Influência da naloxona e metisergida sobre o efeito analgésico do laser em baixa intensidade em modelo experimental de dor

Influencia de la naloxona y la metisergida sobre el efecto analgésico del láser en baja intensidad en modelo experimental de dolor

Resumos

JUSTIFICATIVA Y OBJETIVOS: La fototerapia con láser (LPT) es un método analgésico promisorio, aunque su mecanismo de acción no se conozca en su totalidad. El objetivo de este estudio fue evaluar si la acción de la LPT es dependiente de la activación de receptores opioides o serotoninérgicos periféricos. MÉTODO: Se usaron ratones Wistar machos. El dolor generado fue de carácter inflamatorio, a través de la inyección de carragenina en la pata posterior izquierda de los ratones. El láser utilizado fue el GaIAsAl (660 nm), fluencia de 2,5 J.cm-2. Se analizó la hiperalgesia mecánica utilizando filamentos de von Frey. Los animales se dividieron en cinco grupos: Carragenina; Láser (LPT); Luz no coherente; LPT + Naloxona y LPT + Metisergida. RESULTADOS: La fototerapia con láser en baja intensidad demostró ser un método analgésico eficaz, mientras que el uso de la fuente de luz no coherente no demostró poseer ningún efecto analgésico. El uso de naloxona bloqueó el efecto analgésico del LPT, mientras que el uso de metisergida no afectó la analgesia del LPT. CONCLUSIONES: La LPT en los parámetros utilizados tuvo un efecto analgésico. La analgesia de la LPT es mediada por receptores opióides periféricos. La LPT parece que no interactúa con los receptores serotoninérgicos periféricos.

BACKGROUND AND OBJECTIVES: Although the mechanism of action of laser phototherapy (LPT) is not known, it is a promising analgesic method. The aim of this study was to evaluate whether the action of LPT depends on the activation of peripheral opioid or serotonergic receptors. METHOD: Inflammatory pain was induced through the injection of carrageenin in the left posterior paw of male Wistar rats. The InGaAIP visible laser diode (660 nm) with fluency of 2.5 J.cm-2 was used. Von Frey filaments were used to analyze mechanical hyperalgesia. Animals were separated into five groups: Carrageenin; Laser (LPT); Non-coherent light; LPT + Naloxone; and LPT + Methysergide. RESULTS: Low-Level Laser phototherapy proved to be an effective analgesic method, while non-coherent light did not show a similar effect. The use of naloxone blocked the analgesic effect of LPT, while methysergide did not affect LPT-induced analgesia. CONCLUSIONS: According to the parameter used in this study, LPT produced analgesia. Analgesia induced by laser phototherapy is mediated by peripheral opioid receptors. Laser phototherapy does not seem to interact with peripheral serotonergic receptors.

ANALGESIA; ANIMALS

ARTIGO CIENTÍFICO

Influência da naloxona e metisergida sobre o efeito analgésico do laser em baixa intensidade em modelo experimental de dor

André Peres e Serra^I; Hazem A Ashmawi^II

^IAnestesiologista; Pesquisador Colaborador do Departamento de Anestesiologia da FMUSP

^IIAnestesiologista; Professor Colaborador do Departamento de Cirurgia da FMUSP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS: A fototerapia com laser (LPT) é um método analgésico promissor, embora seu mecanismo de ação não seja totalmente conhecido. O objetivo deste estudo foi avaliar se a ação da LPT é dependente da ativação de receptores opioides ou serotoninérgicos periféricos.

MÉTODO: Foram utilizados ratos Wistar machos. A dor produzida foi de caráter inflamatório, através da injeção de carragenina na pata posterior esquerda dos ratos. O laser utilizado foi o Photon Lase III em meio ativo InGaAIP (660 nm), fluência de 2,5 J.cm^-2. Analisou-se a hiperalgesia mecânica utilizando filamentos de von Frey. Os animais foram separados em cinco grupos: Carragenina; Laser (LPT); Luz não coerente; LPT + Naloxona e LPT + Metisergida.

RESULTADOS: A fototerapia com laser em baixa intensidade mostrou-se um método analgésico eficaz, enquanto o emprego de fonte de luz não coerente não mostrou ter efeito analgésico. O uso de naloxona bloqueou o efeito analgésico do LPT; já o uso de metisergida não afetou a analgesia do LPT.

CONCLUSÕES: A LPT nos parâmetros utilizados apresentou efeito analgésico. A analgesia da LPT é mediada por receptores opioides periféricos. A LPT parece não interagir com receptores serotoninérgicos periféricos.

Unitermos: ANALGESIA: laser de baixa intensidade; ANIMAIS: ratos Wistar.

INTRODUÇÃO

A dor é definida pela Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) como uma experiência sensorial ou emocional desagradável, associada à lesão tecidual real ou potencial ou descrita nos termos dessa lesão ¹.

A procura por formas de controle e tratamento dos diversos tipos de dor tem sido constante. Vários métodos analgésicos são empregados na atualidade. O laser em baixa intensidade (LBI) tem sido utilizado por cirurgiões para diminuir o tempo de cicatrização e a ocorrência de comorbidades na ferida operatória, por oftalmologistas na redução da dor causada por glaucoma e para tratamento da retinopatia da prematuridade, por dermatologistas para tratamento de líquen plano, dermatites e queloides e por dentistas no tratamento da mucosite oral e dores orofaciais ^2-9.

Vários mecanismos de ação têm sido propostos para explicar as propriedades terapêuticas e analgésicas do LBI. A analgesia parece dever-se à emissão luminosa coerente temporal e espacialmente com emissão de ondas paralelas de mesmo comprimento, com picos e vales em sincronia ¹⁰. Efeitos como biomodulação, capacidade de estimular a divisão celular, vasodilatação por liberação de óxido nítrico, aumento de cortisol e da síntese proteica, aumento do cálcio intracelular e da atividade da superóxido dismutase também têm sido associados à analgesia do LBI ^11-16. Outro possível mecanismo de ação ocorreria por meio da ativação de cromóforos intracelulares presentes nas mitocôndrias ¹⁷. A hipótese de três mecanismos de ação do LBI também foi sugerida: a) ação fotodinâmica nas membranas celulares acompanhada por aumento dos níveis de cálcio intracelular e da estimulação celular; b) fotorreativação da cobrezinco superóxido dismutase (SOD) e c) fotólise dos complexos metálicos do óxido nítrico (NO) com liberação desse vasodilatador, sendo essas características do laser responsáveis por seu efeitos regenerativo e vasodilatador ¹⁵.

A ação do oxigênio singleto, que estimularia a síntese de RNA e de DNA devido à alteração de moléculas fotoabsorventes, como porfirinas e flavoproteínas, também foi proposta como mecanismo de ação do LBI ¹⁰.

Os mecanismos apresentados são principalmente decorrentes de ações intracelulares do LBI. Não está claro se o LBI age diretamente na célula ou através de segundo mensageiro. Efeito anti-inflamatório gerado pelo LBI foi demonstrado ¹⁸. A mediação do efeito analgésico por receptor opioide foi estudada; entretanto, os resultados são conflitantes, tendo sido relatado efeito mediado por receptor opioide ^18,19, assim como independente de receptor opioide ²⁰. A influência de receptores serotoninérgicos na analgesia do LBI não foi relatada. Observa-se que não há consenso sobre o mecanismo de ação do LBI e este estudo teve como objetivo estudar os papéis de receptores opioides e serotoninérgicos na analgesia do LBI em modelo de dor inflamatória induzida por carragenina em pata de ratos.

MÉTODO

Foram utilizados 50 ratos Wistar machos, pesando entre 250 e 300 gramas, fornecidos pelo Biotério da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), mantidos em três animais por compartimento onde permaneceram por pelo menos 15 dias antes do início do experimento para adaptação adequada, sendo alimentados com ração balancea da comercial e água ad libitum, ciclo claro-escuro de 12 horas e temperatura ambiente variando de 19° a 25°C.

Para realização dos procedimentos experimentais, foram obedecidas às normas éticas para experimentos em animais acordados da Associação Internacional para o Estudo da Dor (IASP) ²¹. O projeto foi aprovado pela Comissão de Ética para Análise de Projetos de Pesquisa (CAPPesq) do Hospital das Clínicas da FMUSP (registro de pesquisa nº 1513, projeto CAPPesq nº 0956/07). Todos os experimentos foram realizados no Laboratório de Investigação Médica 08 da Faculdade de Medicina da USP.

O tamanho da amostra foi calculado por meio do programa Power and Sample Size Program Version 2.1.30^® utilizando-se os seguintes parâmetros: poder do estudo de 80% para detectar diferenças entre as médias acima de 0,33, com nível de significância de 0,05 e desvio-padrão de 0,45 unidade. Para satisfazer esses valores, foram necessários 10 ratos por grupo.

Os animais foram aleatoriamente separados em 5 grupos, com 10 ratos em cada. Cada animal recebeu injeção de 200 µg de carragenina λ (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, Estados Unidos), dissolvidos em solução fisiológica 0,9%, volume total de 100 µL, na região plantar da pata posterior esquerda para indução da dor ²². Após período de 45 minutos da injeção da carragenina, os animais foram restringidos e receberam aplicação de solução fisiológica 0,9% em volume de 50 µL na pata posterior esquerda (Grupos Controle, Luz Branca e LBI), 1 µg/pata de naloxona (Cristália Prod. Quim. Farm., Brasil) em volume de 50 µL na pata posterior esquerda (Grupo LBI + Naloxona) e 1 µg/pata de metisergida (Sigma-Aldrich, Saint Louis, MO, Estados Unidos) em volume de 50 µL na pata posterior esquerda (grupo LBI + Metisergida).

Após 15 minutos da aplicação de solução fisiológica 0,9%, naloxona ou metisergida, de acordo com cada grupo, os animais receberam a primeira aplicação de luz branca ou LBI. A segunda aplicação foi realizada 1 hora após a primeira, segundo informações apresentadas no Quadro 1.

O equipamento laser utilizado foi um diodo semicondutor em meio ativo InGaAIP (Photon Lase III, DMC, São Carlos, Brasil), com comprimento de onda da 660 nm, fluência de 2,5 J.cm^-2, definida a partir dos seguintes parâmetros: potência de 15 x 10^-3 W, ponteira de 0,028 cm², a 2 mm de distância da pele da pata do rato, por 5 segundos ^14,23.

A avaliação da hiperalgesia mecânica induzida pela carragenina foi avaliada através da utilização de filamentos de von Frey. Os animais foram colocados sobre uma tela plástica elevada (com dimensões 21x27x15 cm) com aberturas de 12x12 mm, recobertos com caixa plástica transparente e, após período de aclimatação, testados com filamentos de nylon de força previamente conhecida (Stoelting Co., Wood Dale, IL, Estados Unidos). Os filamentos foram aplicados perpendicularmente à pata do animal, através das aberturas da tela plástica, com forças crescentes, entre 10 mN e 250 mN. No caso de o animal não apresentar resposta com o filamento de 250 mN, o valor de 522 mN (o filamento seguinte) foi considerado. Realizaram-se três medidas com intervalos entre 5 e 10 minutos, e foi considerada como o valor limiar a menor das três medidas obtidas. As medidas foram realizadas nas duas patas traseiras antes da administração dos antagonistas e após 1 hora, 2 horas, 3 horas e 4 horas da administração da carragenina.

A análise estatística foi realizada utilizando-se o modelo generalizado linear (GLM), um tipo de teste estatístico que teve como finalidade a comparação das curvas obtidas como um todo. Outro teste utilizado foi a análise de variância (ANOVA), para comparação dos resultados em cada momento do estudo (0, 1, 2, 3 e 4 horas). Adotou-se nível de significância menor que 5% (p < 0,05). Os testes foram realizados utilizando-se o software de análise estatística SPSS 13.0. Os resultados foram expressos por meio da média ± erro-padrão.

Tanto as injeções da carragenina, de solução fisiológica e dos antagonistas, quanto o teste algesimétrico foram realizados pelo mesmo pesquisador (APS).

RESULTADOS

A Tabela I mostra os resultados obtidos pela técnica de modelo generalizado linear (GLM). Os resultados apresentados referem-se ao efeito da interação grupo e tempo, ou seja, comparando as curvas por completo, sempre entre dois grupos.

Grupo Laser - mostrou-se diferente do Grupo Controle na análise de modelo generalizado linear (p = 0,032). Comparando-se os resultados hora a hora, houve diferença significativa nos momentos 3 e 4 horas na comparação com o Grupo Controle (Gráfico 1).

Grupo Luz Branca - não se mostrou diferente do Grupo Controle na análise de modelo generalizado linear, mas foi diferente do Grupo Laser. Usando-se a comparação hora a hora, a diferença entre os dois grupos ocorreu na quarta hora após a administração de carragenina. (Gráfico 1).

Grupo Laser + Naloxona - o Grupo LBI + Naloxona não se mostrou diferente do Grupo Controle, mas houve diferença significativa quando comparado com o Grupo Laser, com aumento da hiperalgesia. Comparando-se os resultados hora a hora, verificou-se que a diferença com relação ao Grupo Laser ocorreu nos momentos 3 e 4 horas. (Gráfico 1).

Grupo Laser + Metisergida - o Grupo LBI + Metisergida mostrou-se diferente do Grupo Controle na análise de modelo generalizado linear, não havendo diferença significativa quando comparado com o Grupo Laser. Comparando-se os resultados hora a hora, verificou-se que a diferença ocorreu nos momentos 2, 3 e 4 horas. (Gráfico 1).

DISCUSSÃO

Na busca por métodos analgésicos e anti-inflamatórios novos, o laser em baixa intensidade (LBI) parece ser promissor, por diminuir a dor inflamatória de forma eficaz e produzir poucos efeitos colaterais ¹⁸. Os efeitos do LBI são dependentes da dose, não se obtendo a resposta esperada quando empregado em sub ou superdosagem, mas observando-se efeito analgésico eficaz quando utilizado em doses adequadas ^14,23. Como esperado, o LBI nos parâmetros utilizados por este estudo mostrou ser analgésico eficaz, aumentando significativamente o limiar de hiperalgesia mecânica nos animais do Grupo Laser em comparação ao Grupo Controle. O Grupo Luz Branca (fonte de luz comum, não monocromática e não coerente), utilizado como um segundo controle, também não apresentou efeito analgésico.

A interação entre a analgesia do LBI e os receptores opioides ainda é sujeita a debates. O LBI aumenta a liberação periférica de opioides por meio da migração de células do sistema imune, com liberação de betaendorfina local e antagonizado por naloxona ^18,19; por outro lado, outro trabalho utilizando modelo de dor induzida por carragenina não conseguiu demonstrar que o efeito analgésico do LBI fosse antagonizado por naloxona ²⁰. Os modelos e doses de laser utilizados foram diferentes nos trabalhos, e a via de administração de naloxona também diferiu, sendo intraperitoneal ^18,19 ou intraplantar ²⁰. O trabalho aqui realizado demonstrou mediação do efeito analgésico por naloxona, concordando com resultados de prévios autores ^18,19.

A naloxona tem início de ação após 2 minutos, apresentando tempo de ação dependente da dose e da via de administração utilizadas. Possui meia-vida de 43 a 90 minutos e duração de ação de aproximadamente 1,5 hora ^24,25. No presente estudo, a naloxona foi utilizada 15 minutos antes da primeira aplicação e 1 hora e 15 minutos antes da segunda aplicação do LBI, estando em concentração adequada durante as aplicações. Apesar de atravessar a barreira hematoencefálica, a naloxona, quando utilizada na dose de 1 µg/pata, antagoniza somente o efeito opioide periférico, sem apresentar efeito sistêmico ^26,27.

A naloxona é um antagonista de receptor opioide inespecífico, apresentando maior afinidade sobre os receptores µ e κ e menor em receptores δ. Em função da maior afinidade pelos receptores µ e κ, é provável que o efeito analgésico do LBI seja mediado por esses dois receptores. Como a afinidade da naloxona pelos receptores δ é menor, não é possível determinar o papel desse receptor na analgesia provocada pelo LBI, sendo interessante a utilização de antagonista específico.

O papel da serotonina (5-HT) na analgesia do LBI ainda não havia sido estudado. Há diferentes tipos de receptores para serotonina (5-HT₁, 5-HT₂, 5-HT₃, 5-HT₄, 5-HT₅, 5-HT₆, 5-HT₇), presentes em diferentes tecidos, com funções variáveis. No sistema nervoso, na periferia, a serotonina tem sido associada ao efeito pró-nociceptivo ^28,29. Entretanto, o receptor 5HT₁ parece ter ação analgésica em modelo de dor neuropática, não estando claro se o efeito analgésico é central ou periférico ³⁰. O receptor 5-HT₁ tem sido apontado tanto como pró-nociceptivo como analgésico ^29,30. Em função dessa dúvida, utilizou-se a metisergida, que é antagonista 5-HT₁, 5-HT₂ e 5-HT₇, para avaliar se a analgesia do LBI seria mediada por receptores 5-HT₁ presentes na periferia, o que não se comprovou pelos resultados obtidos, nos quais o padrão da analgesia do LBI foi mantido na presença da metisergida. Como o efeito do LBI também não foi potencializado, há indícios de que sua ação analgésica seja independente dos receptores serotoninérgicos 5-HT₁, 5-HT₂ e 5-HT₇ presentes na periferia.

Os resultados obtidos neste trabalho dão suporte de que, pelo menos parcialmente, o efeito analgésico do LBI seja mediado por receptores opioides periféricos, mas não mediado por receptores serotoninérgicos periféricos.

AGRADECIMENTOS

Ao Laboratório Especial de Laser em Odontologia da Faculdade de Odontologia da USP (LELO-FOUSP), por meio das colaboradoras Profª. Ana Cláudia Luiz e Profa. Dra. Alyne Simões, pelo auxílio na utilização e obtenção do equipamento de laser. Ao Sr. Gilberto, técnico de laboratório do Laboratório de Investigação Médica 08 da Faculdade de Medicina da USP, pelo auxílio na realização dos experimentos. À DMC Equipamentos Ltda. (São Carlos, SP), pelo empréstimo do equipamento Photon Lase III utilizado em todos os experimentos do presente estudo.

Submetido em 25 de fevereiro de 2009

Aprovado para publicação em 3 de fevereiro de 2010

Recebido da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (FMUSP), SP

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Jun 2010
• Data do Fascículo
  Jun 2010

Histórico

• Recebido
  25 Fev 2009
• Aceito
  03 Fev 2010