Determinação de fármacos diuréticos em associação por cromatografia em camada delgada e espectrofotometria

Determination of diuretic drugs by thin layer chromatography and spectrophotometry

thin layer chromatography; quality control; diuretics

ARTIGO

Determinação de fármacos diuréticos em associação por cromatografia em camada delgada e espectrofotometria

Determination of diuretic drugs by thin layer chromatography and spectrophotometry

Dênia Mendes de Sousa Valladão^I,*; Massao Ionashiro^II; José Zuanon Netto^II,†

^IDepartamento de Engenharia, Campus de Sinop, Universidade do Estado do Mato Grosso, 78850-000 Sinop – MT, Brasil

^IIDepartamento de Química Analítica, Instituto de Química de Araraquara, CP 355, 14801-970 Araraquara SP, Brasil

ABSTRACT

A rapid, sensitive and reliable thin-layer chromatography/spectrophotometry screening procedure was developed for quantitative determination of diuretics associated in pharmaceutical dosage forms. The chromatographic method employed microcrystalline cellulose and butanol : acetic acid : water (4:1:1) or amilic alcohol : ammonium hydroxide 25% (9:1) as mobile phases and detection by U.V. light. The drugs were extracted using a simple procedure and were quantified by U.V. spectrophotometry. Results varied from 97.5 to 102.5% and are similar to those obtained by conventional methods. This method of quantification of diuretics is promising for quality control of drugs.

Keywords: thin layer chromatography; quality control; diuretics.

INTRODUÇÃO

Diuréticos são fármacos que aumentam a eliminação de eletrólitos (especialmente sódio e íons cloreto) e água. Esses fármacos são utilizados no tratamento de edemas resultantes de uma variedade de causas, como por exemplo insuficiência cardíaca congestiva, síndrome nefrótica, doenças crônicas do fígado, em associação à hipertensão, hipercalcemia, diabetes, glaucoma etc¹.

Os diuréticos comercialmente disponíveis são as tiazidas, os de alça e poupadores de potássio. Os diuréticos poupadores de potássio são considerados com fraco poder diurético, apresentando-se normalmente associados a outros diuréticos, com a finalidade de diminuir a depleção de potássio¹.

A identificação e quantificação desses compostos apresenta grande importância na indústria farmacêutica.

A associação de diuréticos em formas farmacêuticas tem sido analisada por vários métodos, incluindo espectroscopia de absorção na região do ultravioleta e visível, amperometria, titulometria, todos envolvendo longo tempo de extração^2-6.

Existem muitos métodos cromatográficos descritos para separação, detecção e medida quantitativa para agentes diuréticos individuais, apenas para fluidos biológicos. Estes métodos incluem a cromatografia gasosa, cromatografia gás-líquido⁷, cromatografia gasosa – espectrometria de massa⁸ e cromatografia líquida de alta eficiência, sendo essa a que apresenta maior interesse na determinação de preparações farmacêuticas^9,10. Publicações envolvendo a cromatografia em camada delgada restringem-se a testes qualitativos¹¹.

Considerando a dificuldade de análise de fármacos diuréticos em associação em preparações farmacêuticas e o alto custo que envolve as análises, este trabalho objetivou estabelecer uma metodologia simples, eficiente e de baixo custo para a quantificação de fármacos diuréticos combinados, utilizando-se a cromatografia em camada delgada e a espectrofotometria.

PARTE EXPERIMENTAL

Soluções padrão

As soluções padrão de furosemida, hidroclorotiazida, espiro-nolactona e cloridrato de amilorida foram preparadas em metanol em várias concentrações e então construídas suas curvas de calibração usando a espectrofotometria na região do ultra-violeta, com Espectrofotômetro Carlzeiss – Jena, Modelo Specord M 40.

Amostras: comprimidos diuréticos obtidos no comércio

Furosemida – Espironolactona (Amostra A): furosemida - 20 mg; espironolactona - 100 mg; excipiente - 380 mg.

Furosemida – Cloridrato de Amilorida (Amostra B): furosemida - 40 mg; cloridrato de amilorida - 10 mg; excipiente - 210 mg.

Hidroclorotiazida – Espironolactona (Amostra C): hidro-clorotiazida - 50 mg; espironolactona - 50 mg; excipiente - 170 mg.

Hidroclorotiazida – Cloridrato de Amilorida (Amostra D): hidro-clorotiazida - 50 mg; espironolactona - 5 mg; excipiente - 195 mg.

Condições cromatográficas

Adsorvente

A fase estacionária utilizada foi a de celulose microcristalina (Merck) preparada pela suspensão de 25 g para 90 mL de água destilada. As placas foram preparadas com auxílio de um espalhador regulável 0-2 mm (Desaga), sobre placas de vidro 20 x 20 cm. Uma vez preparadas foram secas ao ar por cerca de 2 h e então ativadas em estufa regulada entre 105 e 110 ºC por um período de 10 min.

Desenvolvimento

As cromatoplacas foram desenvolvidas em cubas de vidro 22 x 22 x 10 cm, que continham as fases móveis adequadas ao experimento, num percurso de 10 cm, em um desenvolvimento uni-dimensional ascendente simples, em câmara saturada.

Fases móveis

As fases móveis foram escolhidas baseadas na melhor separação dos fármacos¹¹, onde:

Fase Móvel 1: butanol: ácido acético glacial: água (4:1:1) v/v, utilizada para a análise das amostras B, C e D.

Fase Móvel 2: álcool amílico e hidróxido de amônio 25%, (9:1) v/v, utilizada para a análise da amostra A.

Agente revelador

A revelação foi feita pelo método físico da luz ultravioleta (onda curta e longa).

Preparo da amostra

Foi feita uma amostragem dos comprimidos, de maneira a obter o peso médio dos mesmos¹²; em seguida, as amostras foram pulverizadas e homogeneizadas e, então, tratadas com metanol, sob agitação por 15 min. Seguiu-se ainda, uma filtração.

Aplicação das amostras e padrões

As soluções padrão e as amostras foram aplicadas na linha de partida, localizada a 1,5 cm da borda inferior da cromatoplaca e distanciadas 1,5 cm entre si. As aplicações foram realizadas com auxílio de micropipetas de volume fixo.

Padronização

Foram elaboradas duas curvas de calibração: uma direta, a qual não passou pelo processo cromatográfico, e outra cromatografada, com soluções padrão dos fármacos em diversas concentrações, variando de 0–20 µg mL^-1. Todos os ensaios foram realizados em triplicata.

Quantificação

Para a determinação dos fármacos, as concentrações usadas foram:

Amostra A : furosemida 4 µg mL^-1 espironolactona 10 µg mL^-1; Amostra B : furosemida 8 µg mL^-1 cloridrato de amilorida 2 µg mL^-1; Amostra C : hidroclorotiazida 4 µg mL^-1 espironolactona 4 µg mL^-1; Amostra D : hidroclorotiazida 10 µg mL^-1 cloridrato de amilorida 2 µg mL^-1; Solução padrão de furosemida : 4 e 8 µg mL^-1; Solução padrão de hidroclorotiazida: 4 e 10 µg mL^-1; Solução padrão de espironolactona: 4 e 10 µg mL^-1; Solução padrão de cloridrato de amilorida: 2 µg mL^-1.

A localização, realizada através da luz UV, e retirada do fármaco isolado pela cromatografia foi a base para a quantificação. Transferiu-se a parte da camada contendo o fármaco diretamente para tubos de centrífuga com tampa, com capacidade para 15 mL, adicionadas de 10 mL de metanol e então centrifugados a 1000 rpm por 2 min. O líquido sobrenadante foi transferido para cubeta de 1 cm e procedeu-se a leitura espectrofotométrica em comprimento de onda de 271 nm para furosemida, 273 nm para hidroclorotiazida, 238nm para a espironolactona e 286 nm para o cloridrato de amilorida, que são os comprimentos de onda aonde a absorbância é maxima¹². A Figura 1 mostra o esquema utilizado para a quantificação dos fármacos.

Ainda foi realizada a determinação dos fármacos padrão, nas mesmas concentrações das amostras, utilizando-se apenas a espectrofotometria (UV) para efeito de comparação dos resultados com aqueles obtidos pelo método proposto (cromatografia-espectrofotometria).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Para definição do sistema cromatográfico, o principal quesito foi o estabelecimento do adsorvente a ser utilizado, uma vez que a recuperação dos fármacos para posterior quantificação era de primordial importância. Optou-se pela celulose microcristalina, pois foi o adsorvente que atendeu às exigências da metodologia proposta.

Com relação às soluções padrão dos fármacos puro, foi cons-truída uma curva de calibração (usando somente a espectro-fotometria), e outra cromatografada (utilizando a cromatografia-espectrofotometria), que apresentou uma correlação linear entre absorbância e concentração do fármaco na faixa de 2 a 20 µg mL^-1, de acordo com a Lei de Lambert-Beer. Os dados destas curvas encontram-se na Tabela 1. As concentrações usadas para as análises dos fármacos associados foram baseadas na linearidade da curva de calibração e no tamanho das manchas¹¹. Na Tabela 2, verificam-se os valores de R_f x100 para os fármacos estudados nas condições realizadas para o experimento.

A Tabela 3 apresenta os valores de absorbância das soluções padrão dos fármacos estudados utilizando-se apenas a espectrofotometria (UV) e os valores obtidos pelo método proposto (cromatografia-espectrofotometria), onde se verifica que os dados são concordantes, demonstrando que o método pode ser utilizado.

Os ingredientes ativos das amostras foram calculados como uma função da curva de calibrações e da fórmula C_A = C_P X A_A/A_P, respectivamente, correspondendo às concentração da amostra e do padrão, absorbâncias da amostra e do padrão, após subtração da absorbância do branco¹².

A Tabela 4 apresenta os resultados de concentração dos fármacos obtidos nas preparações farmacêuticas que se apresentam em associação (amostras), verificando-se que os valores concordam com os das soluções padrão (tanto os obtidos diretamente pela espectrofotometria, como os obtido pela cromatografia-espectrofotometria), o que torna o método promissor quanto a sua aplicação.

De maneira geral, as monografias oficiais estabelecem uma faixa compreendida entre 95–105% para produtos acabados¹² e, considerando que os ensaios foram obtidos em função da quantidade de ingrediente ativo nos medicamentos, verificou-se através da Tabela 4 que as formulações se encontram dentro dos padrões oficiais.

A principal vantagem da quantificação desses fármacos associados, pela cromatografia – espectrofotometria é o baixo custo e a possibilidade de analisar preparações farmacêuticas que apresentam mais de um componente ativo, num tempo relativamente curto, comparado com outras técnicas.

CONCLUSÃO

O método proposto é aplicável para a determinação de fármacos diuréticos em associação e nenhuma interferência foi observada com relação aos excipientes utilizados pelas indústrias farmacêuticas.

O método cromatografia - espectrofotometria apresenta vantagens em relação a outras técnicas, uma vez que permite a quan-tificação de múltiplos ingredientes ativos com precisão adequada, num curto período de tempo, além do seu baixo custo.

A metodologia apresenta resultados satisfatórios e promissores no que se refere à sua aplicação no controle de qualidade de medicamentos.

AGRADECIMENTOS

Ao CNPq pelo apoio financeiro.

Recebido em 25/10/06; aceito em 5/7/07; publicado na web em 19/12/07

• 1. Goodman, L. S.; Gilman, A.; As bases farmacológicas da terapêutica, 10Ş ed., Guanabara Koogan : Rio de Janeiro, 2003.
• 2. Belal, F.; Ibrahim, F.; El Brashy, A.; Analyst 1988, 113, 637.
• 3. Erk, N.; J. Pharm. Biomed. Anal 2001, 24, 603.
• 4. Gotardo, M. A.; Pezza, L.; Pezza, H. R.; Eclet. Quim 2005, 30, 17.
• 5. Magalhães, J. F.; Piros, M. G.; Rev. Bras. Cienc. Farm. 1971, 8, 273.
• 6. Carda-Broch, S.; Esteve-Romero, J.; Ruiz, A. M. J.; Garcia, A. C. M. C.; Analyst 2002, 127, 29.
• 7. Degen, P. H.; Schweizwe, A.; J. Chromatogr. 1977, 142, 549.
• 8. Sanz Nebot. V.; Toro, I.; Bergés, R.; Ventura, R.; Segura, R.; Barbosa, J.; J. Mass Spectrom. 2001, 36, 652.
• 9. Seemaan, F. S.; Santos Neto, A. J.; Lanças, F. M.; Cavalheiro, E. T. G.; Anal. Lett. 2005, 38, 1651.
• 10. Ruddy, D.; Sherma, J.; J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol 2002, 25, 321.
• 11. Valladão, D. M. S.; Zuanon Netto, J.; Ionashiro, M.; Eclet. Quim 1994, 19, 57.
• ¹²
  US Pharmacopeial Convention, INC; United States Pharmacopeia- The National Formulary XXXIII, Twinbrook Parkway: Rockville, 1995.

†

In memoriam

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Fev 2008
• Data do Fascículo
  2008

Histórico

• Aceito
  19 Dez 2007
• Revisado
  05 Jul 2007
• Recebido
  25 Out 2006