Validação de método cromatográfico para análises de rotina de trans-resveratrol e quercetina em vinhos tintos

O objetivo deste trabalho foi validar um método rápido, com baixo consumo de solventes, para a análise de trans-resveratrol e quercetina em vinhos tintos. Os vinhos foram elaborados por método clássico, a partir das cultivares de uva (Vitis vinifera) Cabernet Franc, Cabernet Sauvignon, Malbec, Merlot, Petit Verdot, Pinot Noir, Ruby Cabernet, Syrah, Tannat e Tempranillo. As amostras foram filtradas e analisadas por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) com detector de arranjo de diodos (DAD), em 306 e 371 nm, quanto ao trans-resveratrol e à quercetina, respectivamente. Utilizou-se uma coluna octilsilano, e a fase móvel foi composta por um gradiente de metanol, água e ácido fórmico. O método foi validado de acordo com as seguintes figuras de mérito: especificidade, linearidade, limite de detecção, limite de quantificação, precisão, exatidão e robustez. O método CLAE-DAD proposto pode ser implantado para análises de trans-resveratrol e quercetina em vinhos tintos.

Termos para indexação:
Vitis vinifera; cromatografia líquida de alta eficiência; polifenol; quantificação.

Autoria

Letícia Flores da Silva

Embrapa Uva e Vinho, Rua Livramento, no 515, CEP 95700-000 Bento Gonçalves, RS, Brazil. E-mail: leticiaflores.lf@outlook.com, celito.guerra@embrapa.br, ana.czermainski@embrapa.brEmbrapa Uva e VinhoBrazilBento Gonçalves, RS, BrazilEmbrapa Uva e Vinho, Rua Livramento, no 515, CEP 95700-000 Bento Gonçalves, RS, Brazil. E-mail: leticiaflores.lf@outlook.com, celito.guerra@embrapa.br, ana.czermainski@embrapa.br

Celito Crivellaro Guerra

Ana Beatriz Costa Czermainski

Leonardo Ferrari

Instituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Sul, Campus Bento Gonçalves, Avenida Osvaldo Aranha, no 540, CEP 95700-000 Bento Gonçalves, RS, Brazil. E-mail: leonardo.enologo@gmail.comInstituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do SulBrazilBento Gonçalves, RS, BrazilInstituto Federal de Educação, Ciência e Tecnologia do Rio Grande do Sul, Campus Bento Gonçalves, Avenida Osvaldo Aranha, no 540, CEP 95700-000 Bento Gonçalves, RS, Brazil. E-mail: leonardo.enologo@gmail.com

Ana Maria Bergold

Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Farmácia, Laboratório de Química Farmacêutica, Avenida Ipiranga, no 2.752, CEP 90610-000 Porto Alegre, RS, Brazil. E-mail: ana.bergold@ufrgs.brUniversidade Federal do Rio Grande do SulBrazilPorto Alegre, RS, BrazilUniversidade Federal do Rio Grande do Sul, Faculdade de Farmácia, Laboratório de Química Farmacêutica, Avenida Ipiranga, no 2.752, CEP 90610-000 Porto Alegre, RS, Brazil. E-mail: ana.bergold@ufrgs.br

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Figure 1.
Chromatograms at 340 nm, obtained by HPLC-DAD method for: standard solution of trans-resveratrol (R) and quercetin (Q), at 10 mg L^-1 concentration, with their respective chemical structures and UV spectra (A), and 'Merlot' 2 red wine (B). mAU, milli-absorbance units.

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Figure 2.
Control charts for ten standard curves for each analyte: A, trans-resveratrol intercept; B, trans-resveratrol slope; C, quercetin intercept; D, quercetin slope. Circle indicates value outside the specification (mean ± 2σ), which was disregarded.

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Figure 3.
Mean and standard deviation of Trans-resveratrol and quercetin contents for samples of red wines made with grapes from the 2012 harvest in the state of Rio Grande do Sul.

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Table 1.
Analytical conditions adopted for the determination of trans-resveratrol and quercetin in red wines.

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Table 2.
Evaluation of possible interferers in the HPLC-DAD method for the analysis of trans-resveratrol and quercetin in red wines.

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Table 3.
Merit figures of the chromatographic method (HPLC-DAD) for analysis of trans-resveratrol and quercetin in red wines.

Figure 1. Chromatograms at 340 nm, obtained by HPLC-DAD method for: standard solution of trans-resveratrol (R) and quercetin (Q), at 10 mg L^-1 concentration, with their respective chemical structures and UV spectra (A), and 'Merlot' 2 red wine (B). mAU, milli-absorbance units.

Figure 2. Control charts for ten standard curves for each analyte: A, trans-resveratrol intercept; B, trans-resveratrol slope; C, quercetin intercept; D, quercetin slope. Circle indicates value outside the specification (mean ± 2σ), which was disregarded.

Figure 3. Mean and standard deviation of Trans-resveratrol and quercetin contents for samples of red wines made with grapes from the 2012 harvest in the state of Rio Grande do Sul.

Table 1. Analytical conditions adopted for the determination of trans-resveratrol and quercetin in red wines.

Condition	Description
Precolumn	C8 (Phenomenex)
Column	C8 VertiSep UPS (Vertical), 4.6 x 150 mm, 5 mm particle and 100 Å pores
Mobile phase A	Formic acid 0.10% v/v, diluted in ultrapure water
Mobile phase B	Formic acid 0.10% v/v, diluted in MeOH
Gradient	Linear, with mobile phase A concentrations: 50% v/v from 0 to 5 min; 30% v/v from 7 to 8 min; 50% v/v from 9 to 10 min
Injection volume	20 mL
Flow rate	1.0 mL min^-1
Detection (DAD)	306 nm (trans-resveratrol), 371 nm (quercetin)

Table 2. Evaluation of possible interferers in the HPLC-DAD method for the analysis of trans-resveratrol and quercetin in red wines.

Possible interferer	R_T (min)	λ_max (nm)
Stilbenes
Trans-resveratrol-3-β-D-Glucopyranoside	2.6	306
Cis-resveratrol	8.6	285
Flavonols
Myricetin	4.5	374
Kaempferol	9.3	365
Quercetin-3-O-glucoside	3.5	354
Acid hydrolysis - trans-resveratrol	3.6	306
Acid hydrolysis - quercetin	7.4	371

Table 3. Merit figures of the chromatographic method (HPLC-DAD) for analysis of trans-resveratrol and quercetin in red wines.

Merit figure	Limit	Trans-resveratrol	Quercetin
Specificity (Merlot 2)
Stability⁽¹⁾ (-20 ºC)	85 - 115 (<5)⁽⁵⁾	103.06 (4.94)	89.34 (1.81)
Stability⁽¹⁾ (50 ºC)	85 - 115 (<5)⁽⁵⁾	81.58 (10.83)	89.69 (16.08)
Linearity
Equation of the line⁽²⁾	-	y = 123,723.0x + 8,015.0	y = 109,813.0x -124,862.0
r⁽²⁾	0.99⁽⁵⁾	0.9947	0.9951
Linear regression⁽³⁾	>9.33	1012.85	1474.19
Linearity deviation⁽³⁾	<5.41	0.29	1.50
Linear range (mg L^-1)	-	2.0 to 35.0	2.0 to 35.0
Limits
Detection (mg L^-1)	-	0.22	0.33
Quantification (mg L^-1)	-	0.68	0.99
Precision (CV₁%)	<5.00⁽⁵⁾	7.84	2.52
Accuracy^(1,4) (%)	85 - 115⁽⁵⁾	99.74 (4.37)	106.90 (2.22)
Robustness
MF - % FA (CV₂%)	-	4.78	6.31
Column marck (CV₃%)	-	3.97	4.63

⁽¹⁾
Average (%) and CV% calculated for recovery (n = 3). ⁽²⁾Calculated from standard solutions analyzed over the same sample period (curves 1, 2, and 3 of Figure 3). ⁽³⁾Analysis of variance (p = 0.01). ⁽⁴⁾Calculated for ‘Merlot’ 2 wine at low (10 mg L^-1), medium (15 mg L^-1) and high (25 mg L^-1) concentration levels. ⁽⁵⁾Anvisa (2003)ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução-RE nº 899, de 29 de maio de 2003. [Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos]. Diário Oficial da União, 2 jun. 2003. Seção 1, p.56-59. and FDA (2001)FDA. Food and Drug Administration. Guidance for industry: bioanalytical method validation. 2001. Available at: Available at: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidance ComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm070107.pdf . Accessed on: Jan. 5 2016.
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guida... .

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[TFN1] ⁽¹⁾
Average (%) and CV% calculated for recovery (n = 3). ⁽²⁾Calculated from standard solutions analyzed over the same sample period (curves 1, 2, and 3 of Figure 3). ⁽³⁾Analysis of variance (p = 0.01). ⁽⁴⁾Calculated for ‘Merlot’ 2 wine at low (10 mg L^-1), medium (15 mg L^-1) and high (25 mg L^-1) concentration levels. ⁽⁵⁾Anvisa (2003)ANVISA. Agência Nacional de Vigilância Sanitária. Resolução-RE nº 899, de 29 de maio de 2003. [Guia para validação de métodos analíticos e bioanalíticos]. Diário Oficial da União, 2 jun. 2003. Seção 1, p.56-59. and FDA (2001)FDA. Food and Drug Administration. Guidance for industry: bioanalytical method validation. 2001. Available at: Available at: http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guidance ComplianceRegulatoryInformation/Guidances/ucm070107.pdf . Accessed on: Jan. 5 2016.
http://www.fda.gov/downloads/Drugs/Guida... .