Variabilidade genética de isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense obtidos de bananais do norte de Minas Gerais

Genetic variability of Fusarium oxysporum f. sp. cubense isolates obtained from banana orchards of the north of Minas Gerais

DEFESA FITOSSANITÁRIA

Variabilidade genética de isolados de Fusarium oxysporum f. sp. cubense obtidos de bananais do norte de Minas Gerais¹

Genetic variability of Fusarium oxysporum f. sp. cubense isolates obtained from banana orchards of the north of Minas Gerais

Telma Miranda dos Santos^I; Marcia Regina Costa^II; Adelica Aparecida Xavier^II; Silvia Nietsche^II; Thiago Prates Fernandes^III; Gleice Viviane Nunes Pereira^III

^IEng. Agr. Mestranda em Fitotecnia, UFV, Viçosa, MG. E-mail: [e-mail]

^IIEng. Agr., Dr., Profs., Dep. Ciências Agrárias, UNIMONTES, Cx. Postal 91, CEP 39440-000 Janaúba-MG. E-mail: [e-mail] , [e-mail], [e-mail]

^IIIEstudantes do Curso de Agronomia, UNIMONTES, Cx. Postal 91, CEP 39440-000, Janaúba-MG. E-mails: [e-mail]; [e-mail]

RESUMO

A banana é uma das frutas tropicais mais consumidas no mundo, respondendo por, aproximadamente, 10% do comércio mundial de frutas. O mal-do-panamá, causado por Fusariumoxysporum f. sp. cubense (E.F. Smith), é uma das principais doenças da bananeira. Os marcadores moleculares RAPD têm sido extremamente úteis para estudos de identificação taxonômica, análise de variabilidade da virulência em fungos fitopatogênicos, caracterização de raças e variabilidade inter e intraespecifica de populações de diferentes regiões. O objetivo do trabalho foi avaliar a variabilidade genética de 36 culturas monospóricas de isolados de F. oxysporum f. sp. cubense por meio de marcadores moleculares do tipo RAPD. Foram selecionados 13 primers RAPD, e a análise de dados foi realizada utilizando-se do coeficiente de similaridade de Nei e Li. A partir da amplificação dos primers, foram obtidas 178 bandas, sendo que 167 (93,82%) apresentaram polimorfismo entre, pelo menos, dois isolados e apenas 11 (6,18%) apresentaram monomorfismo, demonstrando alta variabilidade entre os isolados. As distâncias genéticas variaram de 5,7 a 54,6%, sendo a distância média de 30,2%, e a distância média relativa, de 55,3%. De acordo com a análise de agrupamento (UPGMA), não foram observadas correlações entre os isolados estudados. Os resultados sugerem alta variabilidade genética entre os isolados avaliados, não ocorrendo agrupamento de acordo com a origem geográfica de coleta.

Termos para Indexação: mal-do-panamá, marcadores RAPD, Musa spp., bananeira.

ABSTRACT

Banana is one of the most consumed tropical fruits in the world, accounting for approximately 10% of world trade in fruits. Panama disease, caused by Fusariumoxysporum f. sp. cubense is a major disease of banana. RAPD marker have been used for taxonomic studies, analysis of variability of virulence in pathogenic fungi, characterization of races and variability inter and intra-specific populations from different regions. The objective of present study was to evaluate the genetic variability of 36 isolates of F. oxysporum f. sp. cubense using RAPD marker. Thirteen RAPD primers were selected and data analysis was performed using the similarity coefficient of Nei and Li. A total of 178 bands were obtained, of which 167 (93.82%) showed polymorphism at least two isolates and only 11 (6.18%) showed monomorphism, demonstrating the high variability among isolates. The genetic distances ranged from 5.7 to 54.6%, and the average distance of 30.2%. According to cluster analysis (UPGMA) no correlation among isolates were found. The results suggest a high genetic variability among isolates and no correlation between molecular groupings and their geographical origin were observed.

Index terms: Panama disease, RAPD marker, Musa spp., banana tree.

INTRODUÇÃO

No Brasil, a produção de banana dá-se em todos os estados da federação, com uma área colhida de aproximadamente 510 mil hectares e produção aproximada de 7 milhões de toneladas (CODEVASF, 2008). Minas Gerais destaca-se em quinto lugar, com a produção, em 2007, de 537.778 toneladas em uma área colhida de 36.627 mil hectares e rendimento de 14.683 kg/ha (IBGE, 2008).

A cultivar Prata-Anã é a mais plantada no norte de Minas Gerais, por apresentar características organolépticas que agradam às exigências do consumidor dos Estados do Rio de Janeiro, Minas Gerais e Brasília (ABANORTE, 2008). Entretanto, esta cultivar é suscetível a várias doenças, entre as quais se destacam o mal-do-panamá e a Sigatoka-amarela.

O mal-do-panamá é causado por um fungo habitante do solo, Fusariumoxysporum f. sp. cubense (E.F. Smith) Snyder & Hansen. Em regiões onde a doença ocorre, o impacto é extremamente severo, causando o colapso da atividade, com graves reflexos para a economia local. A doença induz morte prematura de plantas adultas, próximo ou durante o florescimento, e as perdas podem atingir 100% da produção, dependendo da maior ou menor incidência (PEREIRA et al., 2005). No norte de Minas Gerais essa doença tem assumido grande importância econômica, e de acordo com a Seapa (2008), a redução da produção desde 2007 foi provocada por essa doença.

A utilização de cultivares resistentes constitui-se na estratégia mais segura para o controle da doença ou redução dos prejuízos causados por esse patógeno. O programa de melhoramento possui como objetivo o desenvolvimento de cultivares com maior durabilidade da resistência. Sendo assim, o estudo da diversidade genética das populações dos patógenos em escala local, nas regiões produtoras de banana, poderá fornecer informações valiosas para os programas de melhoramento. Além disso, os estudos sobre tais populações do patógeno e análises genéticas da resistência de genótipos de bananeira a F. oxysporum f. sp. cubense, também permitirão futuros estudos epidemiológicos que auxiliarão nas estratégias de controle dessa enfermidade.

Atualmente, diversas metodologias são adotadas visando a estudar a variabilidade genética e a identificação de patógenos, sendo que a maior parte é baseada na utilização de marcadores moleculares (GOUVEIA et al., 2005; ZACCARO et al., 2007). Dentre as técnicas moleculares mais utilizadas, destaca-se o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) (ABD-ELSALAM, 2003).

A técnica RAPD apresenta as vantagens de: simplicidade, fácil obtenção de dados, custo relativamente reduzido em relação a outras técnicas moleculares e de aplicabilidade imediata a qualquer tipo de organismo, sem a necessidade de conhecimento prévio do seu genoma. Constitui-se, desta forma, em excelente ferramenta para obtenção de dados de polimorfismo para análise da diversidade genética de fungos (FERREIRA; GRATTAPAGLIA, 1998)

Um ponto a ser ressaltado é que a maioria dos estudos sobre a variabilidade de F. oxysporum f. sp. cubense foi realizada em outros países, impedindo a aplicação dos resultados nas condições brasileiras (BENTLEY et al., 1995). No Brasil, Silva (2009) caracterizou a diversidade genética de 66 isolados de F. oxysporum f. sp. cubense coletados em regiões produtoras de Santa Catarina por meio de descritores morfológicos e marcadores moleculares (RAPD e SSR), onde foi observada alta variabilidade com estimativas de similaridade que variaram de 35 a 98%. Desta forma, torna-se evidente a necessidade de um melhor conhecimento deste tipo de estudo nas condições brasileiras, sobretudo em regiões produtoras de banana, como no norte de Minas Gerais.

O objetivo do presente estudo foi avaliar a variabilidade genética de isolados monospóricos de F. oxysporum f. sp. cubense, oriundos de diferentes bananais do norte de Minas Gerais, por meio de marcadores moleculares do tipo RAPD.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram avaliados 36 isolados de F.oxysporum f. sp cubense provenientes da micoteca do Laboratório de Fitopatologia da UNIMONTES, obtidos de pseudocaule e solo de famílias doentes (Tabela 1). A patogenicidade destes isolados foi realizada em mudas micropropagadas da cultivar Maçã com cerca de 20 cm de altura. As raízes das mudas foram cortadas na sua extremidade e imersas em uma suspensão de 2,5x10⁵ conídios/mL por uma hora, e, em seguida, plantadas em solo arenoso tratada com brometo de metila. Após 40 dias da inoculação, cortaram-se o rizoma as mudas para avaliar a presença de pontuações pardo-avermelhadas. Realizaram o isolamento e a confirmação da presença de F.oxysporum f. sp. cubense nos tecidos sintomáticos.

Para a obtenção do DNA do fungo, os isolados monospóricos foram multiplicados em placas de Petri contendo meio SNA (1g KH₂PO₄, 1g KNO₃, 0,5 g MgSO₄.7H₂O, 0,5 g KCl, 0,2 g Glicose, 0,2 g sacarose, 20 g Agar, 1L H₂O), e após sete dias, cinco discos de 5 mm de diâmetro foram retirados das bordas destas colônias e transferidos para erlemeyer contendo 40 mL do meio extrato de malte (20 g de extrato de malte, 20 g ágar, 1 L H₂O), e mantidos durante 72 horas em B.O.D a 25ºC e fotoperíodo de 12 horas. Por meio de filtração em gaze, o micélio foi coletado e iniciada a extração do DNA do fungo de acordo com a metodologia proposta por Roeder e Broda (1987).

Para a análise de RAPD, as reações de amplificação seguiram a metodologia proposta por Williams et al. (1990). Foi utilizado um volume final por reação de 25 µL contendo tampão 10X Tris/HCl 10mM/KCl 50mM, MgCl₂ 2mM, 100µM de cada desoxinucleotídeo (dATP, dTTP, dGTP, e dCTP), 2,5µM de primer, 1 unidade de Taq DNA Polimerase, 30ng de DNA genômico de cada isolado. As amplificações foram realizadas em termociclador Eppendorf, modelo Biocycler, sob as seguintes condições: um ciclo a 94ºC/3 minutos; 40 ciclos de 94ºC/15 segundos, 35ºC/30 segundos e 72ºC/1 minuto; ao final desses, um ciclo a 72ºC por 7 minutos e logo após foi mantido a 4ºC.

Os primers utilizados foram oligonucleotídeos obtidos do KIT OPERON LIFE: OPA10, OPB10, OPC07, OPC14, OPD04, OPD13,OPF10, OPG05, OPG16, OPH11, OPH18, OPI09 e OPI12 (Tabela 2).

Os produtos resultantes das amplificações foram separados por eletroforese em gel de agarose a 1,2%, a 100 V, em tampão TBE 1X, por duas horas e quarenta minutos, e corados em solução de brometo de etídeo a 0,2 mg/L, por 20 minutos. Os fragmentos amplificados foram visualizados sob luz ultravioleta e fotografados em sistema digital UVP Life Science Software.

Uma matriz de dados envolvendo todos os isolados, atribuindo-se valor igual a 1, se banda homóloga estivesse presente, e 0, caso contrário, foi utilizada para o cálculo da dissimilaridade através do coeficiente de similaridade de Nei e Li, entre pares de genótipos, obtidos pela expressão D_i,i'= 1 - S_i,i' = 1 - 2a/(2a + b + c), onde D_i,i: Dissimilaridade entre os isolados x e y; S_ii': similaridade entre os isolados x e y; a: valor que quantifica o número de coincidências do tipo 1-1; b: valor que quantifica o número de coincidências do tipo 1-0; c: valor que quantifica o número de coincidências do tipo 0-1) (CRUZ; CARNEIRO, 2003). Todos os cálculos de dissimilaridades e construção do dendrograma (pelo método de agrupamento UPGMA – Unweighted Pair-Group Method with Arithmetic Averages) foram efetuados com auxílio do programa computacional GENES (CRUZ, 2001).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Todos os isolados utilizados foram patogênicos para a cultivar Maçã, e após a constatação de sintomas no rizoma, a presença do patógeno foi confirmada pelo reisolamento e avaliação das suas características.

Foram utilizados 13 primers para a análise de polimorfismo dos 36 isolados. A partir da amplificação desses primers, obtiveram-se 178 produtos de amplificação (bandas) (Tabela 2), sendo que 167 (93,82%) apresentaram polimorfismo entre, pelo menos, dois isolados e apenas 11 (6,18%) apresentaram monomorfismo, demonstrando alta variabilidade entre os isolados (Figura 1). Esses valores foram similares aos obtidos por Martins (2005) que, ao realizar análise de polimorfismo em DNA de Fusarium spp., utilizando 14 primers RAPD, observou um total de 166 bandas, sendo 6,1% monomórficas e 93,9% polimórficas. Nozaki (2003) não obteve nenhuma banda monomórfica e 72 bandas polimórficas ao analisar os produtos de amplificação de 7 primers RAPD em diferentes isolados de Fusarium sp.. Silva (2009), trabalhando com 66 isolados de F. oxysporum f. sp. cubense coletados em regiões produtoras de Santa Catarina, obteve 99 fragmentos gerados por 10 primers RAPD, sendo 81 bandas polimórficas.

A análise do padrão de bandas de cada primer permitiu a construção de uma matriz binária que foi usada para calcular os valores de dissimilaridade (distância genética) pelo coeficiente de Nei e Li. As distâncias genéticas variaram de 5,7 a 54,6%, sendo a distância média de 30,2% e a distância média relativa de 55,3%. A maior distância (54,6%) ocorreu entre o isolado 90 proveniente do município de Nova Porteirinha e 128 provenientes de Janaúba, e a menor (5,7%) entre os isolados 5 e 106 provenientes de Matias Cardoso e Janaúba, respectivamente. Martins (2005), trabalhando com isolados patogênicos e não patogênicos de Fusarium spp., observou níveis de similaridade entre 10,2 e 100%, segundo o coeficiente de Jaccard. No trabalho de Silva (2009), foi obtido variabilidade considerável com estimativas de similaridade que variaram de 35 a 98%, entre isolados de F. oxysporum f. sp. cubense.

De posse das distâncias genéticas, foi realizada uma análise de agrupamento pelo Método da Ligação Média entre Grupo (UPGMA), com a obtenção do dendrograma (Figura 2). A partir da distância média relativa (55,3%), determinou-se um ponto de corte, que permitiu a formação de 13 grupos.

Por meio do uso de marcador RAPD, foi possível constatar alta variabilidade genética entre os isolados de tecido e de solos, porém ausência de relação entre a diversidade genética observada com origens geográficas e tipo de material. Os isolados de todos os municípios foram distribuídos em diferentes grupos, mostrando alta variabilidade entre eles, que pode ser atribuído aos processos de disseminação desse patógeno.

Resultados similares foram obtidos por Martins (2005), os quais relataram a grande variabilidade genética entre os isolados de Fusarium spp. obtidos de um mesmo hospedeiro e de hospedeiros diferentes, não sendo possível fazer qualquer associação em relação à especificidade ao hospedeiro, patogênese e de padrão RAPD, haja vista que seus materiais ficaram dispersos no dendrograma. Os 66 isolados de F. oxysporum f. sp. cubense coletados de diferentes regiões produtoras de Santa Catarina foram agrupados em cinco grupos distintos, não havendo associação dos agrupamentos com origens geográficas e características morfológicas da colônia, visto que os isolados foram distribuídos indistintamente nos grupos. Gherbawy (1999) utilizou marcadores RAPD para analisar a diversidade genética entre 20 isolados de 14 formae speciales de F. oxysporum. Os isolados foram alocados em três grupos, que não apresentaram correlação com a origem geográfica. Na Índia, Sivaramakrishnan et al. (2002), ao analisarem a variabilidade de 43 isolados de F. oxysporum f. sp. ciceri, coletados de nove estados, por meio de marcadores RAPD, observaram a existência de três diferentes grupos, sendo que dois destes representaram as raças 1 e 2, e o terceiro foi formado pelas raças 3 e 4. Os marcadores moleculares mostraram que as raças 1 e 2 apresentaram grande diversidade quando comparadas com as raças 3 e 4. Foi detectado, também, um grande nível de variabilidade genética entre e dentro das raças de F. oxysporum f. sp. ciceri. Bentley et al. (1995), utilizando RAPD, concluíram que os isolados de F. oxysporum f. sp. cubense são geralmente VCG específico e sem nenhuma correlação entre a localização e a cultivar de bananeira. Sugeriram ainda que esta variação genética poderia ser devido à adaptação e coevolução do fungo com o hospedeiro e com os fatores ambientais do local. Leong et al. (2009), caracterizando isolados de F. oxysporum f. sp. cubense coletados em diferentes cultivares de bananeira da Malásia e Indonésia, utilizando PCR-RFLP de regiões de IST+5.8S e ERIC-PCR, obtiveram similaridade variando de 42,9 a 100%. Os isolados foram intimamente relacionados independentemente da cultivar de bananeira e localização.

Embora o mal-do-Panamá seja uma das principais enfermidades associadas à cultura da bananeira, estudos acerca da variabilidade genética de F.oxysporum f. sp. cubense na região do norte de Minas Gerais são inexistentes, sendo este o primeiro relato.

CONCLUSÃO

O uso do marcador molecular RAPD permite detectar grande variabilidade genética entre os isolados de F. oxysporum f. sp. cubense coletados no norte de Minas Gerais.

Recebido em: 08-06-2010. Aceito para publicação em: 10-12-2010.

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1

(Trabalho 144-10). Trabalho de Monografia de Conclusão do Curso de Graduação em Agronomia, Cx. Postal 91, UNIMONTES,39440-000 Janaúba-MG. Apoio: Fapemig.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  25 Jul 2011
• Data do Fascículo
  Jun 2011

Histórico

• Aceito
  10 Dez 2010
• Recebido
  08 Jun 2010