Crescimento in vitro de fungos (Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides) isolados de frutos do mamoeiro, sob atmosfera controlada e refrigeração

In vitro growth of Colletotrichum gloeosporioides and Cladosporium cladospodioides under controlled atmosphere and refrigeration

DEFESA FITOSSANITÁRIA

Crescimento in vitro de fungos (Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides) isolados de frutos do mamoeiro, sob atmosfera controlada e refrigeração¹

In vitro growth of Colletotrichum gloeosporioides and Cladosporium cladospodioides under controlled atmosphere and refrigeration

Daniela Gouveia Vieira^I; Roberta Manhães da Silva^I; Otniel Freitas Silva^II; Marcos José de Oliveira Fonseca^II; Antônio Gomes Soares^II; Roberto Alexandre Costa^III

^IBolsista CNPq - Av. das Américas, 29.501 – Guaratiba – Rio de Janeiro - RJ – CEP 23020-470

^IIEmbrapa Agroindústria de Alimentos, Av. das Américas, 29.501 – Guaratiba – Rio de Janeiro - RJ – CEP 23020-470. [e-mail], [e-mail], [e-mail]

^IIIEngenheiro Agronomo, MSc, Bolsista da Fundação Oswaldo Cruz, Instituto de Tecnologia em Fármacos - Far-Manguinhos/FIOCRUZ, Departamento de Química de Produtos Naturais, Rio de Janeiro, RJ.; [e-mail]

RESUMO

O uso combinado das tecnologias de atmosfera controlada e de refrigeração, em frutas tropicais, não apresenta ainda resultados satisfatórios, talvez pela suscetibilidade à injúria por frio, agravada nas condições de controle atmosférico. Como há indícios de que a atmosfera controlada tem efeito fungistático, este trabalho foi elaborado para se verificar, in vitro, sua influência sobre dois fungos fitopatogênicos do mamão: Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides, sob refrigeração. Colônias destes fungos foram submetidas a duas temperaturas de armazenamento (10 e 25º C), a duas atmosferas (ambiente e controlada com 3% O₂ e 6% CO₂) e por dois períodos (7 ou 14 dias). Após este armazenamento, as placas foram incubadas a 25º C sob atmosfera ambiente, por mais sete dias. Foi verificado menor crescimento da colônia de Colletotrichum gloeosporioides sob refrigeração, em relação ao armazenamento a 25º C, inclusive após o período adicional a 25º C, independentemente da atmosfera de armazenamento. Não se verificou efeito inibitório significativo da atmosfera controlada a 10º C, sobre o crescimento de Colletotrichum gloeosporioides. O crescimento deste fungo somente foi reduzido quando armazenado sob atmosfera controlada a 25º C, em relação ao armazenamento em atmosfera normal. O crescimento do fungo Cladosporium cladosporioides foi reduzido a 10º C, em relação ao armazenamento a 25º C, em ambos os períodos de armazenamento, independentemente da atmosfera de armazenamento. Após sete dias a 25º C, o crescimento de Cladosporium cladosporioides foi menor nas placas que foram armazenadas por 14 dias a 10º C, pela influência da refrigeração e de um possível efeito residual da atmosfera controlada deletério ao crescimento da colônia. A atmosfera controlada reduziu o crescimento da colônia de C. cladosporioides, a 25º C, em relação à atmosfera normal.

Termos para indexação: colônia de fungo, atmosfera controlada, Carica papaya, Colletotrichum gloeosporioides, Cladosporium cladosporioides

ABSTRACT

The use of these combined technologies in tropical fruits does not present satisfactory results yet, most of the time because of the fruits injury by chilling. This injury could be intensified under atmospheric control conditions. There are evidences that the controlled atmosphere has fungistatic effect. Therefore, the objective of this work was verifying, in vitro, the influence of controlled atmosphere and temperature on the two pathogenic fungi from papaya fruit: Colletotrichum gloeosporioides and Cladosporium cladosporioides. These fungi had been storage under two temperatures, atmospheres and period of incubation patterns (10ºC and 25ºC; ambient and controlled - 3% O₂ and 6% CO₂; 7 or 14 days. After this period of storage, the contaminated plates had been incubated at 25ºC under environment atmosphere for seven days more. It was verified a small growth of Colletotrichum gloeosporioides under refrigeration, also after additional period at 25ºC. At 25º C, the growth of this fungus was also reduced when stored under controlled atmosphere. On the other hand, it was not verified significant inhibitor effect of the controlled atmosphere at 10ºC on the growth of C. gloeosporioides. The growth of Cladosporium cladosporioides was reduced at 10ºC in both periods of storage. After seven days at 25ºC, C. cladosporioides showed a small growth in the plates that had been stored for 14 days, because the influence of the refrigeration and the controlled atmosphere. Finally, the controlled atmosphere reduced the growth of the C. cladosporioides at 25ºC. This effect was not observed at 10ºC for C. gloeosporioides.

Index terms: controlled atmosphere, Carica papaya, Colletotrichum gloeosporioides, Cladosporium cladosporioides

INTRODUÇÃO

A contaminação fúngica em mamão é uma das causas de perdas pós-colheita e pode ser causada por várias espécies que colonizam os tecidos e causam perdas significativas, destacam-se, entre outros, Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides (Peres et al., 2003). Colletotrichum gloeosporioides é o principal agente causador de perdas em pós-colheita de mamão, seja na forma de podridão peduncular, seja na forma de antracnose na casca, alcançando, até, a polpa do fruto (Nery-Silva, 1999). Cladosporium cladosporioides pode ser isolado do ar, solo, frutas estocadas, grãos, gêneros alimentícios, entre outros. A temperatura ótima para seu crescimento varia de 18ºC a 28ºC, porém apresenta também bom crescimento entre as temperaturas máximas 28ºC – 32ºC e mínima de - 6ºC (Snowdon, 1991).

A atmosfera controlada (AC) é definida como o armazenamento realizado sob condições de composição da atmosfera conhecida e diferente daquela presente na atmosfera do ar normal (Lana, 2000). Normalmente, a AC é associada à refrigeração para otimizar seu efeito. Os efeitos das altas concentrações de CO₂ e baixas de O₂ sobre a respiração e o amadurecimento são aditivos. No entanto, níveis de CO₂ acima do limite de tolerância podem causar injúria, e níveis de O₂, abaixo do limite de tolerância, podem induzir a respiração anaeróbia. A manutenção de, no mínimo, 1-3% de O₂ é necessária para evitar mudanças de respiração aeróbia para anaeróbia, o que mudaria a rota glicolítica: o ácido pirúvico deixa de ser oxidado, para ser descarboxilado a acetaldeído, CO₂ e etanol (Lana, 2000).

Wszelaki e Mitcham (2000) constataram que 15kPA de CO₂, associados ou não a 40kPa de O₂, foi o tratamento que promoveu maior supressão do crescimento de Botrytis cinerea in vitro, após 7 dias. Em todos os tratamentos, o crescimento do fungo aumentou ao se desfazer a condição de atmosfera controlada, indicando não haver efeito residual ou efeito fungicida. Yackel et al. (1971) verificaram sensibilidade diferenciada para 7 fungos causadores de doenças pós-colheita (Penicillium expansum, Aspergillus niger, Mucor hiemalis, Fusarium bulbigenum, Cladosporium herbarum, Rhizopus oryzae e Alternaria sp.), mas que esta seria relacionada à temperatura, sendo mais efetiva sob refrigeração e com tendência de redução do crescimento fúngico. O crescimento inicial de Cladosporium herbarum foi reduzido pelo armazenamento sob AC, e esta redução foi maior quanto menor a temperatura. Atualmente, este fungo é denominado Cladosporium cladosporioides. O objetivo do presente estudo foi comparar o crescimento in vitro dos fungos Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides (patógenos na fase de pós-colheita do mamão), durante o armazenamento sob atmosfera controlada, em condições de refrigeração e temperatura ambiente.

MATERIAL E MÉTODOS

Os experimentos foram realizados nos Laboratórios de Patologia Pós-colheita e Fisiologia Pós-colheita da Embrapa Agroindústria de Alimentos, Rio de Janeiro-RJ.

Na primeira etapa, os fungos Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides foram isolados de mamão infectado e transferidos para placas de Petri (60 X 15 mm) descartáveis, contendo meio Dicloran Rose Bengal Cloranfenicol Ágar (Ágar DRBC) e mantidos em câmaras a 25°C, por sete dias. Após o crescimento dos isolados, foram feitas repicagens consecutivas até a obtenção de culturas puras. Por meio de preparações em lâminas e observações ao microscópio, identificaram-se os organismos baseada em suas características morfológicas. Após o período de incubação de aproximadamente sete dias, discos com micélio de cada fungo (Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides) foram transferidos para placas de Petri de 150mm de diâmetro X 15 mm de altura (sendo um disco para cada placa) contendo Ágar DRBC; a tampa de cada placa foi levemente inclinada, para permitir que a atmosfera programada para cada microcâmara entrasse em contato direto com o fungo inoculado. O experimento foi montado, nas microcâmaras, em quatro tratamentos: atmosfera ambiente com pO₂ de 21%, pCO₂ de 0 %, a 10ºC; atmosfera ambiente com pO₂ de 21%, pCO₂ de 0 %, a 25°C; atmosfera controlada com pO₂ de 3 % e pCO₂ de 6 %, a 10°C e 4) atmosfera controlada com pO₂ de 3 % e pCO₂ de 6 %, a 25°C, em 5 replicatas de cada tratamento.

O crescimento radial do patógeno foi estebelecido mediante determinação do diâmetro da colônia, aos 7 e 14 dias. Após a avaliação inicial, as placas foram colocadas mais sete dias em temperatura e atmosfera ambientes, quando seus diâmetros foram novamente medidos, para verificação de algum possível efeito residual sobre o crescimento da colônia.

Foi adotado o delineamento inteiramente casualizado, com 5 replicatas, em esquema fatorial com 2 atmosferas, 2 temperaturas de armazenamento e 4 períodos de armazenamento (2x2x4). Foi realizada análise de variância e utilizado o teste de Tukey, a 5% de probabilidade.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

As análises de variâncias dos dados obtidos para os fungos Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides revelaram que as interações entre temperaturaXatmosferaXdata de avaliação e atmosferaXdata de avaliação foram não-significativas a 5% de probabilidade, pelo teste F. Assim, foram estudados para ambos os fungos os efeitos das interações entre atmosferaXtemperatura (p<0,01 e p<0,01) e temperaturaXdata de avaliação (p<0,01 e p<0,05, respectivamente) (Tabela 1).

1. Colletotrichum gloeosporioides

O crescimento da colônia de Colletotrichum gloeosporioides foi menor sob temperatura de armazenamento a 10ºC, durante 7 e 14 dias, em câmara fria (Tabela 2), continuando menor após o período posterior de sete dias, a 25º C, a que todas as placas foram submetidas, em relação às placas armazenadas a 25º C. Não houve diferença significativa para o crescimento da colônia de Colletotrichum gloeosporioides entre os períodos de permanência em câmara fria a 10°C (7 ou 14 dias), o que comprova a ação efetiva da temperatura na inibição de seu crescimento. Ao expor as placas à temperatura de 25º C por período adicional de sete dias, ocorreu intenso e significativo crescimento das colônias. Após 7 dias a 25º C, não houve diferença significativa do crescimento entre as placas anteriormente armazenadas por 7 ou 14 dias, a 10º C.

O crescimento da colônia, sete dias após o armazenamento, foi maior naquelas placas que haviam sido armazenadas previamente por sete dias, em relação àquelas armazenadas por 14 dias, independentemente da atmosfera de armazenamento (Tabela 2). Uma possível explicação é que, naquelas placas armazenadas por 14 dias e submetidas à atmosfera controlada, o crescimento possa ter sido menor. Isto não pode ser visualizado devido à interação temperatura e atmosfera ter sido não-significativa (Na Tabela 2, somente são apresentados os dados referentes à interação de temperatura e períodos de avaliação). Assim, após o armazenamento por 14 dias em atmosfera controlada, a 25º C, o crescimento da colônia de Colletotrichum gloeosporioides pode ter sido inibido pela restrição de oxigênio e aumento da concentração de dióxido de carbono, mesmo expondo-o, posteriormente, à atmosfera normal por sete dias. Nas placas armazenadas por sete dias, o efeito deletério da atmosfera controlada pode não ter sido tão extenso quanto seria por 14 dias. Vale ressaltar que esta especulação sobre o possível efeito da atmosfera controlada somente pode ser válida no armazenamento a 25º C, temperatura esta que não inibe o crescimento das colônias de C. gloeosporioides.

Seria também esperado que houvesse diâmetro de crescimento absoluto maior nas placas armazenadas por mais tempo (14 dias), em qualquer das temperaturas, seguido de mais 7 dias a 25º C. A possível explicação para este fato é que o armazenamento sob refrigeração reduziu o crescimento das colônias em maior magnitude, quanto maior for o período de exposição a esta condição de armazenamento.

Houve diferença significativa no crescimento das colônias de C. gloeosporioides, sob atmosfera ambiente e atmosfera controlada, a 25°C, ou seja, a atmosfera controlada, por si só, foi efetiva na inibição dos fungos que permaneceram nas câmaras, a 25ºC. O mesmo não foi observado a 10°C, indicando que o controle atmosférico não é eficiente sob armazenamento refrigerado (Tabela 3). O crescimento das colônias foi, estatisticamente, reduzido sob refrigeração, em ambas as atmosferas de conservação.

2. Cladosporium cladosporioides

Não houve diferença significativa para o crescimento das colônias de Cladosporium cladosporioides, entre os períodos de permanência (7 ou 14 dias) na câmara fria a 10°C. No entanto, observou-se maior crescimento nas placas armazenadas por 14 dias, a 25°C, em relação ao período de sete dias (Tabela 4), evidenciando que a refrigeração, por si só, inibiria parcialmente o crescimento das colônias do fungo Cladosporium cladosporioides.

O diâmetro das colônias de C. cladosporioides foi maior naquelas placas que haviam permanecido mais tempo sob refrigeração (14 dias a 10º C), após 7 dias, a 25º C (Tabela 4). Por outro lado, foi observado resultado inverso em armazenamento a 25º C. Após período adicional de sete dias, a 25º C, houve maior crescimento das colônias de C. cladosporioides armazenado por sete dias, a 25º C, em relação a 14 dias. A contradição encontrada, possivelmente, pode ser atribuída à influência da atmosfera controlada sobre o fungo, durante o período de armazenamento (7 ou 14 dias). No caso do armazenamento a 10º C, a atmosfera controlada não teria efeito sobre o crescimento micelial, devido à restrição ao crescimento imposto pela refrigeração. Assim, após a remoção da refrigeração, o fungo armazenado em qualquer período de tempo teria condições de crescer em temperatura normal. Entretanto, ao se armazenar o fungo a 25º C, a atmosfera ambiente influenciaria no crescimento da colônia, restringindo seu desenvolvimento posterior quanto maior fosse seu período de armazenamento, sob atmosfera controlada.

Houve menor crescimento das colônias que permaneceram a 10ºC, quando comparado com a temperatura de 25ºC, durante sete e 14 dias. Ao expor o fungo a 25º C, por mais 7 dias, observaram-se resultados contraditórios em função da extensão do período prévio de refrigeração. Naquelas placas que haviam permanecido por 7 dias a 10º C, após 7 dias a 25ºC (Tabela 4), o crescimento manteve-se menor. Contraditoriamente, foi verificado maior crescimento da colônia a 10º C, por 14 dias, após 7 dias a 25º C, em relação àquelas armazenadas pelos mesmos 14 dias a 25º C (Tabela 4).

Os diâmetros das colônias foram maiores a 25º C, em ambas as atmosferas de armazenamento (Tabela 5), confirmando que a refrigeração reduz o crescimento fúngico. Não houve diferença para crescimento micelial na temperatura de 10ºC, no que diz respeito à ação das atmosferas (Tabela 5). Observou-se menor crescimento das colônias de C. cladosporioides que foram submetidos à atmosfera controlada a 25ºC (Tabela 5). O efeito deletério da restrição atmosférica (já mencionada para C. gloeosporioides) sobre o crescimento das colônias de C. cladosporioides pode, assim, ser verificado. Isto significa que, em temperatura mais elevada, a atmosfera controlada mostrou-se efetiva para redução do desenvolvimento fúngico in vitro.

Pelas Tabelas 2 e 4, pode-se sugerir efeito fungistático, e não fungicida, da atmosfera controlada, pois houve crescimento após os períodos de armazenamento (7 e 14 dias). Não se pode inferir muito sobre esta questão, pois, nestas tabelas, são apresentados os efeitos gerais de temperatura e de data de avaliação, ou melhor, as médias das duas condições atmosféricas.

Fonseca et al. (2004) verificaram a incidência de algumas doenças em mamão, como: antracnose, podridão peduncular e mancha chocolate, durante o armazenamento sob atmosfera controlada contendo 6% de CO₂ à temperatura de 10ºC. Estes autores sugeriram que a elevação dos níveis de CO₂ pode ter promovido injúria fisiológica na casca dos frutos e a conseqüente manifestação das doenças citadas. Fonseca (2002) não verificou diferença na ocorrência de doenças em mamão produzido durante o inverno e armazenado sob atmosfera controlada contendo 3% de CO₂ e atmosfera normal, o que pode ser indício de que o frio estacional pode ter condicionado os frutos à tolerância ao frio.

Tian et al. (2005) verificaram o efeito benéfico da atmosfera controlada (5% O2 e 5% CO2) em relação à atmosfera modificada e atmosfera normal, no armazenamento a 3º C, o que contribuiu para a redução da deterioração e descoloração em lichia (Litchi chinensis Sonn.) cv. Heiye, uma fruta de clima subtropical. Babic & Watada (1996) verificaram que a atmosfera controlada reduziu o crescimento microbiano em espinafre minimamente processado em até 100 vezes, desde que esta hortaliça estivesse armazenada até 5º C por, no máximo, 7 dias.

Embora a combinação entre atmosfera controlada, tratamento hidrotérmico (63º C por 12s) e controle biológico (com a levedura Pichia guilliermondii Wickerham) tenha reduzido a deterioração por Botrytis cinerea Pers.:Fr. em morango após 5 dias, a 5º C, mais 2 dias a 20º C e após 14 dias a 5º C mais 2 dias a 20º C, Wszelaki & Mitcham (2003) não verificaram diferença significativa em relação ao uso de atmosfera controlada isoladamente. Desta forma, os autores concluíram que não houve controle superior ao tratamento comercial de 15% CO₂.

CONCLUSÕES

1) Foi verificada a redução do crescimento das colônias dos fungos Colletotrichum gloeosporioides e Cladosporium cladosporioides, no armazenamento a 25º C, submetidas a atmosfera controlada. Tal efeito não foi significativo na temperatura usual de refrigeração (10º C) para exportação do mamão pelos produtores brasileiros. Assim, o possível benefício da atmosfera controlada no controle de patógenos em pós-colheita do mamão in vitro, somente deverá ser visualizado em temperaturas de refrigeração acima de 10º C, que retardem o metabolismo do fruto e possibilitem que o controle da atmosfera exerça seu efeito fungistático.

2) Novos experimentos devem ser conduzidos para testar a eficiência da atmosfera controlada para os demais patógenos do mamão em pós-colheita, bem como a combinação desta tecnologia com temperaturas mais brandas de refrigeração, evitando-se um possível efeito sinergístico da temperatura e atmosfera controlada promevendo injúria por frio. Outro fator importante a ser estudado é a concentração de CO₂ ideal para evitar injúria fisiológica.

Recebido: 21-12-2005. Aceito para publicação: 20-10-2006.

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1

(Trabalho 210-2005).

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Mar 2007
• Data do Fascículo
  Dez 2006

Histórico

• Aceito
  20 Out 2006
• Recebido
  21 Dez 2005