Efeito da inoculação de Azospirillum e Herbaspirillum na produção de compostos indólicos em plântulas de milho e arroz

Effect of inoculation with Azospirillum and Herbaspirillum on production of indolic compounds and growth of wheat and rice seedlings

MICROBIOLOGIA

Efeito da inoculação de Azospirillum e Herbaspirillum na produção de compostos indólicos em plântulas de milho e arroz

Effect of inoculation with Azospirillum and Herbaspirillum on production of indolic compounds and growth of wheat and rice seedlings

Tharwat El-Sayed El-Desouk Radwan^I; Zeinat Kamel Mohamed^I; Veronica Massena Reis^II

^IFaculty of Science, Botanical Departament, Egypt El-Fayoum

^IIEmbrapa Agrobiologia, BR 465, Km 47, Caixa Postal 74.505, CEP 23851-970 Seropédica, RJ. E-mail: [e-mail]

RESUMO

Bactérias fixadoras de nitrogênio podem contribuir para o crescimento vegetal pela produção de auxinas. Os objetivos deste trabalho foram quantificar a produção de hormônios de crescimento por estirpes de bactérias fixadoras de nitrogênio e avaliar o efeito da inoculação destas estirpes em plântulas de milho e trigo. Todas as estirpes avaliadas começaram a produzir indóis no final da fase logarítmica. Houve efeito da adição de diferentes concentrações de triptofano ao meio de cultivo no aumento da produção de indóis até o nível de 200 µM. Nas estirpes de Azospirillum, as formas de N: NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, NH₄H₂PO₄ e NH₄NO₃ estimularam a produção de indóis em níveis baixos. A adição de KNO₃, NaNO₃ e KNO₂ inibiu a produção de indóis em todas as bactérias testadas e no crescimento de células de Azospirillum. Os efeitos da inoculação foram também comparados com concentrações crescentes do ácido 3-indolacético, KNO₃ e triptofano. Em condições axênicas, a elevada produção de indóis reduz o comprimento das raízes e colmos na presença de triptofano, especialmente quando submetidas à inoculação de Azospirillum.

Termos para indexação: bactérias diazotróficas, ácido 3-indolacético, fitormônios, fixação biológica de nitrogênio.

ABSTRACT

Nitrogen fixing bacteria can contribute to plant growth by the production of auxin. The objectives of this work were to quantify the production of plant growth hormones by different nitrogen-fixing bacteria and to evaluate the effect of this inoculation on growth of wheat and rice seedlings. All strains tested produced indoles during the late logarithmic phase. Increasing the amount of tryptophan in the medium enhanced the production of indoles by the bacteria up to the level of 200 µM. For the Azospirillum strains studied, the nitrogen sources: NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, NH₄H₂PO₄ and NH₄NO₃ stimulated indoles production in low levels. The addition of KNO₃, NaNO₃ and KNO₂ inhibited the production of indole compounds for all bacteria tested as well as the Azospirillum growth. The effects of inoculation were also compared to those caused by increased concentrations of IAA, KNO₃ and tryptophan alone. In vitro conditions, the high amounts of indoles produced by the bacteria reduce the length of roots and stems in the presence of tryptophan, especially in the case of Azospirillum strains.

Index terms: diazotrophic bacteria, indole-3-acetic acid, phytohormones, biological nitrogen fixation.

Introdução

Durante a última década, várias bactérias capazes de reduzir N₂ foram descritas, sendo o gênero Azospirillum o mais estudado. Atualmente, este grupo engloba seis espécies diazotróficas, como o A. brasilense e o A. lipoferum. Além disso, algumas espécies foram descritas como endófitas porque não são capazes de sobreviver por longos períodos no solo (Baldani et al., 1997).

A primeira espécie endófita a ser identificada foi o Herbaspirillum seropedicae (Baldani et al., 1986), apesar de na época este fato não ter sido reconhecido. Posteriormente, outros membros do gênero foram incluídos como o Herbaspirillum rubrisubalbicans (Baldani et al., 1996), Herbaspirillum frisingense (Kirchhof et al., 2001) e a última descrição apresentou uma espécie isolada de nódulos de feijão coabitando com o Rizóbio, o Herbaspirillum lusitanum (Valverde et al., 2003).

A produção de fitormônios por bactérias é um dos fatores responsáveis pelo efeito estimulatório observado no crescimento de plantas, como no caso da inoculação de estirpes de Azospirillum (Bottini et al., 1989). Vários experimentos foram realizados com estirpes deste gênero e mostraram potencial em promover crescimento de plantas em diferentes solos e condições climatológicas (Okon & Labandera-Gonzalez, 1994). O principal hormônio produzido por estirpes de Azospirillum é uma auxina, o ácido 3-indolacético (AIA) (Crozier et al., 1988), além de outros compostos indólicos. Também produzem citoquininas (Cacciari et al., 1989) e giberelinas (Bottini et al., 1989). Quanto ao gênero Herbaspirillum, Bastián et al. (1998) detectaram a presença de AIA e giberelinas A₁ e A₃ em culturas de Herbaspirillum seropedicae e Radwan et al. (2002) constataram a produção de indóis por estirpes de Herbaspirillum, incluindo H. rubrisubalbicans e outros isolados não identificados.

Pelos menos três vias biossintéticas foram descritas na produção de AIA em Azospirillum: duas dependentes de triptofano, como a via indole-3-acetamida (IAM) e indole-3-piruvato (IpyA), e uma outra independente de triptofano (Dobbelaere et al., 1999; Lambrecht et al., 2000). Recentemente foi revelado que a enzima indole-3-piruvato decarboxilase, codificada pelo gene ipdC, é comum às duas vias IpyA, e à via que independe de triptofano, cujo precursor ainda é desconhecido, sendo possível que ambas tenham início em um intermediário comum, o IpyA (Lambrecht et al., 2000).

Novos resultados baseados na expressão de genes mostraram a regulação do gene ipdC por AIA em A. brasilense (Vande Broek et al., 1999) e observou-se que o promotor possui um elemento responsivo a auxina (AuxRE) similar ao promotor de genes que induzem auxinas em plantas (Lambrecht et al., 2000). Há evidências de que os microrganismos podem selecionar uma via metabólica diferenciada, dependendo do meio ambiente (Patten & Glick, 1996). Fato similar foi observado em espécies de Rhizobium que só utilizavam a via do indole-3-acetamida quando associados ao hospedeiro (Costacurta & Vanderleyden, 1995) e a via do ácido 3-indole-piruvico era utilizada em vida livre (Ernstsen et al., 1987).

Os objetivos deste trabalho foram quantificar a produção de hormônios de crescimento por estirpes de bactérias fixadoras de nitrogênio e avaliar o efeito da inoculação destas estirpes em plântulas de milho e trigo.

Material e Métodos

Foram utilizadas neste estudo as estirpes Azospirillum brasilense Cd, A. lipoferum Br17, Herbaspirillum seropedicae Z67, H. rubrisubalbicans M4 e Herbaspirillum sp. 34 isolada de arroz (34-arroz), todas depositadas na coleção de bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia, Município de Seropédica, RJ. Os experimentos foram conduzidos em recipientes de vidro (12 mL) contendo 5 mL de meio de cultivo semi-sólido NFb sem adição de N (Döbereiner, 1995), e os compostos indólicos foram medidos utilizando-se o método colorimétrico. Na formulação do meio de cultivo NFb, foi omitido o uso do indicador azul de bromotimol e das vitaminas para não haver interferências destes compostos na formação da reação colorimétrica. As fontes de N dissolvidas no tampão do meio de cultivo foram adicionadas por filtração (Millipore^TM - 0,2 µm) após autoclavagem. Cada estirpe foi desenvolvida em erlenmeyer de 125 mL, contendo 50 mL do meio de cultivo DYGS por 48 horas a 30ºC. Este meio de multiplicação tem a seguinte composição (g L^-1): glucose, 2; peptona, l,5; extrato de levedura, 2; KH₂PO₄, 0,5; MgSO₄.7H₂O, 0,5; ácido glutâmico, l,5; água destilada para completar 1.000 mL e pH final ajustado para 6,8. Como inóculo dos testes, foi usado 100 µL de células centrifugadas por três vezes a 10.000 g por 15 min a 4ºC, utilizando tampão fosfato 0,06 M (estéril) com pH ajustado para 6,8 e suspendido em 30 mL do mesmo tampão. As culturas líquidas com A. brasilense e A. lipoferum foram incubadas a 35ºC, e com Herbaspirillum spp., a 35ºC, durante 48 horas em mesa agitadora a 125 rpm. Os ensaios usando meio semi-sólido NFb foram mantidos estáticos nas mesmas condições.

Para verificar o efeito de doses crescentes de triptofano, utilizou-se o meio de cultivo NFb acrescido das seguintes doses (µM): 12,5, 50, 100, 250, 500, 1.000, 1.500 e 2.000 (acrescidas por filtração após a autoclavagem do meio). Foram avaliadas sete fontes de N: NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, NH₄NO₃, NH₄H₂PO₄, KNO₂, KNO₃ e NaNO₃. Cada fonte foi testada nas concentrações 0,2, 0,5 e 1,0 g L^-1. Após filtragem utilizando filtro Millipore^TM (0,2 µm), os sais foram adicionados separadamente ao meio, e o controle recebeu o mesmo volume de água destilada estéril.

A concentração de compostos indólicos foi estimada no sobrenadante das culturas após a inoculação. As células foram centrifugadas a 10.000 g por 15 min a 4ºC, usando todo o conteúdo dos vidros. Como vários compostos indólicos, além do AIA, podem ser medidos pelo método colorimétrico, o termo 'compostos indólicos' foi adotado referindo-se às auxinas deste grupo (Crozier et al., 1988). O método colorimétrico usado foi o descrito por Gordon & Weber (1951) e modificado por Minamisawa et al. (1992). A concentração dos compostos indólicos foi estimada previamente usando a curva padrão obtida pela adição de quantidades conhecidas de AIA (Sigma): 25, 50, 100, 150, 200, 300 µM. A quantidade de indóis produzidos foi expressa pelo valor obtido na curva de AIA (µM) e dividido pela biomassa de células (células secas em mg). Todos os ensaios foram conduzidos em delineamento inteiramente casualizado com três repetições.

Para medir o crescimento celular no meio de cultivo semi-sólido, foi utilizada a massa das células secas. O conteúdo dos frascos de 5 mL foi filtrado em papel Whatman^TM (Ashless grade 42; 185 mm de diâmetro) e o resíduo foi secado a 60ºC até que atingisse massa constante. O crescimento foi medido pela subtração do controle, com 100 µL de água destilada.

Os experimentos de inoculação foram conduzidos com sementes de trigo (Triticum sativum cv. BEM16) e arroz (Oryza sativa cv. IR42) desinfestadas superficialmente. As sementes de trigo foram desinfestadas com álcool 70% por 10 min, seguido do tratamento com HgCl₂ (0,1%) dissolvido em HCl (0,05 N) por 10 min. Em seguida, as sementes foram lavadas cinco vezes com água destilada estéril. Na germinação, foram colocadas dez sementes por placa contendo meio de cultivo Agar Nutritivo (Vetec), durante 72 horas em câmara de crescimento a 30ºC. Sementes de arroz foram desinfestadas por imersão em álcool absoluto por 1 min, colocadas para agitar a 125 rpm por 1 hora em solução de hipoclorito de sódio (5%) e em seguida lavadas cinco vezes com água destilada estéril. As sementes foram colocadas para germinar nas mesmas condições citadas, três dias antes do transplantio. As sementes das duas gramíneas, que não apresentaram contaminação, foram transferidas para tubos de vidro de 20x3 cm contendo 50 mL de meio de cultivo NFb preparado conforme Barbieri et al. (1986). Na inoculação utilizaram-se as cinco estirpes, além da estirpe mutante 245 Nif^- da espécie Azospirillum brasilense, mas que produz AIA (Katzy et al., 1995). Todas as estirpes foram desenvolvidas no meio citado e lavadas com tampão fosfato. Cada tubo de vidro contendo uma semente germinada recebeu a inoculação de 2 mL da suspensão de bactérias com a densidade ótica ajustada para 10⁸ células mL^-1 de tampão fosfato. O efeito da inoculação na produção de indóis foi comparado com uma dose de L-triptofano (100 mg L^-1 adicionado por filtragem no meio), doses crescentes de AIA (50, 100, 250 e 500 µM), 0,5 g L^-1 de KNO₃ e 2 mL de água estéril, usada como controle.

Nas plantas, avaliou-se a massa de raízes e da parte aérea e o comprimento das raízes e da parte aérea. A superfície das raízes foi estimada conforme Carly & Watson (1966). A contagem das bactérias inoculadas foi feita pelo método da diluição serial, seguida de inoculação de 100 µL em meio de cultivo batata com três repetições (Döbereiner, 1995). O crescimento do mutante 245 Nif^- foi estimado pelo método de diluição seriada (1/10), inoculando-se as três últimas diluições (100 µL) sobre o meio de cultivo NFb sólido suplementado com extrato de levedura (100 mg L^-1). Os tubos de vidro foram distribuídos em blocos ao acaso com 12 repetições. Todos os resultados foram submetidos à análise de variância e as médias comparadas pelo teste de DMS (diferença mínima significativa) a 1% de probabilidade. A análise estatística foi realizada pelo programa MSTATC.

Resultados e Discussão

Os compostos indólicos produzidos por todas as estirpes correlacionaram-se com a massa das células secas (Tabela 1). O aumento da acumulação dos compostos indólicos no meio de cultivo semi-sólido ocorreu predominantemente durante a fase estacionária. Na ausência de N, A. brasilense (estirpe Cd) aumentou 3,8 vezes a produção de indóis em 24 horas e este acúmulo não foi alcançado pelas outras estirpes testadas (Br17 – 2,48; Z67 – 1,75; M4 – 2,97 e 34-arroz – 0,89) (Tabela 1). As estirpes de Azospirillum produziram de três a sete vezes mais compostos indólicos (entre 300 a 500 µM) que as de Herbaspirillum. Como observado por Baca et al. (1994), as estirpes excretaram indóis na fase estacionária, que foi atingida 24 horas após a inoculação, usando meio de cultivo líquido suplementado com 100 µg mL^-1 de triptofano. Utilizando-se cultivo semi-sólido, o máximo de acúmulo ocorreu 48 horas após a inoculação.

Aumentando a concentração de triptofano no meio, todas as estirpes mostraram resposta linear na produção de indóis até o nível de 200 µM em meio de cultivo semi-sólido (Tabela 2). Entre as estirpes de Herbaspirillum, o isolado 34-arroz respondeu à adição de triptofano, aumentando seis vezes a produção de indóis na presença de 200 µM de triptofano e superando as demais (Tabela 2). Esse efeito estimulatório pode ter sido causado pelo triptofano – precursor da biossíntese de AIA por estas bactérias –, aumentando o crescimento celular ou sendo consumido como fonte de N (onde a sua concentração não excede os níveis inibitórios), estimulando as multiplicações celulares, resultando em maior crescimento e maior atividade da nitrogenase (Tien et al., 1979).

Quanto à adição de diversas fontes de N na forma de amônio e nitrato no meio de cultivo semi-sólido, utilizando três concentrações diferentes, foi observado que o N aplicado na forma de íons amônio exibiu um efeito positivo na produção de indóis, quando comparado ao uso de formas de nitrato por estirpes de Azospirillum (Cd e Br17) (Tabela 3). No controle sem adição de N, pode-se observar que a produção de indóis não foi afetada nas estirpes de Azospirillum. Por sua vez, as estirpes de Herbaspirillum apresentaram efeito positivo ao aumento das concentrações de sais de amônio, especialmente na presença de NH₄Cl e (NH₄)₂SO₄ e o oposto ocorreu com as estirpes de Azospirillum testadas. No tratamento usando nitrato como fonte de N, a atividade de produção de indóis só foi positiva em um único caso: A. brasilense Cd se desenvolvendo na presença de 200 mg L^-1 de KNO₃, com incremento de 4%.

Baca et al. (1994) também constataram que a produção de AIA na presença de KNO₃ (10 mM) foi de duas a dez vezes maior que a produzida em meio contendo NH₄Cl (18 mM) por três estirpes testadas (A. lipoferum UAP06, A. brasilense Az30-INTA e H18) e que o oposto ocorreu com a estirpe UAP14 de A. brasilense. Hartmann et al. (1983) descreveram um aumento de dez vezes na produção de AIA em A. brasilense pela adição de amônio. As estirpes de Azospirillum reduziram a produção de AIA com a adição de doses crescentes de sais de amônio (de 3,7 a 18,7 mM no caso de NH₄Cl). Infere-se, portanto, que o gênero Herbaspirillum possui um caminho metabólico diferente ou menos eficiente para a produção de indóis que o apresentado por Azospirillum, resultando em uma produção bem menor de auxinas mensuradas por esse método.

Fatores como concentração do precursor (triptofano), presença de múltiplos genes regulatórios em diferentes vias metabólicas e também a concentração elevada do produto final (AIA), podem concorrer para a regulação do metabolismo de AIA (Lambrecht et al., 2000). Carreño-Lopez et al. (2000) constataram que mudanças na fonte de carbono usada pela bactéria A. brasilense estirpe Sp7, mutante na produção de indóis, quando desenvolvida na presença de malato ou gluconato (na presença de triptofano) foi pouco afetada pela fonte de carbono, revelando que existia uma via alternativa e dependente de triptofano (as vias IPCD - indol-3-piruvato decarboxilase e a TAM - triptamina), como também uma via alternativa que usa o indol-3-acetonitrila (IAN) como um intermediário, sendo controlado pela repressão catabólica.

A inoculação de todas as estirpes nas duas gramíneas induziu efeito similar aos observados pela adição de AIA em meio de cultivo suplementado com triptofano. O comprimento das raízes de trigo e a superfície total (área radicular) foram reduzidos pela inoculação de Azospirillum, mesmo com a inoculação do mutante não fixador (245 Nif^-) (Tabela 4). Por sua vez, os isolados de Herbaspirillum spp., que produziram menores quantidades de indóis medidos tanto por colorimetria como por HPLC (Radwan et al., 2002), induziram efeitos similares à adição de 100 µM de AIA, tanto na superfície radicular como no comprimento da raiz e parte área (Tabelas 4 e 5). Em todos os casos, o alongamento radicular estava diretamente relacionado à produção de AIA, sendo que este parâmetro pode ser usado como um bioensaio para quantificar a produção desta auxina.

A inoculação de bactérias produziu efeitos similares à adição de KNO₃, induzindo a formação de raízes com maior número de pêlos radiculares e maior massa e superfície (Tabelas 4 e 5). Como observado no trigo, a adição de triptofano ao meio de cultivo juntamente com a bactéria, reduziu o comprimento e a massa e área radicular nas plântulas de arroz, especialmente com as estirpes Cd e Br17 de Azospirillum, em relação ao controle (água), e esta inibição foi comparável à adição de 250 µM de AIA (Tabela 5).

Células de raízes são mais sensíveis à adição de auxina que células de parte aérea. Vários autores também mostraram que a inoculação de Azospirillum e a aplicação de hormônios induzem a proliferação de raízes laterais e pêlos radiculares (Glick, 1995). El-Khawas & Adachi (1999) usaram concentrações crescentes do sobrenadante de células de A. brasilense e Klebsiella pneumoniae em raízes de arroz e observaram que o comprimento e área radicular, massa de matéria fresca e seca foram estimuladas.

Conclusões

1. A produção de indóis aumenta até a dose de 200 µM de triptofano.

2. Nas estirpes de Azospirillum, as fontes NH₄Cl, (NH₄)₂SO₄, NH₄H₂PO₄ e NH₄NO₃ estimulam a produção de indóis em baixas concentrações e a adição das fontes KNO₃, NaNO₃, NaNO₃, KNO₂ inibe a produção de indóis nas bactérias e reduz a multiplicação de células de Azospirillum.

4. O efeito da inoculação das estirpes avaliadas, especialmente do Azospirillum, reduz o comprimento das raízes e colmos na presença de triptofano.

Agradecimentos

Ao programa Pronex II/FINEP e à Faculdade de Ciência do Cairo, pela ajuda financeira ao projeto e bolsa de estudo do primeiro autor, respectivamente.

Recebido em 2 de abril de 2004 e aprovado em 7 de julho de 2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Dez 2004
• Data do Fascículo
  Out 2004

Histórico

• Aceito
  07 Jul 2004
• Recebido
  02 Abr 2004