Frequência do Papilomavírus Humano na placenta, no colostro e no sangue do cordão umbilical

Frequency of Human Papillomavirus in the placenta, in the colostrum and in the umbilical cord blood

Resumos

OBJETIVO:

Determinar a frequência do Papilomavírus Humano (HPV) na placenta, no colostro e no sangue do cordão umbilical de parturientes e seus neonatos atendidos no Ambulatório de Ginecologia e Obstetrícia do Hospital Universitário de Rio Grande (RS), Brasil.

MÉTODOS:

Foram coletadas biópsias de 150 placentas do lado materno, 150 do lado fetal, 138 amostras do sangue do cordão umbilical e 118 amostras de colostro. As biópsias de placenta foram coletadas da porção central e periférica. O DNA foi extraído segundo protocolo do fabricante e conforme referência encontrada na literatura. O HPV foi detectado pela técnica da reação em cadeia da polimerase aninhada (PCR-Nested) com os primers MY09/11 e GP5/GP6. A genotipagem foi por sequenciamento direto. As participantes responderam a um questionário autoaplicado com dados demográficos e clínicos, a fim de caracterizar a amostra.

RESULTADOS:

O HPV foi detectado em 4% (6/150) do lado materno das placentas, 3,3% (5/150) do lado fetal; 2,2% (3/138) no sangue do cordão e 0,8% (1/118) no colostro. A taxa de transmissão vertical foi de 50%. O genótipo de baixo risco oncogênico encontrado foi o HPV-6 (60%) e de alto risco, os HPV-16 e HPV-18 (20% cada).

CONCLUSÕES:

Esses resultados sugerem que o HPV pode infectar a placenta, o colostro e o sangue do cordão umbilical.

Genótipo; Biologia molecular; Transmissão vertical de doença infecciosa; Doenças sexualmente transmissíveis

PURPOSE:

To determine the frequency of Human Papillomavirus (HPV) in the placenta, in the colostrum and in the umbilical cord blood of parturient women and their newborns assisted at the Clinic of Gynecology and Obstetrics of the University Hospital of Rio Grande (RS), Brazil.

METHODS:

Biopsies were collected from 150 placentas on the maternal side, 150 on the fetal side, 138 samples of umbilical cord blood and 118 of the colostrum. The placenta biopsies were collected from the central and peripheral portions. DNA was extracted according to the manufacturer's protocol and to a reference found in the literature. HPV was detected by the nested polymerase chain reaction (PCR-Nested) using primers MY09/11 and GP5/GP6. Genotyping was performed by direct sequencing. The participants responded to a self-applied questionnaire with demographic and clinical data, in order to characterize the sample.

RESULTS:

HPV was detected in 4% (6/150) of cases on the mother's side of the placentas, in 3.3% (5/150) on the fetal side, in 2.2% (3/138) in umbilical cord blood and in 0.84% (1/118) in colostrum samples. The vertical transmission rate was 50%. HPV-6 was the low-risk genotype found (60%) and the high-risk genotypes were HPV-16 and HPV-18 (20% each).

CONCLUSIONS:

These results suggest that HPV can infect the placenta, the colostrum and the umbilical cord blood.

Genotype; Molecular biology; Infectious disease transmission, vertical; Sexually transmitted diseases

Introdução

A infecção pelo Papilomavírus Humano (HPV) é a doença sexualmente transmissível viral mais frequente no mundo, sendo que, para o Brasil, são estimados 685.400 novos casos de HPV anualmente¹. Esse vírus mucosotrópico infecta células epiteliais e está relacionado ao desenvolvimento de verrugas genitais, do câncer de colo do útero, do câncer de cabeça e pescoço, do câncer anal e da papilomatose respiratória recorrente (PRR)^{2 , 3}. Os HPVs são classificados em baixo risco oncogênico, associados com as verrugas genitais e a PRR, ou em alto risco oncogênico, associados com os cânceres⁴.

Além da transmissão sexual, o HPV pode ser transmitido verticalmente. Essa transmissão pode ser pela via ascendente de contaminação, pela via hematogênica através da placenta ou durante a passagem do neonato pelo canal do parto⁵. A PRR é a doença resultante da transmissão vertical dos genótipos de baixo risco HPV-6 e HPV-11 e é caracterizada pelo crescimento de múltiplas lesões exofíticas na laringe, podendo ocorrer ao longo de todo aparelho respiratório^{6 , 7}.

Estudos relataram que o HPV pode infectar a placenta humana^{8 - 11}, o sangue do cordão umbilical^{10 , 11} e o colostro ou leite materno^{12 , 13}. No entanto, ainda não há um consenso na literatura sobre a transmissão materno-infantil do HPV¹⁰. Dessa forma, estudos sobre esse tema são essenciais para elucidar a ocorrência e a história natural da transmissão vertical do HPV, a fim de que medidas preventivas sejam otimizadas. Dentro desse contexto, o objetivo do presente estudo foi determinar a frequência do HPV na placenta, no colostro e no sangue do cordão umbilical.

Métodos

Este estudo transversal descritivo exploratório foi realizado no Hospital Universitário da cidade do Rio Grande - Hospital Dr. Miguel Riet Corrêa Jr. da Universidade Federal do Rio Grande (FURG) entre os meses de agosto de 2011 e junho de 2012. A amostragem foi de conveniência, sendo selecionada de forma sequencial ao atendimento. Foram excluídas as mulheres que apresentaram deficiência mental. As gestações múltiplas com placentas isoladas foram analisadas independentemente.

Imediatamente após o parto, 4 mL do sangue arterial do cordão umbilical foram coletados e armazenados em tubos com EDTA. As biópsias da porção central e periférica da placenta, tanto no lado materno quanto no lado fetal, foram coletadas e armazenadas em tubos contendo solução tampão T.E. (Tris-HCl 10 mM pH 8,0; EDTA 1 mM)¹⁰. O colostro foi coletado entre 24 e 48 horas após o parto e foi acondicionado em tubos cônicos estéreis. Com a finalidade de evitar contaminações, as amostras de colostro foram transferidas para tubos de microcentrífuga, sendo posteriormente centrifugadas a 2.000 rpm durante 10 minutos. O soro do colostro e a gordura foram removidos e o sedimento foi ressuspendido com a solução tampão T.E.¹⁴.

Todas as amostras foram armazenadas a -20ºC até a extração do DNA, que foi realizada a partir do kit comercial PureLink^(r) Genomic DNA Mini Kit¹⁵. A extração do sangue do cordão umbilical e do colostro foi realizada segundo o protocolo de extração de células sanguíneas¹⁵.O DNA da biópsia da placenta foi extraído segundo protocolo do fabricante com modificação previamente descrita na literatura¹⁶. Para a digestão proteica das biópsias de placenta, as amostras foram submetidas a 55ºC durante 12 horas em vez de 10 minutos a 55ºC, como consta no protocolo do kit. O DNA proveniente das extrações foi armazenado a -20ºC¹⁵.

Para garantir a viabilidade do DNA, foi amplificado um fragmento de 222 pb para o receptor de quimiocina humano CCR2 pela técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando os primers senso 5'TTGTGGGCAACATGATGG3' e anti senso 5'TGAAGAAGATTCCGCCAAAA3'¹⁷. O mix teve o volume final de 50 μL, sendo constituído por 1,25 U da enzima Taq DNA polimerase; primers na concentração de 25 pmol/μL cada; 0,5 mM de MgCl₂; 0,2 mMol de DNTP; tampão da enzima taq 1x e H₂O MiliQ. A PCR foi realizada no termociclador PTC150 MinicyclerTM termocycler (MJ Research Inc., Waltham, MA, USA). A ciclagem foi: 95ºC por 10 minutos, seguido de 38 ciclos subsequentes de 95ºC por 30 segundos para desnaturação, 57ºC por 30 segundos para anelamento e 72ºC por 1 minuto para extensão. A extensão final foi de 10 minutos a 72ºC¹⁷. Para controle positivo, foi utilizada uma amostra de sangue total com DNA extraído segundo as orientações do fabricante.

Para determinação do Papilomavírus, foi realizada uma PCR aninhada (Nested). O primeiro "round" foi realizado com os primers externos MY09/MY1: 5'CGTCCMAARGGAWACTGATC3' / 5'GCMCAGGGWCATAAYAATGG3'¹⁸, que geram um produto de 450 pb da região L1 do capsídeo viral. No segundo "round", foram utilizados os primers internos GP5/6: 5'TTTGTTACTCTGGTAGATAC3'/5'GAAAAATAAACTGTAAATCA3"¹⁸, que amplificam 150 pb também da região L1. As duas PCRs foram realizadas com um volume final de 50 μL, sendo constituído por 2,5 U da enzima Taq DNA polimerase; primers na concentração de 25 pmol/µL cada; 3,0 mM de MgCl₂; 0,20 mMol de DNTPs; tampão da enzima taq 1x, 50 mM de KCl, e H₂O Mili-Q. No primeiro round, foram utilizados 5 µL de DNA e, no segundo, 5 µL do produto da PCR MY. As condições no termociclador para o primeiro round foram constituídas pelas seguintes etapas: 94ºC por 5 minutos, para desnaturação inicial, seguindo de 40 ciclos subsequentes de 94ºC por 35 segundos para desnaturação, 55ºC por 45 segundos para anelamento e 72ºC por 45 segundos para amplificação, seguidos de 72ºC por 5 minutos para extensão final¹⁸. A PCR foi realizada no termociclador MJ research. Como controle positivo da reação, foi usado um fragmento de 450 pb correspondente ao DNA do HPV integrado às células SiHa. Para o controle negativo, foi realizada uma PCR com todos os reagentes, exceto o DNA.

Os resultados das extrações e das PCRs foram confirmados por eletroforese em gel de agarose 0,8% para extração do DNA; 1,0%, para PCR MY09/11; 1,5% para as PCRs do receptor CCR2 e 2% para a PCR GP. Os fragmentos foram visualizados por fluorescência UV por um sistema de fotodocumentação EDAS Kodak após ter sido banhado em brometo de etídio (10mg/mL), e o tamanho do fragmento gerado por PCR foi comparado com o marcador de peso molecular Leidwing Biotc^(r) Ladder 100 pb Plus.

A determinação dos genótipos do HPV foi realizada por sequenciamento do produto de PCR na Divisão de Genética do Instituto Nacional de Câncer (INCA) do Brasil. Os produtos de PCR foram purificados pelo kit Illustra(tm) GFX(tm) PCR DNA and Gel Band Purification (GE Health Care) conforme protocolo do fabricante¹⁹.Os produtos purificados foram sequenciados com o kit ABI Prism^(r)BigDye(tm) Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction (AppliedBiosystems^(r), Foster City, USA) conforme o protocolo do fabricante²⁰. O sequenciador automático utilizado foi o ABI 3130XL (Life Technologies). Foram utilizados os programas: SeqMan (Lasergene 9, DNASTAR Inc., Madison, USA) e CLUSTAL W - BioEdit para editar as sequências de nucleotídeos. Para a confirmação e identificação do tipo do HPV, foi realizada a comparação das sequências nucleotídicas das amostras sequenciadas, submetendo-as ao Banco de Dados Mundial de Nucleotídeos - Gene Bank, utilizando o programa BLAST.

Todos os dados foram revisados, codificados e duplamente digitados no software EpiData^(r)21. Os dados descritivos são apresentados no texto e em tabelas, na forma de frequência absoluta e relativa em percentual.

Este estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa na Área da Saúde (CEPAS) da FURG, número 54/2011. Participaram do estudo as mulheres que concordaram em assinar o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido. Este estudo está de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinki) para experimentos envolvendo seres humanos.

Resultados

Concordaram em participar do estudo 153 mulheres. Houve cinco gestações gemelares, sendo dois monozigóticos e três dizigóticos com placentas independentes e isoladas. Essas placentas isoladas foram analisadas separadamente, totalizando 156 placentas. Em seis amostras, não foi possível extrair o DNA do lado materno e/ou fetal, sendo consideradas como perda. Assim, foram analisadas 150 placentas. Em relação ao sangue do cordão umbilical e o colostro, foram coletados 138 e 118 amostras, respectivamente.

A maioria das participantes se autodeclararam brancas (61,2%), apresentavam um companheiro fixo (71,3%), tinham mais de 24 anos (50,4%), com mais de 9 anos de escolaridade (53,6%) e não eram tabagistas (85,3%). Em relação à renda, a maioria tinha entre 1 e 2 salários mínimos (34,4%) e 93,6% declararam não ter uma história prévia de infecção por uma DST (Tabela 1).

Tabela 1.
Características demográficas e epidemiológicas das parturientes atendidas no Hospital Universitário de Rio Grande em 2011 e 2012

Variáveis	Característica
	n	%
Cor
Branca	87	61,2
Não branca	55	38,8
Condição civil
Com companheiro	102	71,3
Sem companheiro	41	28,7
Idade (anos)
≥25	72	49,6
≤24	73	50,4
Nível de escolaridade (anos)
≥9	74	53,6
≤8	64	46,4
Renda*
Mais de dois salários mínimos	44	33,6
Entre um e dois salários mínimos	45	34,4
Menos que um salário mínimo	42	32,0
Tabagismo
Não	122	85,3
Sim	21	14,7
História prévia de DST
Não	133	93,6
Sim	9	6,4

• ^*
  Salário mínimo na época do estudo: R$ 700,00. DST: doença sexualmente transmissível.

O DNA do HPV foi detectado em 4% (6/150) do lado materno das placentas, em 3,3% (5/150) do lado fetal; em 2,2% (3/138) do sangue do cordão e em 0,84% (1/118) das amostras de colostro. Não houve diferença no resultado negativo de placentas provenientes de gêmeos.

Das seis amostras de placenta positiva para o HPV, o vírus foi detectado em todas do lado materno e em cinco do lado fetal. Essas seis mães positivas transmitiram o HPV para o sangue do cordão de três neonatos, sendo a taxa de transmissão vertical de 50%.

Os genótipos encontrados foram: 60% HPV-6 (3/5), 20% HPV-16 (1/5), 20% HPV-18 (1/5). Todas as amostras de uma paciente não foram determinadas devido à sobreposição de picos observadas no sequenciamento.

Discussão

As frequências do HPV na placenta e no sangue do cordão umbilical foram similares aos dados encontrados em estudos prévios^{9 , 10}. Outros estudos encontraram frequências entre 0¹¹ e 42%⁸. É importante salientar que esse último estudo com uma frequência elevada de HPV na placenta foi realizado em mulheres com citopatológico sugestivo de HPV. Estudos realizados com a população em geral observaram frequências menores que 4,5%^{9 - 11}. No presente estudo, foi pesquisado o HPV na placenta de mulheres da população em geral e o resultado do citopatológico não foi analisado em razão de as mulheres chegarem ao hospital apenas no momento do parto.

A transmissão do HPV através do aleitamento materno ainda não está estabelecida^{12 - 14}. Apesar da hipótese de que essa transmissão pode não ocorrer porque o HPV não provoca viremia¹³, já foi observado que o HPV encontrado no leite materno pode estar viável e infectante²². Estudar novas formas de transmissão do HPV como pelo banco de leite e pelo transplante de células totipotentes do cordão umbilical é importante na elaboração de medidas que interrompam a cadeia de transmissão.

O HPV-6 foi o genótipo mais frequente neste estudo. Isso está de acordo com os dados da literatura que mostram que esse genótipo está relacionado com a transmissão vertical^{6 , 7}. Os outros dois genótipos encontrados (HPV-16 e HPV-18) são descritos na literatura como os mais frequentes^{23 , 24}. Nas amostras de placenta e do sangue do cordão umbilical provenientes de uma parturiente, a determinação do genótipo não foi possível devido à sobreposição dos picos das sequências, o que indica a infecção por múltiplos genótipos²⁵. No entanto, como o objetivo do estudo foi determinar a frequência do HPV na placenta, no colostro e no sangue do cordão umbilical, este trabalho teve seu propósito alcançado com a metodologia utilizada.

Este estudo apresentou limitações. Os resultados não podem ser extrapolados para todas as mulheres grávidas e recém-nascidos porque este estudo utilizou uma amostragem de conveniência. Além disso, não foi possível coletar o sangue do cordão umbilical e o colostro de todas as 153 participantes devido às rotinas no centro obstétrico e às características dos pacientes e da placenta. O colostro não foi coletado em casos de natimortos, em pacientes HIV-1 positivos (devido ao procedimento para evitar a lactação nessas mulheres), no parto cesárea (em alguns casos, devido à baixa produção de colostro), quando os recém-nascidos estavam na unidade de terapia intensiva e quando a paciente se sentiu desconfortável durante a coleta. O sangue do cordão umbilical não foi coletado em natimortos (devido à má formação do cordão umbilical ou autólise do mesmo), em mulheres com fator Rh negativo (a coleta de sangue foi necessária para análise em laboratório), em casos com complicações no parto (o sangue foi drenado antes que pudesse ser coletado) e quando a placenta tinha uma coagulação rápida.

Este trabalho tem uma grande importância epidemiológica por ser o primeiro realizado na região. É possível sugerir que o HPV infecta a placenta e é capaz de ser transmitido para o sangue do cordão umbilical e para o colostro. A continuidade deste estudo é importante para aprofundar o conhecimento sobre a infecção do HPV na placenta, no colostro e no sangue do cordão umbilical ao longo do tempo, desde o pré-natal até o puerpério.

Agradecimentos

À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e à Universidade Federal do Rio Grande (FURG), pelo financiamento do estudo.

Aos integrantes do Projeto Placenta do Laboratório de Biologia Molecular da Faculdade de Medicina da FURG e aos funcionários do Centro Obstétrico do Hospital Universitário da FURG.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  Maio 2015

Histórico

• Recebido
  03 Fev 2015
• Aceito
  24 Mar 2015