (ECA) N-domínio 90-kDa: possível marcador para hipertensão em modelo de transplante renal

Resumo

Introdução:

A hipertensão é altamente prevalente pós-transplante renal e vários fatores estão associados incluindo o tratamento com imunossupressores e a predisposição genética.

Objetivo:

Os objetivos foram avaliar os efeitos do transplante do rim de ratos espontaneamente hipertensos (SHR) em ratos Wistar, e a possível transferência da ECA N-domínio de 80/90-kDa para os tecidos dos receptores.

Métodos:

Para isso, os dados dos animais Wistar receptores dos rins de SHR foram comparados aos dados dos Wistar submetidos ao tratamento com CsA e Wistar Sham.

Resultados e Discussão:

Apesar da pressão arterial permanecer inalterada nos estágios iniciais pós-transplante renal, a expressão da ECA de 80/90-kDa foi identificada na urina de ratos 7 e 15 dias após o transplante, e de forma mais intensa aos 30 dias após a cirurgia, quando os animais tornaram-se hipertensos.

Conclusão:

Nossos dados mostram que ECA N-domínio está associada ao desenvolvimento da hipertensão, e que este marcador pode ser identificado na urina pós-transplante renal antes mesmo de qualquer alteração da pressão arterial.

Palavras-chave:
hipertensão; sistema renina-angiotensina; transplante de rim

Abstract

Introduction:

Hypertension is nearly universal in kidney transplant and several factors are associated with post transplant hypertension, including immunosuppressive medications and genetic predisposition.

Objective:

The aims were to evaluate the effects of spontaneously hypertensive rats (SHR) kidney transplantation in Wistar rats and the possible transference of 80/90-kDa N-domain ACE.

Methods:

To do so, the data from Wistar recipients of kidney from SHR were compared to data from transplanted Wistar submitted to CsA treatment and, to Wistar Sham.

Results and Discussion:

Despite the unaltered blood pressure observed at early stages, 80/90-kDa ACE was found expressed in the urine of rats 7 and 15 days after transplantation, which was intense when rats became hypertensive 30 days post-surgery.

Conclusion:

Our data show that this enzyme is associated with the development of hypertension, and this marker appears in the urine before any substantial blood pressure alteration.

Keywords:
hypertension; kidney transplantation; renin-angiotensin system

Introdução

A hipertensão é um achado quase universal em receptores de transplante renal resultante da interação de vários fatores, incluindo medicamentos imunossupressores, disfunção do enxerto, bem como predisposição genética.¹

Embora tenha sido demonstrado que o aumento da pressão arterial pós-transplante ocorre em 90% dos casos secundariamente a terapia com imunossupressores como a ciclosporina (CsA),² essa classe de fármacos continua a desempenhar um papel fundamental na prevenção da rejeição do aloenxerto renal. O exato mecanismo da hipertensão induzida por CSA permanece obscuro, mas várias linhas de evidência sugerem o envolvimento do sistema renina-angiotensina (SRA).³

A caracterização da enzima conversora da angiotensina (ECA) N-domínio 80/90-kDa como possível marcador biológico de hipertensão nos levou a supor que tal proteína pudesse estar associada ao desenvolvimento de hipertensão em pacientes transplantados renais.^4-6 Assim, o presente estudo prestou-se a investigar: 1) os efeitos do transplante renal sobre ratos Wistar espontaneamente hipertensos (SHR) e a possível transferência da isoforma 80/90 kDa da ECA; e 2) se tal transferência pode contribuir para o desenvolvimento da hipertensão induzida por CsA.

Material e métodos

Procedimentos gerais

Ratos Wistar machos espontaneamente hipertensos (SHR) de quatro meses de idade foram aleatoriamente divididos nos seguintes grupos (n = 6/grupo): 1) grupo de controle-placebo: ratos Wistar que tiveram seus rins removidos e retransplantados no mesmo compartimento, sacrificados após sete, quinze ou trinta dias (C-7, C-15 e C-30); 2) grupo transplante: ratos Wistar que receberam rim de um SHR, sacrificados sete, quinze ou trinta dias após o transplante (T-7, T-15 e T-30); 3) grupo transplante tratado com CsA: ratos Wistar que receberam rim de um SHR tratados com dose intraperitoneal diária de CsA (2mg/Kg/dia) por sete, quinze ou trinta dias após a cirurgia (TCsA-7, TCsA-15 e TCsA-30). Os protocolos foram aprovados pela Comissão de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (número 04348/02).

Transplante renal

Os rins esquerdos de SHR foram ortotopicamente transplantados nos ratos Wistar receptores após nefrectomia ipsilateral sob anestesia. Por um breve período, o rim esquerdo foi removido e mantido em soro fisiológico frio. Após o clampeamento dos vasos renais, o rim esquerdo nativo do receptor foi removido e substituído pelo rim do doador; anastomoses término-terminais foram realizadas nos vasos renais e ureter.⁷

Análise da pressão arterial sistólica

A pressão arterial sistólica (PAS) foi medida nos ratos conscientes, por meio de um sistema manguito de cauda computadorizado (BP-2000, Blood Pressure Analysis System^TM, Visitech System)⁸ sete, quinze e trinta dias após a manipulação cirúrgica ou transplante renal.

Coleta de urina e tecidos

Sete, quinze e trinta dias após a manipulação cirúrgica ou transplante renal, os ratos foram colocados em gaiolas metabólicas por 24 horas para coleta de urina. Ao final do protocolo, os ratos foram sacrificados por decapitação e o sangue do tronco e os órgãos foram colhidos. Rins e pulmões foram homogeneizados⁹ e a concentração de proteína foi determinada pelo método de Bradford.¹⁰

Detecção de eca por western blot

A eletroforese foi realizada de acordo com o método de Laemmli.¹¹ As bandas foram reveladas por meio dos substratos tetrazólio nitroazul (NBT)/5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) (NBT/BCIP).

Sequência NH2-terminal da isoforma 80/90 KDA da ECA purificada

A sequência NH2-terminal das ECAs foi deduzida a partir do sequenciamento dos aminoácidos utilizando um sequenciador de proteínas (modelo PPSQ-23, Shimatzu).¹²

Ensaio de atividade enzimática

A atividade catalítica da ECA foi determinada de acordo com o método descrito por Friedland e Silverstein,¹³ utilizando o substrato Z-Phe-His-Leu.¹²

Análise estatística

Os resultados foram apresentados na forma de média ± erro padrão da média (EPM). Os dados foram avaliados por ANOVA de fator único com o teste de diferença significativa de Fisher. Valores de p < 0.05 foram considerados significativos.

Resultados e discussão

São várias as causas que podem contribuir para a hipertensão pós-transplante. Os fatores relacionados aos doadores não se resumem apenas a hipertensão pré-existente e baixa qualidade do enxerto, mas incluem também fatores genéticos. Em tal contexto, descrevemos a presença da isoforma 80/90 kDA da ECA na urina e nos rins de indivíduos com predisposição a hipertensão, pacientes e animais hipertensos.^4-6 Assim, pretendemos avaliar se a transferência de isoformas da ECA ocorre quando um enxerto renal de um SHR é transplantado para um rato normotenso, como o SRA é afetado, e a correlação entre PAS e presença de isoforma 80/90-kDa da ECA na urina.

Os ratos espontaneamente hipertensos apresentaram PAS significativamente mais elevada do que os ratos Wistar (171 ± 8 x 120 ± 2 mmHg, p < 0,05, Figura 1). Sete e quinze dias após o transplante, a PAS dos receptores de rins de SHR estava semelhante à dos animais nos grupos C e Wistar, e significativamente mais baixa do que a PAS do grupo SHR (Figura 1). Por outro lado, 30 dias após o transplante renal de SHR, o grupo T apresentou PAS significativamente mais elevada (em comparação aos grupos C e Wistar), como visto nos SHR (Figura 1). Além disso, os resultados mostram que o tratamento com CsA não influenciou a PAS sete, quinze ou trinta dias após o transplante renal. Corroborando nossos achados, Kawabe et al.¹⁴ e Rettig et al.¹⁵ mostraram que a PAS em ratos submetidos a transplante renal é fortemente determinada pelo perfil genético do rim transplantado.

Figura 1
PAS basal de SHR ou ratos Wistar transplantados após sete, quinze ou trinta dias de manipulação cirúrgica ou transplante renal, tratados ou não com ciclosporina (CsA, 2mg/Kg/dia; n = 6/grupo). Valores representados como média ± EPM. SHR: ratos espontaneamente hipertensos (SHR); C: controle placebo Wistar; T: ratos Wistar receptores de transplante renal de SHR; TCsA: ratos Wistar receptores de transplante renal de SHR tratados com CsA. ⁺ vs. Todos os grupos experimentais; * vs. C-30; ^& vs. T-7 e T-15; ^# vs. TCsA-7 e TCsA-15; p < 0,05.

Segundo a Figura 2, a urina dos ratos Wistar que receberam rins de SHR apresentou três isoformas da ECA: a isoforma somática com 190-kDa, a isoforma N-domínio com 65-kDa e a isoforma 80/90-kDa da ECA. Esta última foi detectada na urina dos SHR e dos indivíduos do grupo T sete dias após o transplante (T-7), com expressão aumentada trinta dias após o procedimento (T-30; Figura 2).

Figura 2
Análise da expressão de isoformas da ECA na urina de SHR e ratos Wistar transplantados após sete, quinze ou trinta dias (anticorpo anti-ECA - 9B9). Faixa 1: padrão de peso molecular, Faixa 2: C-30, Faixa 3: SHR; Faixa 4: T-7, Faixa 5: T-15, Faixa 6: T-21, Faixa 7: T-30.

É importante destacar que os ratos Wistar normalmente não expressam essa isoforma, como descrito por Ronchi et al.⁴ Considerando-se que a detecção da isoforma 80/90-kDa da ECA na urina dos grupos T-7 e T-15 ocorreu apesar da ausência de alterações na PAS, os resultados demonstram que a mensagem da proteína é transferida, predispondo esses animais ao desenvolvimento de hipertensão.

O transplante parece afetar a expressão da isoforma 80/90-kDa em rins transplantados, que mostrou-se mais elevada no grupo não tratado com CsA em relação ao tratado (Figura 3, Faixa 1 x Faixa 6), indicando que essa isoforma pode ser intensamente afetada pela resposta imunológica ao transplante.

Figura 3
Análise da expressão da isoforma de ECA no tecido renal nos grupos SHR, placebo Wistar C e T-30 (anticorpo anti-ECA 9B9). Faixa 1: rim nativo de T-30; Faixa 2: SHR; Faixa 3: Wistar; Faixa 4: rim nativo de C-30; Faixa 5: aloenxerto renal de T-30; Faixa 6: rim nativo de TCsA-30.

Além das células imunológicas transferidas com o enxerto renal, macrófagos nativos e outras células imunológicas que portam a mensagem genética da isoforma 80/90-kDa da ECA transferidas com o enxerto renal, podem migrar para o órgão transplantado, elevando localmente a expressão da isoforma. Tal hipótese é corroborada pela observação da redução da expressão da isoforma 80/90-kDa da ECA durante tratamento com CsA.

A sequência NH2-terminal da isoforma da ECA purificada com 80/90-kDa de rins transplantados é descrita na Tabela 1. O sequenciamento mostrou que a isoforma 80/90-kDa da ECA de rins nativos dos grupos T-30 e TCsA-30 era semelhante à das ECAs de ratos somáticos, camundongos e humanos (~80% homologia), comprovando que as enzimas detectadas contêm a porção NH2-terminal da molécula (Tabela 1).

Tabela 1
Sequências NH2-terminal da isoforma 80/90-KDA e alinhamento comsequências N H2-terminal da eca de bovinos, camundongos, ratos e humanos

Grupos	Sequência
ECA rins nativos T-30	DPGXQPGNXS
ECA rins nativos TCsA-30	- PGXQPGNFS
ECA bovina	DPALQPGNF -
ECA camundongos	DPGTQPSNF -
ECA ratos	DPGLQPGNFS
ECA humanos	DPGLQPGNFS

A atividade da ECA nos rins nativos dos ratos transplantados foi semelhante entre os grupos. Além disso, a atividade renal da ECA dos rins nativos dos grupos T-15, TCsA-15, T-30 e TCsA-30 foi mais elevada do que no grupo SHR. É também importante citar que atividade mais baixa da ECA foi observada em rins transplantados no décimo-quinto dia (T-15, TCsA-15) em comparação aos indivíduos Wistar, C e SHR, sem qualquer efeito da CsA. Curiosamente, trinta dias após o transplante a atividade da ECA dos rins transplantados (T-30, TCsA-30) não foi significativamente diferente dos SHR (Tabela 2).

Tabela 2
A tividade da eca nos pulmões, rins nativos e rins transplantados de indivíduos S HR e wistar transplantados após sete, quinze e 30 dias da manipulação cirúrgica ou transplante renal, tratados ou não com ciclosporina (CsA, 2mg/kg/dia; n = 6/grupo).

Grupos	Pulmões (nmol/mL/ min)	Rins nativos (nmol/ mL/min)	Rins transplantados (nmol/mL/min)
Wistar	260 ± 19	24 ± 5	--
SHR	478 ± 29 +	21 ± 1	--
C	290 ± 14	27 ± 4	--
T-15	404 ± 26 #	35 ± 5	10 ± 1
TCsA-15	257 ± 20 &	31 ± 5	8 ± 1
T-30	296 ± 10 &	31 ± 4	16 ± 1 &
TCsA-30	232 ± 15 *	32 ± 2	21 ± 3 *

• Valores apresentados como média ± EPM (n = 6/grupo).
• ⁺
  vs. Todos os grupos experimentais,
• ^#
  vs. Wistar e C,
• ^&
  vs. T-15;
• ^*
  vs. T-30; p < 0,05.

A atividade pulmonar da ECA estava elevada em T-15 em comparação ao grupo Wistar, sugerindo que o transplante renal tenha induzido tal alteração, ainda que a mesma não tenha sido suficiente para elevar a PAS dos receptores. O tratamento com CsA reduziu significativamente a atividade pulmonar da ECA quinze e trinta dias após o transplante (T-15 x TCsA-15 e T-30 x TcsA-30; Tabela 2). Nossos resultados sugerem que o transplante de rins de SHR para ratos Wistar também faz surtir um efeito de curto prazo sobre a atividade da ECA na fonte primária de produção de ECA (pulmões), que pode ser evitada com terapia imunossupressora.

A detecção precoce da isoforma 80/90-kDa na urina de ratos transplantados indica que este marcador biológico da hipertensão aparece antes de qualquer elevação substancial da PA. Nossos dados contribuem para destacar a relação entre SRA tecidual e disfunção do enxerto.

Agradecimentos

Agradecemos a Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo/FAPESP pelo apoio financeiro [processos 04/10063-0 e 02/13290-2].

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Jan-Mar 2017

Histórico

• Recebido
  30 Set 2016
• Aceito
  04 Out 2016