Efeitos do pré-tratamento com propofol sobre a apoptose de células miocárdicas e expressão de SERCA2 em ratos com isquemia/reperfusão hepática

Resumo

Introdução:

A lesão hepática por isquemia-reperfusão é um processo fisiopatológico comum em cirurgias hepáticas. Mais estudos ainda são necessários para avaliar se o propofol pode reduzir a lesão de isquemia-reperfusão miocárdica induzida pela lesão de isquemia-reperfusão hepática em ratos, juntamente com os mecanismos que estão relacionados.

Objetivo:

Investigar se propofol protege as células do miocárdio da apoptose com a lesão hepática por isquemia-reperfusão.

Métodos:

Ratos machos da raça Sprague-Dawley (n = 18) foram alocados aleatoriamente em três grupos: Grupo Sham (Grupo S, n = 6), Grupo Lesão Hepática por Isquemia-reperfusão (Grupo IR, n = 6) e Grupo Propofol (Grupo P, n = 6). O Grupo S foi submetido apenas à laparotomia. O grupo IR foi submetido à isquemia por 30 min e reperfusão por 4 h. O grupo P foi submetido à mesma isquemia do grupo IR, com a administração de 120 mg.kg^-1 de propofol iniciada 10min antes da isquemia, seguida de infusão contínua a 20 mg.kg^-1.h^-1. A apoptose celular foi examinada por meio do ensaio de marcação de terminações dUTP pela deoxinucleotidil transferase. Retículo endoplasmático Ca²⁺-ATPase2 (SERCA2) e caspase-3 do ácido aspártico contendo cisteína (caspase-3 clivada) foram avaliados com o ensaio western blot e reação em cadeia da polimerase.

Resultados:

A taxa de apoptose foi maior com mRNA e proteína de SERCA2 regulados para baixo e caspase-3 clivada suprarregulada no Grupo IR, em comparação com o Grupo S (p < 0,01). A taxa de apoptose foi menor com mRNA e proteína de SERCA2 suprarregulada e caspase-3 clivada sub-regulada no Grupo P, em comparação com o Grupo IR (p < 0,01).

Conclusões:

O propofol pode reduzir a apoptose de células miocárdicas induzida por lesão hepática por isquemia-reperfusão. Entretanto, pode suprarregular o mRNA e a proteína de SERCA2 em ratos.

PALAVRAS-CHAVE
Propofol; Fígado; Lesão de reperfusão; Miocárdio; Retículo endoplasmático Ca2+-ATPase2

Abstract

Introduction:

Hepatic ischemia-reperfusion injury is a common pathophysiological process in liver surgery. Whether Propofol can reduce myocardial ischemia-reperfusion injury induced by hepatic ischemia-reperfusion injury in rats, together with related mechanisms, still needs further studies.

Objective:

To investigate if propofol would protect the myocardial cells from apoptosis with hepatic ischemia-reperfusion injury.

Methods:

Male Sprague-Dawley rats (n = 18) were randomly allocated into three groups: Sham Group (Group S, n = 6), Hepatic Ischemia-reperfusion Injury Group (Group IR, n = 6) and Propofol Group (Group P, n = 6). Group S was only subjected to laparotomy. Group IR was attained by ischemia for 30 min and reperfusion for 4 h. Group P was subjected identical insult as in Group IR with the administration of propofol started 10 min before ischemia with 120 mg.kg⁻¹, following by continuous infusion at 20 mg.kg⁻¹.h⁻¹. Cell apoptosis was examined by terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling assay. Endoplasmic reticulum Ca²⁺-ATPase2 (SERCA2) and cysteine-containing aspartic acid cleaved-caspase3 (cleaved-caspase3) were assayed by western blot and Altimeter polymerase chain reaction.

Results:

Apoptosis rate was increased, with mRNA and protein of SERCA2 down-regulated and cleaved-caspase3 up-regulated in Group IR compared with Group S (p < 0.01). Apoptosis rate was decreased, with mRNA and protein of SERCA2 up-regulated and cleaved-caspase3 down-regulated in Group P compared with Group IR (p < 0.01).

Conclusions:

Propofol can reduce hepatic ischemia-reperfusion injury-induced myocardial cell apoptosis, meanwhile, can up-regulate mRNA and protein of SERCA2 in rats.

KEYWORDS
Propofol; Liver; Reperfusion injury; Myocardium; Endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase2

Introdução

A isquemia-reperfusão hepática total é comumente encontrada na macrossecção central do tumor hepático ou na área do fígado, no tumor do lobo caudado e na ressecção hepática e no transplante ortotópico de fígado. Nos últimos anos, estudos relatam que a lesão de isquemia-reperfusão (I/R) hepática tem reação geral, pode afetar a função hepática e causar danos em órgãos distantes.^1-4 Os principais mecanismos podem ser derivados do aumento de radicais de oxigênio e da sobrecarga de cálcio nas células, o aumento de radicais de oxigênio é o fator mais importante.^5-7 Como prevenir e curar a lesão hepática após I/R e as lesões secundárias a órgãos distantes são questões importantes a serem resolvidas.

Na reperfusão pós-isquemia hepática da veia hepática para o átrio direito, o coração é o primeiro órgão a receber a perfusão sanguínea e o estágio inicial pode gerar danos. A sobrecarga de cálcio, a geração de radicais de oxigênio e a morte de células cardíacas são os principais motivos que levam à lesão miocárdica causada por I/R.^8,9 O estágio inicial da lesão de I/R hepática pode gerar uma grande quantidade de radicais de oxigênio⁷ que podem chegar aos tecidos musculares cardíacos via reperfusão sanguínea. O radical oxigênio pode ativar peróxido em lipídios da membrana e levar ao aumento da permeabilidade da membrana miocárdica e agir diretamente sobre a Ca²⁺-ATPase2 no retículo sarcoplasmático/endoplasmático (SERCA2). O processo pode reduzir a função da SERCA2 ou inibir sua atividade, reduzir ainda mais a ingestão de Ca²⁺ e levar à sobrecarga de cálcio.^10-12 Uma grande quantidade de caspase-3 ativada pode levar à apoptose miocárdica.^13,14

Atualmente, o propofol tem sido amplamente aplicado na anestesia clínica e é o medicamento comum para estudar a proteção da lesão de isquemia-reperfusão. O propofol pode proteger órgãos distantes na isquemia-reperfusão hepática em ratos^15,16 e este estudo teve como objetivo estimar o efeito do propofol sobre a apoptose miocárdica e seu mecanismo.

Material e métodos

Animais

Ratos machos Sprague-Dawley entre 200 e 230 g foram comprados no Experimental Animal Center (número de licença: SCXK-Jun 2012-0004); os experimentos foram iniciados após uma semana de alimentação adaptativa com adequação de água e ração. Este estudo foi feito em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo de uso de animais foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional para o Uso e Cuidado de Animais (IACUC) da Universidade de Medicina de Shanxi.

Designação dos grupos

Os ratos (n = 18) foram randomicamente alocados em três grupos: Grupo S (n = 6), Grupo IR (n = 6) e Grupo P (n = 6).

Preparação do modelo de I/R nos ratos

Segundo estudos prévios,^16,17 após a indução anestésica via injeção intraperitoneal de uretano a 25% (0,4 mL.100 mg^-1), o rato foi preso com firmeza em supinação sobre a mesa cirúrgica, a pele abdominal foi raspada, o animal foi desinfetado e a cavidade abdominal foi aberta camada por camada. Uma micropinça vascular não invasiva foi então usada para fixar o pedículo do fígado para preparar o modelo de isquemia hepática total; 30 minutos (min) depois a perfusão foi recuperada. Para os ratos no Grupo S, o abdome foi aberto apenas para o porta hepatis, mas não foi ligado. O grupo IR foi preparado como o modelo de lesão hepática por IR total. Para o Grupo P, uma dose de carga de propofol (20 mg.kg^-1) foi injetada lentamente através da veia caudal 10 min antes da preparação do modelo e depois continuamente infundida a uma velocidade de 20 mg.kg^-1.h^-1, até a execução. Os demais procedimentos foram iguais aos do Grupo IR.

Coleta de amostras

Os ratos dos grupos IR e P foram mortos quatro horas (h) após a reperfusão e os ratos do Grupo S foram mortos 4 h após a dissecção do porta hepatis. A cavidade torácica foi então aberta e o coração exposto; após o enxágue com solução salina, os ventrículos direito e esquerdo foram cortados ao longo do septo interventricular e os tecidos miocárdicos da parede ventricular esquerda foram rapidamente seccionados e armazenados a -80 °C para posterior detecção de apoptose em cardiomiócitos e exame de proteínas relacionadas. Os tecidos do lobo lateral esquerdo foram então amostrados para coloração com hematoxilina-eosina (HE) e as observações histopatológicas foram feitas com um microscópio de luz (com ampliação de 200×).

Detecção de apoptose em células miocárdicas pelo ensaio de marcação de Nicks por dUTP-biotina mediada por desoxinucleotidil transferase terminal (TUNEL)

Uma quantidade apropriada de tecido miocárdico foi usada para detectar apoptose com o kit de detecção de apoptose TUNEL (Beyotime Biotechnology Co. Ltd., Xangai, China), de acordo com as instruções do fabricante, sob um microscópio de luz (com ampliação de 200×).

Detecção de proteínas SERCA2 e caspase-3 clivada em tecidos miocárdicos por western blot

Proteínas teciduais totais foram extraídas de 100 mg de tecidos miocárdicos; albumina de soro bovino (Beyotime Biotechnology Co. Ltd., Xangai, China) foi usada como padrão proteico. Os teores de proteína foram então determinados com o método azul brilhante de Coomassie. Uma quantidade igual de amostra de proteína (50 µg) foi então separada com o uso de eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecilsulfato de sódio a 10% e transferida para uma membrana de nitrocelulose pelo método de transferência semisseco. Após o bloqueio com albumina de soro bovino a 3% por 2 h, o anticorpo SERCA2 diluído (1:1.000; Abcam Inc., EUA) e o anticorpo clivado da caspase-3 (1:1.000; Abcam Inc., EUA) foram adicionados às membranas e incubados durante a noite a 4 °C. Após lavagem com TBST (Tris-HCl, NaCl, Tween 20) (5 min × 3 x), o anticorpo secundário anti-IgG de coelho feito em cabra (H + L) (1:5.000) foi adicionado à membrana e incubado a 37 °C por 2 h. Esse processo foi seguido por lavagem com TBST (5min × 3x) e desenvolvimento com o kit de quimioluminescência BeyoECL Plus. O sistema de imagem em gel ChemiDoc™ XRS (Bio-Rad, EUA) foi usado para escaneamento e o software de análise Quantity One foi usado para detecção e análise da expressão de SERCA2 e caspase-3.

Detecção do mRNA de SERCA2 e caspase-3 clivada em tecidos miocárdicos por reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real

O RNA total foi extraído de acordo com as instruções do kit trizol (Invitrogen). O RNA foi então transcrito reversamente em cDNA com o uso do kit RT-PCR e o método de uma etapa para posterior amplificação por PCR; os produtos de amplificação por PCR foram então analisados por eletroforese em gel. O sistema de transcrição reversa foi usado com 2 µL do molde de RNA total (1 µg), 2 µL da mistura de dNTP, 2 µL de MgCl2, mais EDPC e água destilada para 25 µL. Os parâmetros da reação foram os seguintes: pré-saturação a 95 °C por 5 min, desnaturação a 95 °C por 30s, anelamento a 58 °C por 30s e extensão a 72 °C por 30s, por 40 ciclos. Os iniciadores (primers) usados são apresentados na tabela 1 (Sangon Biotech (Xangai) Co., Ltd., China).

Tabela 1
Promotores (primers) RT-PCR de SERCA, caspase-3 e GADPH

Gene	Primer (5'-3')
SERCA	For: GAGATCAGCTAGGTCAGCG
	Rev: GCATTGGTTACGCTGCTAG
Caspase-3	For: GGCATGGAGAACACTGAAAC
	Rev: GCGAATCTGTTTCTTTGCATG
GADPH	For: AGCCACATCGCTCAGACA
	Rev: TGGACTCCACGACGTACT

• GADPH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; SERCA: retículo endoplasmático Ca²⁺-ATPase2.GADPH foi usado como referência interna. Primer (5'-3 '): sequência da extremidade 5' para a extremidade 3'; For: forward; Rev: reverse.

Análise de dados

O software SPSS 13.0 foi usado para análise estatística. Os dados eram de distribuição normal e foram expressos em média ± desvio-padrão e as comparações intergrupos foram feitas com Anova, com p < 0,05 considerado estatisticamente significante.

Resultados

Coloração com HE (hematoxilina-eosina)

Os tecidos hepáticos do Grupo S não apresentaram infiltração de neutrófilos e as estruturas do fígado estavam claras e completas. Os tecidos hepáticos dos grupos IR e P apresentaram sinusoides hepáticos estreitos, edema evidente e degeneração vacuolar após 4 h de reperfusão. Os filetes de células hepáticas estavam desordenados com necrose local. As lesões das células hepáticas do Grupo P foram significativamente reduzidas em comparação com as do Grupo IR e a morfologia do fígado estava próxima ao normal, com congestão sinusoidal e ocasional infiltração de uma pequena quantidade de células inflamatórias.

Detecção de apoptose miocárdica por TUNEL

No Grupo IR, a taxa de apoptose aumentou significativamente, em comparação com a do Grupo S (p < 0,01 para todos). No Grupo P, a taxa de apoptose diminuiu significativamente, em comparação com a do Grupo IR (p < 0,01 para todos), conforme demonstrado na figura 1 e tabela 2.

Figura 1
Detecção de apoptose miocárdica. Grupo IR: grupo submetido à lesão de isquemia-reperfusão hepática, obtida com isquemia por 30 min e reperfusão por 4 h. Grupo P: grupo propofol, submetido à isquemia idêntica à do Grupo IR, com a administração de propofol iniciada 10 min antes da isquemia com 20 g.kg^-1, seguida de infusão contínua a 20 g.kg^-1.h^-1. Grupo S: grupo sham; Grupo IR: grupo isquemia-reperfusão; Grupo P: grupo propofol.

* p < 0,01: comparado com o Grupo S; ^# p < 0,01: comparado com o grupo IR.

Tabela 2
Determinação da taxa de apoptose de células miocárdicas em cada grupo

Grupo	Taxa de apoptose de células miocárdicas
Grupo S (n = 6)	2,06 ± 0,89
Grupo IR (n = 6)	33,06 ± 3,09a
Grupo P (n = 6)	19,26 ± 1,62b

• ^a
  p < 0,01 comparado com o Grupo S.
• ^b
  p < 0,01 comparado com o Grupo IR.
  Dados expressos em média ± desvio-padrão.

Detecção de proteínas de SERCA2 e caspase-3 clivada

A expressão da proteína de SERCA2 foi significantemente sub-regulada no Grupo IR, em comparação com o Grupo S, mas a proteína da caspase-3 clivada foi significativamente suprarregulada (p < 0,01 para todos). SERCA2 foi significativamente suprarregulada no Grupo P, em comparação com o grupo IR, mas a caspase-3 clivada foi significativamente sub-regulada no Grupo P (p < 0,01 para todos), conforme demonstrado na figura 2 e tabela 3.

Figura 2
Detecção das proteínas SERCA2 e caspase3 clivada em cada grupo. Grupo IR, grupo submetido à lesão de isquemia-reperfusão hepática, obtida com isquemia por 30 min e reperfusão por 4 h. Grupo P, grupo propofol, submetido à isquemia idêntica à do Grupo IR, com a administração de propofol iniciada 10 min antes da isquemia com 20 g.kg^-1, seguida de infusão contínua a 20 g.kg^-1.h^-1. SERCA2: retículo endoplasmático Ca²⁺-ATPase2; GADPH, gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase; Grupo S, grupo sham; Grupo IR, grupo isquemia-reperfusão; Grupo P, grupo propofol. GADPH foi usado como referência interna.

Tabela 3
Determinação das proteínas de SERCA2 e caspase-3 clivada em cada grupo

Grupo	SERCA2/GAPDH	Caspase-3 clivada/GAPDH
Grupo S (n = 6)	1,12 ± 0,058	0,33 ± 0,032
Grupo IR (n = 6)	0,54 ± 0,010a	0,99 ± 0,058a
Grupo P (n = 6)	0,93 ± 027b	0,70 ± 0,053b

• ^a
  p < 0,01 comparado com o Grupo S.
• ^b
  p < 0,01 comparado com o Grupo IR.
  Dados expressos em média ± desvio-padrão.

Detecção de mRNA de SERCA2 e caspase-3 clivada

Em comparação com o Grupo S, o mRNA de SERCA2 foi significativamente sub-regulado no Grupo IR, mas na caspase-3 clivada o mRNA foi significativamente suprarregulado (p < 0,01 para todos). Em comparação com o Grupo IR, o mRNA de SERCA2 foi significativamente suprarregulado no subgrupo P, mas a caspase-3 clivada foi significativamente sub-regulada no Grupo P (p < 0,01 para todos), conforme demonstrado na tabela 4.

Tabela 4
Determinação do mRNA de SERCA2 e caspase-3 clivada em cada grupo

Grupo	SERCA2/GAPDH	Caspase-3 clivada/GAPDH
Grupo S (n = 6)	1,10 ± 0,11	0,46 ± 0,033
Grupo IR (n = 6)	0,57 ± 0,052a	0,98 ± 0,063a
Grupo P (n = 6)	0,95 ± 0,92b	0,65 ± 0,056b

• ^a
  p < 0,01 comparado com o Grupo S.
• ^b
  p < 0,01 comparado com o Grupo IR.
  Dados expressos em média ± desvio-padrão.

Discussão

A caspase-3 é um membro importante na execução de apoptose da família caspase, é necessária para a resposta em cascata de protease apoptótica. Uma vez ativada, a apoptose não será evitada e é a enzima efetora e a protease-chave no processo de apoptose como índice sensível e principal fator de efetividade na apoptose celular. Portanto, o nível de expressão da caspase-3 pode ser usado para estimar a situação da apoptose celular.

Com base em modelo de rato para indução de I/R segundo Goldhaber et al.,¹¹ este estudo teve como objetivo detectar a taxa de apoptose de miócitos cardíacos com o método TUNEL e compreender a expressão da caspase-3 clivada com os métodos western blot e PCR. Descobrimos que a taxa de apoptose de miócitos cardíacos foi maior no Grupo IR do que no Grupo S e que as expressões de mRNA e proteína da caspase-3 clivada foram obviamente suprarreguladas, indicaram que o modelo de lesão de isquemia-reperfusão do miocárdio foi construído com sucesso. No experimento primário, a maior taxa de apoptose foi detectada com 4 h de reperfusão, causou sérios danos patológicos. Portanto, selecionamos os índices relevantes a 4 h de reperfusão. De acordo com o tempo e a dose administrada da droga,¹⁶ descobrimos que as taxas de apoptose no Grupo P foram menores do que as do Grupo IR e houve menos expressão de proteína e mRNA da caspase-3 clivada com os métodos de coloração com HE, TUNEL, western blot e PCR. Esses resultados implicam que propofol pode reduzir a apoptose miocárdica por I/R do fígado em ratos, resultados semelhantes aos observados por Gao et al.¹⁶ e Jin et al.¹⁷

A sobrecarga de cálcio intracelular desempenha um papel importante no desencadeamento de lesão de I/R do miocárdio e melhora a taxa de apoptose de miócitos cardíacos;^18-20 inibir a sobrecarga de cálcio pode reduzir significativamente o dano miocárdico causado por I/R.²¹ O retículo sarcoplasmático é o principal local de captação, reserva e liberação de Ca²⁺; SERCA2 pode manter baixo o nível de Ca²⁺ pela transmissão intracitoplasmática de Ca²⁺ para o retículo sarcoplasmático. Talukder et al.²² indicaram que uma expressão mais elevada de SERCA2 pode aumentar a captação de Ca²⁺, reduzir a sobrecarga de cálcio e, consequentemente, reduzir a lesão de I/R do miocárdio. Propofol pode ajustar a homeostase do cálcio intracelular e reduzir a apoptose miocárdica.²³ A expressão da SERCA2 pode refletir indiretamente a concentração de Ca²⁺ intracelular pela detecção de Ca²⁺ no tecido muscular cardíaco. Comparado com o Grupo S, a expressão de SERCA2 no Grupo I/R foi menor e a taxa de apoptose maior; na comparação com o Grupo I/R, a SERCA2 no Grupo P estava aumentada e a taxa de apoptose reduzida. Todos esses resultados indicam que propofol pode inibir a sobrecarga de cálcio pelo aumento da expressão de SERCA2 e, consequentemente, reduzir a apoptose do miocárdio causada por I/R.

Em resumo, a isquemia-reperfusão hepática total pode levar à apoptose do miocárdio em ratos, propofol pode reduzir a apoptose miocárdica induzida por isquemia-reperfusão hepática e o principal mecanismo pode ser a suprarregulação da expressão de SERCA2, que inibe a sobrecarga de cálcio. Mais detalhes sobre o mecanismo devem ser investigados em estudos adicionais que avaliem a concentração intracelular de Ca²⁺.

Agradecimentos

Este estudo foi apoiado pela Science and Technology Projects of Shanxi Health Planning Commission (n° 201-201-055).

Este estudo foi feito em estrita conformidade com as recomendações do Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Saúde. O protocolo de uso de animais foi revisado e aprovado pelo Comitê Institucional para o Uso e Cuidado de Animais (IACUC) da Universidade de Medicina de Shanxi.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Nov-Dec 2018

Histórico

• Recebido
  26 Set 2016
• Aceito
  15 Jun 2018
• Publicado
  24 Jul 2018