Informações sobre o modo de vida das raias de água doce (Potamotrygonidae) sob condições naturais são escassas. Neste trabalho, estudamos o período de atividade e as formas de uso do habitat de duas espécies do gênero Potamotrygon na bacia do alto rio Paraná, no Sudeste do Brasil. Potamotrygon falkneri e P. motoro apresentaram comportamento muito semelhante, com nítida segregação espacial dos indivíduos em função do seu tamanho, da profundidade e do período do dia. Juvenis estiveram associados a praias arenosas e locais com profundidades abaixo de quatro metros ao longo de todo o dia. Raias de grande porte realizaram migrações batimétricas, alternando sua posição entre locais com profundidade superior a oito metros durante o dia e áreas mais rasas à noite. Indivíduos com tamanho intermediário ocuparam ambientes de transição, com maior heterogeneidade ambiental. Ambas as espécies apresentaram atividade, especialmente alimentar, predominantemente noturna. Os padrões comportamentais estudados parecem sofrer variações ontogenéticas e é provável que se alterem ao longo do ano, entre períodos de seca e cheia.
