Eficácia do extrato de Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg. (jabuticabeira) sobre bactérias orais

Effectiveness of the Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg. extract on oral bacteria

ARTIGO

Eficácia do extrato de Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg. (jabuticabeira) sobre bactérias orais

Effectiveness of the Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg. extract on oral bacteria

Maria R. Macedo-Costa^{I, *}; Denise N. Diniz^II; Carine M. Carvalho^III; Maria do Socorro V. Pereira^IV; Jozinete V. Pereira^II; Jane S. Higino^V

^IPós-graduação em Odontologia, Departamento de Odontologia, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, 59056 000 Natal-RN, Brasil

^IIDepartamento de Odontologia, Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, Universidade Estadual da Paraíba, 58100-000 Campina Grande-PB, Brasil

^IIIPós-graduação em Odontologia, Departamento de Clínicas e Odontologia Social, Universidade Federal da Paraíba, 58051-900 João Pessoa-PB, Brasil

^IVDepartamento de Biologia Molecular, Centro de Ciências Exatas e da Natureza, Universidade Federal da Paraíba, 58059-900 João Pessoa-PB, Brasil

^VDepartamento de Farmácia, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Pernambuco, 50740-521 Recife-PE, Brasil

RESUMO

O objetivo deste estudo foi avaliar a atividade antimicrobiana do extrato da folha de Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg., Myrtaceae (jabuticabeira) sobre: Streptococcus mitis (ATCC 903), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sanguinis (ATCC 15300), Streptococcus oralis (ATCC 10557), Streptococcus salivarius (ATCC 7073) e Lactobacillus casei (ATCC 9595). A pesquisa foi realizada através de técnicas bacteriológicas laboriosas. Os ensaios foram realizados pelo método da diluição em meio sólido para a determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM). Os resultados obtidos foram transferidos para um banco de dados informatizado e calculados os parâmetros estatísticos mediante o emprego do programa SPSS versão 13.0. Utilizou-se, ao nível de 5% de significância, o teste t-Student. Em estudo comparativo, foi determinada a CIM do digluconato de clorexidina a 0,12%. O extrato de jabuticabeira formou halos de inibição variando de 10 a 18 mm de diâmetro e apresentou desempenho médio significativamente inferior em relação a clorexidina, na comparação do extrato bruto vs substância pura e nas concentrações 1:2 e 1:4. Conclui-se, que o extrato de Myrciaria cauliflora produziu uma significante atividade bacteriostática in vitro sobre as bactérias do biofilme dental, o que sugere a utilização dessa substância como meio alternativo e economicamente viável para o controle de afecções em Odontologia.

Unitermos: Biofilme dental, fitoterapia, Lactobacillus, Streptococcus, Myrciaria cauliflora, Myrtaceae.

ABSTRACT

The aim of this study was to evaluate in vitro antimicrobial activity of Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg., Myrtaceae leaves extract on: Streptococcus mitis (ATCC 903), Streptococcus mutans (ATCC 25175), Streptococcus sanguinis (ATCC 15300), Streptococcus oralis (ATCC 10557), Streptococcus salivarius (ATCC 7073) and Lactobacillus casei (ATCC 9595). The study was done using laborious bacteriological techniques. The assays were made through dilution in agar diffusion method in order to reach the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) determination. The results obtained were transferred for database and had the statistics parameter calculated by SPSS program 13.0 version. The t-Student test was used with 5% of significance. In comparative study, the digluconate of chlorexidine (0,12%) was determinated. The leaf extract of Myrciaria cauliflora Berg. formed halos of inhibition oscillating between 10-18 mm of diameter and it showed middle performance significantly inferior in respect to digluconate of chlorexidine (0,12%), on the pure extract and in the concentrations 1:2 and 1:4. It follows that, the Myrciaria cauliflora Berg. extract produced a significative in vitro bactericidal activity on the former oral biofilm bacterias, that suggests the use of these substances as an economic and viable kind of alternative to the control of odontological diseases.

Keywords: Dental biofilm, Lactobacillus, phytotherapy, Streptococcus, Myrciaria cauliflora, Myrtaceae.

INTRODUÇÃO

A cárie dentária é reconhecida como uma doença infectocontagiosa, resultado de uma perda mineral localizada que reflete a atividade metabólica no interior do biofilme dentário. Dependendo de fatores tais como a dieta e a desorganização regular do biofilme, o tipo de microbiota predominante e sua harmonia com o hospedeiro pode variar. Quando a higiene bucal é deficiente e a utilização da sacarose é frequente, ocorre uma mudança ecológica do biofilme, podendo resultar na formação da lesão cariosa (Torres, 2000; Fejerskov & Kidd, 2005).

Frente às limitações dos métodos mecânicos de higiene, agentes antimicrobianos são propostos, com a finalidade de reduzir a adesão bacteriana, inibir o crescimento e proliferação dos microrganismos na superfície do dente e modificar a atividade bioquímica e a ecologia do biofilme dentário para uma microbiota menos patogênica (Ignacio et al., 1999). Dentre esses agentes, destaca-se a clorexidina, porém os seus efeitos colaterais não são poucos, podendo causar pigmentação dos dentes, interferência gustativa, descamação da mucosa e resistência de microrganismos quando do uso diário prolongado, além de possuir sabor amargo (Barros & Fiorini, 2000; Cury et al., 2000; Almeida et al., 2006).

Como alternativa, o estudo de compostos e extratos naturais tem sido realizado, visando à obtenção de agentes antimicrobianos que possibilitem a prevenção e tratamento de doenças bucais, com poucos efeitos colaterais indesejáveis e fácil acesso à população (Pereira, 2005; Botelho et al., 2007; Oliveira et al., 2007; Lustosa et al., 2008; Silva et al., 2008; Vasconcelos et al., 2008; Santos et al., 2009).

Nessa perspectiva, estudos in vitro sobre a ação anticariogênica de componentes extraídos de plantas têm sido relatados nas últimas décadas (Paolino & Kashket, 1985; Hattori et al., 1986; Sakanaka et al., 1989; Ooshima et al., 1993; Haslam, 1996; Kakiuchi et al., 1986; Yanagida et al., 2000; Pereira et al., 2005; Melo et al., 2006; Conde, 2006; Albuquerque, 2007).

A espécie Myrciaria cauliflora Berg., conhecida, popularmente, como jabuticaba paulista, jabuticaba assú (Ascheri et al., 2006) ou jabuticaba ponhem (Brunini et al., 2004), é uma planta nativa do Brasil, da Mata Atlântica, que vegeta diversos solos, podendo ser encontrada desde o Pará ao Rio Grande do Sul (Agra et al., 2007; 2008). Os estudos fitoquímicos da jabuticaba encontrados na literatura são poucos, estando reportada a presença de ácido ascórbico, taninos e glicosídeos cianidínicos e peonidínicos (Reynertson, 2006). Macedo-Costa (2008) observou resultados positivos do extrato do caule de Myrciaria cauliflora Berg.sobre cepas de Streptococcus mutans, Streptococcus mitis, Streptococcus sanguinis, Streptococcus oralis, Streptococcus salivarius e Lactobacillus casei.

Baseado neste contexto, torna-se de grande valia a realização deste estudo, para a avaliação da atividade antibacteriana do extrato vegetal de Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg. (jabuticabeira) no controle de microrganismos do biofilme dental, uma vez que um agente fitoterápico produz menos agressões ao organismo, é de baixo custo e, portanto, acessível a toda população.

MATERIAL E MÉTODOS

Foi estudada a folha da jabuticaba (Myrciaria cauliflora Berg.). O material botânico foi adquirido no Município de Arcoverde, Recife-PE. O extrato em questão foi preparado e identificado botanicamente no laboratório de Fitomedicamentos e Fitocosméticos na CECINE( Coordenadoria de Ensino de Ciências do Nordeste) ligada a PROEXT-UFPE. As folhas foram lavadas com água para separação da matéria-prima a ser utilizada na pesquisa que, em seguida, foi levada à secagem permanecendo, durante uma semana, em estufa a 33 °C para eliminação da umidade e estabilização do conteúdo enzimático. Posteriormente, o material foi retirado da estufa, triturado a pó em moinho elétrico. A extração ocorreu através da solução extratora de álcool metanol (a 80% v/v) renovado, constantemente, por um período de 24 horas, pelo qual se obteve um concentrado de 500 mL acondicionado em frasco âmbar, limpo, seco e estocado em câmara fria. A concentração da solução em nível de extrato fluido 1:1 (p/v) foi realizada em rotaevaporador (Modelo Ika-Werk) a uma temperatura constante de 45 °C.

As linhagens bacterianas de Streptococcus mitis ATCC 903, Streptococcus mutans ATCC 25175, Streptococcus sanguinis ATCC 15300, Streptococcus oralis ATCC 10557, Streptococcus salivarius ATCC 7073 e Lactobacillus casei ATCC 9595 utilizadas neste estudo foram obtidas mediante solicitação na Fundação Oswaldo Cruz (Rio de Janeiro-RJ), remetidas em Agar Sangue Inclinado ("slants"), e posteriormente reativadas no Laboratório de Genética de Microrganismos -Departamento de Biologia Molecular/CCEN/UFPB.

Para determinação, in vitro, da atividade antimicrobiana em placas e da Concentração Inibitória Mínima (CIM) do extrato, foi utilizado o método de difusão em meio sólido. O experimento foi realizado em duplicata para cada cepa ensaiada, sendo considerada como CIM a menor concentração do extrato capaz de ocasionar inibição completa de crescimento bacteriano. As linhagens bacterianas foram cultivadas em caldo nutritivo (BHI - Brain Heart Infusion - DIFCO) e incubadas a 37 °C, sob condições de microaerofilia, pela técnica da chama da vela por 18 a 20 horas. Perfurações de, aproximadamente, 6 mm de diâmetro foram realizadas no meio de cultura (Agar Mueller Hinton - DIFCO), com numerações que variavam de 1 a 10 onde foi depositado 50 µL das soluções do extrato diluído em água destilada (Extrato Bruto até 1:512). Posteriormente, as placas foram incubadas, em estufa bacteriológica a 37 °C, por um período de 24 horas. Decorrido o período de incubação, os diâmetros dos halos de inibição do desenvolvimento bacteriano foram mensurados, em milímetros, da borda do poço ao início do desenvolvimento. O mesmo procedimento foi utilizado para o controle positivo, o digluconato de clorexidina a 0,12% (Periogard^®, Colgate-Palmolive Company, Nova York, EUA.).

Os resultados obtidos no teste da Concentração Inibitória Mínima, foram coletados, organizados e apresentados em forma de tabelas com os seus respectivos valores das médias dos halos, indicando a inibição do crescimento bacteriano. Posteriormente, os resultados obtidos foram transferidos para um banco de dados informatizado e calculado os parâmetros estatísticos que incluíram valores das respectivas medidas descritivas mínimo, máximo, média e desvio padrão mediante o emprego do programa SPSS (Statistical Package for Social Sciences), versão 13.0. O nível de confiança utilizado para a obtenção dos intervalos foi de 95%. Utilizou-se, ao nível de 5% de significância, o teste t-Student (para duas amostras independentes) na comparação da inibição bacteriana mínima de cada extrato em relação ao digluconato de clorexidina a 0,12%. Para o seu uso, verificou-se inicialmente as premissas de normalidade e igualdade de variâncias, através dos seguintes testes: Kolmogorov-Smirnov (uma amostra) para normalidade e Levene para verificação da homogeneidade dos dados.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Neste estudo, o extrato hidroalcoólico das folhas de Myrciaria cauliflora Berg. obteve ação antimicrobiana positiva sobre linhagens de S. mitis, S. mutans, S. sanguinis, S. oralis, S. salivarius e L. casei.

Pode-se observar, que a ação antimicrobiana foi homogênea para as linhagens ensaiadas e a inibição do crescimento bacteriano diminuiu, conforme ocorreu a redução na concentração do extrato, sendo possível observar a formação de halos de inibição a partir do extrato bruto até a segunda diluição do extrato (1:4) (Tabela 1 e Figura 1).

Posteriormente aplicou-se o Teste t-Student (Tabela 5) comparando o extrato de folha da jabuticabeira e o digluconato de clorexidina a 0,12% (grupos independentes). Admitiu-se normalidade para a Concentração Inibitória Mínima do extrato considerado (verificada através do teste não-paramétrico de normalidade de Kolmogorov-Smirnov) e igualdade de variâncias populacionais (verificado através do teste de Levene) (Tabelas 3 e 4)

O extrato da folha de Myrciaria cauliflora formou halos de inibição que variaram de 10 a 18 mm. Todas as amostras apresentaram sensibilidade ao extrato da folha da jabuticabeira, mas as linhagens de S. mitis, S. mutans, S. sanguinis, S. salivarius e L. casei, apresentaram halos de inibição até a diluição 1:4, enquanto S. oralis até 1:2 (Tabela 1 e 2).

No presente estudo, os extratos ensaiados apresentaram atividade eficaz tanto em microrganismos que iniciam o processo de formação do biofilme dental como também nos que o consolidam, uma vez que os colonizadores iniciais constituem uma parte altamente seletiva da microbiota oral, que são os S. sanguinis, S. oralis e S. mitis, correspondendo a 95% da microbiota de Streptococcus. O L. casei por sua vez, aumenta a consistência do biofilme; e associado ao S. mutans contribui no processo de formação da cárie dentária (Fejerskov & Kidd, 2005).

Com relação aos ensaios da atividade antimicrobiana realizados com o digluconato de clorexidina a 0,12% (Tabela 2), todas as linhagens ensaiadas foram inibididas pela ação dessa substância, como esperado. As linhagens de S. oralis, S. salivarius e L. casei foram as mais sensíveis apresentando halo de inibição até a diluição 1:128; o padrão de sensibilidade é seguido por S. mutans e S. sanguinis, com halo de inibição até a diluição 1:32. O S. mitis, apresentou halo de inibição até a diluição 1:16.

Esses resultados divergem de Conde (2006) e Albuquerque (2007) que relataram a atividade antimicrobiana do gluconato de clorexidina a 0,12% apenas até a diluição 1:8 frente a Streptococcus mutans, S. mitis, S. sanguinis e L. casei. Há de se considerar que os resultados de ensaios microbiológicos podem apresentar diferenças a depender do tipo de cepa microbiana utilizada no estudo bem como das substâncias testadas (Haraldson, 2005).

Apesar de todas as linhagens demonstrarem ser susceptíveis ao extrato da folha da jabuticabeira, conforme resultados do Teste t-Student aplicado o digluconato de clorexidina a 0,12% obteve desempenho médio superior e estatisticamente significante ao extrato hidroalcoólico da folha de Myrciaria cauliflora, quanto à Concentração Inibitória Mínima (CIM), na comparação do EB vs SP e nas concentrações 1: 2 e 1: 4 (Tabelas 3, 4 e 5).

Souza (2007), avaliou a atividade antimicrobiana do extrato de folhas de Myrciaria cauliflora pela determinação da Concentração Inibitória Mínima e Concentração Bactericida Mínima. Os extratos polares das folhas de M. cauliflora demonstraram atividade leve, e o extrato clorofórmico das folhas de M. cauliflora, ausência de atividade. Os extratos polares de M. cauliflora mostraram-se fungistáticos contra Candida albicans e C. parapsilosis e fungicidas para C. tropicalis, porém o extrato clorofórmico não mostrou atividade contra as espécies de Candida ensaiadas.

Macedo-Costa (2008) avaliou a CIM do extrato do caule de Myrciaria cauliflora frente a bactérias do biofilme dentário. Verificou-se a formação de halos de inibição que também variaram de 10 a 18 mm, no entanto a atividade inibitória foi constatada até a terceira diluição do extrato (1:8). Foi observado resultado destacado frente a S. mitis, S. oralis e S. salivarius. O caule da jabuticabeira apresentou adesempenho médio significativamente inferior em relação gluconato de clorexidina a 0,12% no EB vs SP e nas concentrações 1:2 , 1:4 e 1:8.

Diniz (2008) avaliou a CIM em meio sólido da folha da Jabuticabeira frente a Candida albicans, C. krusei e C. guillermondii. Foram observados halos de inibição com variação de 14 a 17 mm. Para C. guilliermondii não foi verificado a formação de halos de inibição e atividade inibitória em nenhuma concentração considerada. Os resultados do teste t-Student mostraram que o digluconato de clorexidina a 0,12% apresentou desempenho superior e estatisticamente significante em relação ao extrato da folha da jabuticabeira, na concentração 1:2. Comparando a inibição entre o extrato bruto (jabuticabeira) e a substância pura (clorexidina), a clorexidina apresentou desempenho superior, porém não foi significante.

Os estudos fitoquímicos da jabuticabeira encontrados na literatura relatam a presença de ácido ascórbico, taninos e glicosídeos cianidínicos e peonidínicos (Reynertson et al., 2006). Estudo prévio, ainda não publicado, indicou que as folhas de Myrciaria cauliflora apresentam um alto teor de compostos fenólicos orientando a avaliação da atividade antimicrobiana desta droga vegetal, visto, inclusive, sua ampla disponibilidade pelo território nacional (Souza, 2007).

São raros relatos na literatura sobre a atividade inibitória de Myrciaria cauliflora (Mart.) O. Berg. sobre microrganismos do biofilme dental, o que mostra a importância da realização deste estudo, como também sugere a avaliação da atividade antimicrobiana de outros extratos de plantas.

Os dados obtidos demonstram a eficácia do extrato estudado quando comparado aos obtidos pela clorexidina, mostrando a potencialidade dessas substâncias como agentes antimicrobianos eficazes sobre os microrganismos do biofilme dental, sugerindo a possibilidade do uso do extrato em concentrações que atinjam a CIM na cavidade bucal.

Received 1^st October 2007; Accepted 29 November 2008

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  24 Nov 2009
• Data do Fascículo
  Jun 2009

Histórico

• Recebido
  01 Nov 2007
• Aceito
  29 Nov 2009