Valores de referência de aminoácidos por cromatografia líquida de alta eficiência em amostras de plasma de crianças brasileiras

Cruz, Ana F.; Barbosa, Tatiana Maria C. C.; Adelino, Talita Émile R.; Lima, William P.; Mendes, Magda O.; Valadares, Eugênia R.

doi:10.5935/1676-2444.20160012

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Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial

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Sumário

Laboratory Medicine • J. Bras. Patol. Med. Lab. 52 (2) • Mar-Apr 2016 • https://doi.org/10.5935/1676-2444.20160012 copiar

Valores de referência de aminoácidos por cromatografia líquida de alta eficiência em amostras de plasma de crianças brasileiras

Autoria SCIMAGO INSTITUTIONS RANKINGS

RESUMO

Introdução:

A cromatografia líquida de alta eficiência é uma técnica utilizada para quantificação de aminoácidos no plasma. A definição de intervalos de referência na população é importante para o diagnóstico e o monitoramento de indivíduos com aminoacidopatias.

Objetivos:

Os objetivos do presente estudo foram validar um método de quantificação de aminoácidos e definir intervalos de referência em crianças brasileiras.

Resultados:

Boa separação cromatográfica foi obtida utilizando uma coluna de núcleo sólido C18. O método apresentou linearidade, limites de detecção e quantificação, precisão e acurácia satisfatórios. Os intervalos de referência para aspartato, glutamato, asparagina, histidina, serina, glutamina, arginina, tirosina, alanina, triptofano, metionina, valina, fenilalanina, isoleucina e leucina foram definidos em um grupo de 60 indivíduos sadios com idade entre 2 e 14 anos.

Conclusão:

A técnica apresentada pode ser aplicada na prática clínica. Cada laboratório deve, preferencialmente, estabelecer os próprios intervalos de referência. Se não for possível, recomenda-se a utilização dos intervalos de referência descritos neste estudo para o diagnóstico e o monitoramento de crianças brasileiras nessa faixa etária.

Unitermos:
cromatografia líquida; erros inatos do metabolismo; aminoácidos; valores de referência

Standards	Solvent	Standards	Solvent
Aspartic acid	Formic acid 20%	Alanine	Reagent grade water
Glutamic acid	Reagent grade water	Tryptophan	Acetonitrile 50%
Asparagine	Methanol 20%	Methionine	Acetonitrile 50%
Serine	Methanol 20%	Valine	Acetonitrile 50%
Histidine	Methanol 20%	Phenylalanine	Acetonitrile 50%
Glutamine	Methanol 20%	Isoleucine	Reagent grade water
Arginine	Methanol 20%	Leucine	Reagent grade water
Tyrosine	Formic acid 20%

Time (min)	Flush	% Mobile phase A	% Mobile phase B
0	0.2	100	0
25	0.2	100	0
26	0.2	32	68
61	0.3	0	100
80	0.3	0	100
85	0.3	100	0

Compound	Range (nmol/ml)	Linearity (nmol/ml)	r ^2a	LOD^b (nmol/ml)	LQ^c (nmol/ml)
Aspartate	100-400	400	0.993	0.67	2
Glutamate	150-1500	1500	0.990	1.67	5
Asparagine	150-1500	1500	0.996	1.67	5
Histidine	100-550	550	0.990	1.67	5
Serine	150-1500	1500	0.995	1.67	5
Glutamine	150-1500	1500	0.991	2.33	7
Arginine	100-550	550	0.991	1.67	5
Tyrosine	150-1500	1500	0.994	1.67	5
Alanine	150-1050	1050	0.990	3.33	10
Tryptophan	150-1500	1500	0.992	1.67	5
Methionine	100-400	400	0.992	1.67	5
Valine	150-1500	1500	0.996	1.67	5
Phenylalanine	150-1500	1500	0.993	3.33	10
Isoleucine	150-1500	1500	0.9903	1.67	5
Leucine	150-1500	1500	0.9943	3.33	10

		CV^a a CV: coefficient of variation; (%)			Biological variation (%)
Compound	Precision	Concentration 1	Concentration 2	Concentration 3	CVi^d d CVi: coefficient of variation within-subject biological variation(21);	CVg^e e CVg: coefficient of variation between-subject biological variation(21).
Aspartate	Intra^b b Intra: intra-assay (n = 3);	12.3	4.84	5.1	31.2	55.1
Aspartate	Inter^c c Inter: inter-assay (n = 3 days; n = 3 replicates);	10.6	5.45	11.9	31.2	55.1
Glutamate	Intra	4.57	6.13	6.13	46.4	79.9
Glutamate	Inter	7.1	4.8	4.9	46.4	79.9
Asparagine	Intra	4.67	4.81	7.94	12.3	28
Asparagine	Inter	5.45	6.22	6.92	12.3	28
Histidine	Intra	7.42	4.76	6.85	9.7	22.7
Histidine	Inter	8.95	6.46	7.21	9.7	22.7
Serine	Intra	5.1	4.7	6.51	12.8	42.8
Serine	Inter	6.24	4.36	9.73	12.8	42.8
Glutamine	Intra	5.04	5.67	4.62	12.1	22
Glutamine	Inter	15.2	5.1	10.35	12.1	22
Arginine	Intra	10.79	6.06	6.65	19.3	34.1
Arginine	Inter	10.56	8.04	6.04	19.3	34.1
Tyrosine	Intra	2.93	4.38	5.32	10.5	61
Tyrosine	Inter	5.62	3.21	10.22	10.5	61
Alanine	Intra	9.16	5.64	6.98	14.7	55.8
Alanine	Inter	9.21	4.51	11.29	14.7	55.8
Tryptophan	Intra	3.34	5.07	3.42	22.7	152.6
Tryptophan	Inter	4.04	3.35	6.16	22.7	152.6
Methionine	Intra	3.58	4.42	4.74	14.7	43.4
Methionine	Inter	6.89	3.5	9.71	14.7	43.4
Valine	Intra	1.52	3.66	4.98	17.4	25.4
Valine	Inter	5.04	5.19	9.48	17.4	25.4
Phenylalanine	Intra	4.57	3.81	4.96	9.5	40.6
Phenylalanine	Inter	6.57	3.89	7.04	9.5	40.6
Isoleucine	Intra	3.51	3.59	7.89	15.5	45.5
Isoleucine	Inter	5.17	4.76	6.41	15.5	45.5
Leucine	Intra	2.14	2.89	4.56	14.4	44
Leucine	Inter	5.87	3.23	7.98	14.4	44

Compound	^* * n = 3. Recovery %
Compound	Concentration 1	Concentration 2	Concentration 3
Aspartate	94.3 ± 9.8	104.8 ± 5.1	99 ± 10.3
Glutamate	103.7 ± 7.9	98.8 ± 3.5	108.6 ± 2.1
Asparagine	107.8 ± 5.9	87.9 ± 5.6	105.2 ± 5.5
Histidine	91.1 ± 8.4	104.4 ± 2.3	109.7 ± 6.3
Serine	105.1 ± 6.8	90.2 ± 3.3	97.7 ± 9.4
Glutamine	101.7 ± 6.9	104.6 ± 4.3	104.9 ± 6.3
Arginine	106.3 ± 5.4	112.3 ± 6.1	103.2 ± 5.8
Tyrosine	99.8 ± 6.1	95.8 ± 1.5	100.8 ± 10.9
Alanine	101 ± 8.8	106.9 ± 2.3	96.3 ± 8.6
Tryptophan	85.8 ± 3.4	93.1 ± 0.8	97.1 ± 6.3
Methionine	104.7 ± 7.9	99.1 ± 1.7	95.6 ± 9.8
Valine	104.6 ± 5.9	105.3 ± 5.4	106.7 ± 7.5
Phenylalanine	103.8 ± 7.2	98.9 ± 3.2	102.6 ± 7.2
Isoleucine	100.8 ± 5.6	97.6 ± 4.8	96.6 ± 4.9
Leucine	106.8 ± 7	98.4 ± 3.1	106.1 ± 8.8

Amino acids (nmol/ml)	Reference intervals
Amino acids (nmol/ml)	Lower limit (CI 90%)	Upper limit (CI 90%)
Aspartate^a a interval by robust method calculated after logarithmic transformation;	3 (3-4)	20 (16-24)
Glutamate^a a interval by robust method calculated after logarithmic transformation;	55 (47-65)	341 (294-397)
Asparagine	17 (12-24)	95 (87-102)
Histidine	38 (26-50)	158 (144-170)
Serine	56 (47-65)	166 (155-175)
Glutamine^b b interval calculated by Horn and Pesce method (2005)(17).	367	1252 (1103-1363)
Arginine	35 (28-43)	129 (120-137)
Tyrosine	32 (25-38)	106 (97-114)
Alanine^a a interval by robust method calculated after logarithmic transformation;	167 (152-186)	604 (533-669)
Tryptophan^a a interval by robust method calculated after logarithmic transformation;	34 (30-38)	102 (90-115)
Methionine	13 (11-15)	31 (29-33)
Valine	125 (112-140)	280 (265-295)
Phenylalanine	36 (32-40)	78 (73-82)
Isoleucine	35 (32-39)	79 (75-83)
Leucine^b b interval calculated by Horn and Pesce method (2005)(17).	70 (62-78)	160 (150-168)

Amino acids	Measures of Central tendency (DP/min-max)		p value
Amino acids	Present study	Strauss et al. (2010)⁽¹⁸18 Lindroth P, Hamberger A, Sandberg M. Liquid chromatographic determination of amino acids after precolumn fluorescence derivatization. In: Boulton AA, Baker GB, Wood J. Neuromethods. Humana Press; 1986. p. 97-116.⁾	p value
Histidine	100 (29)	87 (29)^a a Student’s t test;	0.001
Glutamine	627 (335-1415)	527 (146)^b b Wilcoxon test.	0
Tyrosine	72 (18)	63 (24)^a a Student’s t test;	0
Tryptophan	61 (17)	50 (19)^a a Student’s t test;	0
Methionine	22 (5)	31 (10)^a a Student’s t test;	0
Valine	204 (38)	207 (65)^a a Student’s t test;	0.517
Phenylalanine	58 (10)	55 (18)^a a Student’s t test;	0.027
Isoleucine	57 (11)	65 (25)^a a Student’s t test;	0
Leucine	113 (80-177)	119 (38)^b b Wilcoxon test.	0.204

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[1] CORRESPONDING AUTHOR: Ana Facury da Cruz Avenida Professor Alfredo Balena, 110; Santa Efigênia; CEP: 30130-100; Belo Horizonte-MG, Brasil; e-mail: anafacury@hotmail.com.