Avaliação comparativa da atividade biológica de heparinas não-fracionadas em produtos farmacêuticos

Comparison of the biological activities of unfractionated heparins in pharmaceutical products

Resumos

Realizou-se a avaliação biológica de potência de heparinas convencionais contra o 5º Padrão Internacional de heparina suína pelos ensaios preconizados da inibição da coagulação do plasma ovino (ICPO), tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e anti-fator Xa. Correlacionaram-se os resultados, demonstrando que o ICPO fornece potências em média 10,72%, significativamente superiores aos outros procedimentos. Analisou-se a influência de diferentes lotes de plasma sobre o resultado do ensaio do ICPO observando-se variação de até 7,32%. Como alternativa, padronizou-se o ensaio do anti-fator IIa e efetuou-se a determinação de potência das amostras obtendo-se valores reprodutíveis, comparáveis ao método do anti-fator Xa, que demonstram a viabilidade da inclusão como ensaio harmonizado para o controle da qualidade. Os resultados de potência, fornecidos lote a lote, em geral, cumprem as especificações farmacopéicas e demonstram a qualidade que garante a segurança e eficácia clínica dos medicamentos.

Heparinas; plasma ovino; anti-fator Xa; tempo de tromboplastina parcial ativada; anticoagulante; anti-fator IIa

ARTIGO

Avaliação comparativa da atividade biológica de heparinas não-fracionadas em produtos farmacêuticos

Comparison of the biological activities of unfractionated heparins in pharmaceutical products

Silvana F. Vaccari; Liberato Brum Júnior; Silvia M. K. Masiero; Marcio Fronza; Sérgio L. Dalmora

Departamento de Farmácia Industrial, Centro de Ciências da Saúde, Universidade Federal de Santa Maria, Santa Maria-RS – Brasil

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Realizou-se a avaliação biológica de potência de heparinas convencionais contra o 5^o Padrão Internacional de heparina suína pelos ensaios preconizados da inibição da coagulação do plasma ovino (ICPO), tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e anti-fator Xa. Correlacionaram-se os resultados, demonstrando que o ICPO fornece potências em média 10,72%, significativamente superiores aos outros procedimentos. Analisou-se a influência de diferentes lotes de plasma sobre o resultado do ensaio do ICPO observando-se variação de até 7,32%. Como alternativa, padronizou-se o ensaio do anti-fator IIa e efetuou-se a determinação de potência das amostras obtendo-se valores reprodutíveis, comparáveis ao método do anti-fator Xa, que demonstram a viabilidade da inclusão como ensaio harmonizado para o controle da qualidade. Os resultados de potência, fornecidos lote a lote, em geral, cumprem as especificações farmacopéicas e demonstram a qualidade que garante a segurança e eficácia clínica dos medicamentos.

Palavras-chave: Heparinas; plasma ovino; anti-fator Xa; tempo de tromboplastina parcial ativada; anticoagulante; anti-fator IIa.

ABSTRACT

The biological evaluation of unfractionated heparins was carried out against the 5^th International Standard of porcine heparin using the pharmacopoeial-recommended assays: the sheep plasma coagulation inhibition assay (SPCIA), activated partial thromboplastin time (APTT) and anti-factor Xa activity. The SPCIA method gave mean potencies which were 10.72% significantly higher than the other procedures. The effect of differences in plasma batches revealed potency variations of up to 7.32%. The anti-factor IIa assay was standardized as an alternative method for the potency assessment of heparin samples. The values obtained were in good agreement with the anti-factor Xa assay results, demonstrating the feasibility of the method as a harmonized assay for the quality control of medicines. Analysis of the potency estimates showed that generally batch-to-batch variations complied with pharmacopoeial specifications, demonstrating the overall quality of the products and assuring their safety and clinical efficacy.

Key words: Heparins; sheep plasma; anti-factor Xa; activated partial thromboplastin time; anticoagulant; anti-factor IIa.

Introdução

As heparinas convencionais, não-fracionadas, são usadas clinicamente para profilaxia e tratamento de trombose venosa, devido às suas propriedades anticoagulantes. Recentemente foram desenvolvidas e encontram-se disponíveis as heparinas de baixo peso molecular com eficácia antitrombótica, menos complicações hemorrágicas e redução da freqüência de injeções.

Estruturalmente, as heparinas são glicosaminoglicanos sulfatados de peso molecular variável, compostos de unidades de glicosamina e ácido hexurônico, que se alternam unidas por ligações glicosídicas. O polímero apresenta micro-heterogeneidade estrutural devido à sulfatação e acetilação variáveis, bem como a distribuição das unidades de ácido hexurônico, mas a atividade biológica é semelhante.^1,2

A substância biológica usada na área farmacêutica pode ser extraída da mucosa intestial de bovinos e suínos, bem como de pulmões de bovinos.³ Durante o isolamento, as cadeias glicosaminoglicanas tornam-se levemente degradadas produzindo mistura heterogênea de fragmentos com massa molecular entre 3.000 e 30.000 Da. Foram encontradas diferenças de atividade específica entre as heparinas extraídas de pulmão e de mucosa intestinal analisadas pelo ensaio do anti-fator Xa.⁴ Recentemente, foram preparadas as heparinas de baixa massa molecular (HBMM) por despolimerização controlada das convencionais, obtendo-se produtos com massas moleculares entre 4.000 e 6.000 Da.^5,6

O mecanismo de ação das heparinas fundamenta-se na formação de complexo com a antitrombina III (AT III), com a qual tem elevada afinidade devido à seqüência pentassacarídica, que induz mudança conformacional e inativação do fator Xa e da trombina.^7,8 A heparina também se liga à trombina, fator IXa e fator Xa.^9-11 A neutralização do fator Xa (atividade anti-Xa) requer a presença do pentassacarídio (massa molecular~1.700 Da), enquanto a potenciação da inibição da trombina necessita cadeias de, no mínimo, 18 carboidratos (massa molecular~5.400 Da).^12,13

As modernas metodologias físico-químicas, tais como cromatografia líquida de alta eficiência, eletroforese capilar, ressonância magnética nuclear e espectrometria de massa, têm sido importantes para a análise estrutural e mecanismo de ação,² entretanto, para a avaliação de potência das heparinas convencionais são preconizados o ensaio da inibição da coagulação do plasma ovino (ICPO), o método do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) e o ensaio da atividade anti-fator Xa.^14-19 As leituras da reação final podem fundamentar-se nos graus, tempos de coagulação ou reação colorimétrica, e os ensaios são realizados contra o 5^o Padrão Internacional de heparina de mucosa intestinal suína. Os procedimentos foram adotados nos diferentes estudos colaborativos internacionais, porém, há direcionamento no sentido de desenvolver e validar uma metodologia harmonizada baseada na atividade específica dos produtos farmacêuticos atuais, como o ensaio do anti-fator IIa. A geração atual de heparinas tem massas moleculares médias mais elevadas e distribuição em faixa mais estreita, observada pela maior atividade específica, entre 180 e 210 UI/mg.^20-23

O presente trabalho teve por objetivos realizar a avaliação comparativa de potência de heparinas convencionais pelas metodologias preconizadas para o controle da qualidade e, ao mesmo tempo, correlacionar com o ensaio padronizado do anti-fator IIa, avaliado como alternativa harmonizada, contribuindo assim para aprimorar e assegurar a eficácia clínica desses medicamentos.

Material e métodos

Reagentes e produtos farmacêuticos

5^o Padrão Internacional de heparina de mucosa intestinal suína (WHO 97/578), contendo 2.031 UI/ampola. Fator Xa de plasma bovino “DIAGEN” (Diagnostic Reagents Ltda). Substratos cromogênicos S-2765 e S-2238 (Chromogenix). Fosfolipídio de cérebro de bovino (WHO 79/508). Antitrombina III humana (WHO 95/808). Trombina de plasma humano e Caolin (Sigma-Aldrich). Cloreto de cálcio e ácido acético glacial (Merck). Lotes de plasma, separados a partir da coleta de seis ovinos. Doze amostras de produtos farmacêuticos comerciais de heparina contendo, 5.000 UI/ml, provenientes de sete laboratórios e identificadas com números de 1 a 12, em seu prazo de validade.

Ensaio da inibição da coagulação do plasma ovino (ICPO)

Padronizou-se o método fundamentado na inibição da coagulação do plasma ovino.17,18,24 Determinou-se a concentração do padrão e da amostra que, na presença de 1 ml de plasma ovino e 0,2 ml de cloreto de cálcio 1%, permitiu o grau de coagulação 50%. Realizou-se a análise dos resultados experimentais pelo método das médias móveis.¹⁸

Ensaio do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA)

O método da determinação do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) foi padronizado conforme literatura.^19,25 Com base na região linear da curva dose-resposta elaborada com o 5^o Padrão Internacional de heparina suína, selecionaram-se três concentrações: 0,1, 0,2 e 0,4 UI/ml. Realizou-se o ensaio em tubos de polietileno colocados em coagulômetro a 37^oC. Incubaram-se 100 ml de plasma ovino e 100 ml da solução de heparina padrão ou amostra por, aproximadamente, 15 minutos. Após esse período adicionaram-se a cada tubo 100 ml da mistura reagente (caolin 4g/l e fosfolipídio 1/200, em volumes iguais) previamente ajustada de modo que o tempo de recalcificação obtido com o branco não excedesse sessenta segundos. Exatamente dois minutos após, adicionaram-se 100 ml da solução de CaCl2 25 mM e registrou-se o tempo de coagulação. Realizaram-se três ensaios independentes em duplicata.

Ensaio do anti-fator Xa

Padronizou-se o método14,18 e elaborou-se a curva dose-resposta, com o 5^o Padrão Internacional de heparina suína. Com base na região linear selecionaram-se as concentrações de 1,0, 2,0 e 4,0 UI/ml. Em tubos de ensaio adicionaram-se 100 ml de antitrombina III e 100 ml da solução padrão e amostra, respectivamente. Homogeneizou-se. Transferiram-se 25 ml da mistura respectiva para placas de 96 poços mantida a 37^oC, adicionaram-se 50 ml da solução de fator Xa bovino e registrou-se o tempo. Incubou-se por exatamente dois minutos e, então, adicionaram-se 100 ml da solução de substrato cromogênico S-2765. Interrompeu-se a reação, exatamente quatro minutos após, adicionando-se 100 ml da solução de ácido acético a 20%. Procedeu-se à leitura espectrofotométrica a 405 nm. Realizaram-se três ensaios independentes em duplicata.

Ensaio do anti-fator IIa

Padronizou-se o método^19,26 e elaborou-se a curva dose-resposta com o 5^o Padrão Internacional de heparina suína. Com base na região linear selecionaram-se as concentrações de 1,0, 2,0 e 4,0 UI/ml e executou-se o procedimento descrito no ensaio do anti-fator Xa, porém, utilizando-se 50 ml da solução de trombina e 100 ml da solução de substrato cromogênico S-2238.

Análise estatística de ensaios de retas paralelas

Os tempos de coagulação ou as absorbâncias determinadas nos ensaios para cada concentração da solução padrão e amostra foram submetidos à análise estatística de retas paralelas (3 x 3), calculando-se a variância, potência estimada, limites de confiança (P=0,95) e precisão, expressa pela ponderação, usando-se programa de computação SAS para Windows versão 6.11.

Resultados

Avaliação de potência pelo ensaio da inibição da coagulação do plasma ovino (ICPO)

Os graus de coagulação determinados nos ensaios das preparações farmacêuticas de heparina foram submetidos à análise estatística em relação ao 5^o Padrão Internacional de heparina suína, fornecendo os resultados de potência e limites de confiança (Tabela 1).

Foram também realizados ensaios de três lotes de heparina utilizando-se cinco diferentes lotes de substrato de plasma ovino. A Tabela 2 mostra os valores cujas médias calculadas são 102,60 ± 2,55, 99,52 ± 2,93 e 106,23 ± 2,82, respectivamente, com variação de até 7,32% das potências estimadas de cada amostra.

Estudou-se também a estabilidade da solução diluída de heparina com 50 UI/ml, conservada em geladeira, observando-se, após análises sucessivas pelo ensaio do ICPO, diminuição da atividade de 4% no 14^o dia, em relação ao teor inicial.

Avaliação de potência pelo ensaio do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA)

Os tempos de coagulação obtidos nas avaliações das preparações farmacêuticas em relação ao 5^o Padrão Internacional de heparina suína, foram submetidos ao cálculo estatístico que apresentaram os valores de potência, limites de confiança (P=0,95) e precisão (Tabela 3).

Avaliação de potência pelo ensaio do anti-fator Xa

Os valores de absorbância obtidos na análise dos produtos farmacêuticos em relação ao 5^o Padrão Internacional de heparina suína, pelo ensaio do anti-fator Xa, foram submetidos ao cálculo estatístico fornecendo os resultados de potência, limites de confiança (P=0,95) e precisão das estimativas (Tabela 4).

Avaliação de potência pelo ensaio do anti-fator IIa

Os valores de absorbância obtidos na avaliação dos produtos farmacêuticos em relação ao 5^o Padrão Internacional de heparina suína, pelo ensaio do anti-fator IIa cromogênico, usando antitrombina III, foram submetidos ao cálculo estatístico fornecendo os resultados de potência, limites de confiança (P=0,95) e precisão das estimativas (Tabela 5).

Os resultados obtidos nas avaliações de potência dos doze lotes de produtos farmacêuticos de heparinas pelas quatro diferentes metodologias, forneceram as médias de 104,62% ± 9,64 para o ICPO, 92,99% ± 11,36 para TTPA, 94,25% ± 11,74 para anti-fator Xa e 94,45% ± 11,85 para anti-fator IIa. A diferença foi significativa (p<0,05) somente para o ICPO em relação aos outros métodos.

Discussão

O método da inibição da coagulação do plasma ovino tem sido amplamente adotado e continua preconizado para a avaliação de potência de heparinas não-fracionadas em produtos farmacêuticos.^17,18 Recentemente foram desenvolvidas as heparinas fracionadas, de baixo peso molecular,²⁷ para as quais o procedimento não é reprodutível (dado não mostrado). Realizou-se a dosagem de potência de heparinas convencionais contra o 5^o Padrão Internacional de heparina suína obtendo-se resultados reprodutíveis, com média de intervalos de confiança de 0,024 ± 0,02, inferior ao limite de 0,20 estabelecido para realização de ensaios adicionais.¹⁸ Pode-se também observar (Tabela 1) que algumas amostras de produtos comerciais não cumpriram as especificações de potência para utilização clínica, que preconizam limites entre 90% e 110% em relação à declarada.^17,18 Há registros de que a expressão de unidades USP é 7,6% a 10,6% superior em relação às internacionais, razão pela qual optou-se por manter sempre como referência o Padrão Internacional.^22,28

Os resultados obtidos com amostras de produtos farmacêuticos submetidos ao ensaio do ICPO utilizando diferentes lotes de plasma ovino, sempre separado a partir de sangue coletado de seis animais, demonstram variação de potência de até 7,32% (Tabela 2), coerente com dados da literatura,²² demonstrando a influência do plasma e a importância da qualidade, determinada pelo menor tempo de coagulação, para assegurar a reprodutibilidade das potências estimadas lote a lote.

O método do tempo de tromboplastina parcial ativada (TTPA) foi padronizado com plasma ovino fornecendo resultados comparáveis aos obtidos com plasma humano (dado não mostrado).^19,20,25 Para cada ensaio, efetuou-se a análise de variância demonstrando ser a regressão significativa (p<0,05), e os desvios de linearidade e paralelismo, não significativos. Observa-se também que cada amostra forneceu resultados específicos, alguns dos quais fora dos limites estabelecidos, e, em geral, inferior ao ICPO. Há variedade de fosfolipídios comerciais que diferem consideravelmente em sua sensibilidade, demonstrando que curvas dose-resposta mais acentuadas tornam os ensaios mais precisos.²⁹ Nesse trabalho, usou-se fosfolipídio extraído de cérebro bovino disponível como reagente internacional que propiciou inclinação significativa e precisão média dos ensaios independentes (n=24) de 6.949.

Selecionou-se também a metodologia baseada na inibição do fator Xa, protease intermediária da cascata de coagulação, com determinação do ponto final com substrato peptídico amidolítico e quantificação espectrofotométrica.^18,20,25,30 Realizou-se a avaliação de produtos farmacêuticos comerciais obtendo-se potências entre 80,41% e 112,15%, (Tabela 4). Os produtos cumprem os requisitos farmacopéicos que preconizam atividade entre 80-125%. A média das ponderações dos ensaios independentes (n=24) foi de 1.903.

A avaliação comparativa das atividades biológicas encontradas no estudo das doze amostras de heparinas convencionais demonstrou que o ensaio do plasma ovino (ICPO) apresentou potências médias 11,63% superiores ao TTPA, (p<0,05). Por sua vez, o método do anti-fator Xa forneceu potências semelhantes ao TTPA, diferença de 1,26%.

A literatura^20,31 registra diferenças inferiores a 3,5% em estudos colaborativos pelos métodos do TTPA e anti-fator Xa, podendo-se deduzir que os dados aqui apresentados foram reprodutíveis.

O ensaio do anti-fator IIa, adotado para as heparinas fracionadas,¹⁸ está sendo sugerido como método harmonizado para a avaliação de potência de heparinas não-fracionadas, pois em contraste ao fator Xa, a trombina catalisa rapidamente reações fundamentais na cascata: clivagem do fibrinogênio, ativação dos fatores V e VIII e ativação do receptor expressando a atividade anticoagulante.^22,30 Foi então padronizado com plasma ovino (dado não mostrado) e antitrombina III, cujos resultados encontram-se na Tabela 5. Os valores de potência obtidos com as mesmas 12 amostras foram em geral semelhantes, com média de 94,25% para o anti-fator Xa e 94,45% para o anti-fator IIa. Comparando-se as tabelas 4 e 5, observa-se, aproximadamente, a relação 1:1 entre as atividades anti-fator Xa e IIa. Sugere-se sua inclusão em estudos sucessivos para demonstrar sua robustez e validade para que possa ser preconizado para o controle da qualidade de medicamentos.²²

É importante destacar que os resultados dos ensaios estão relacionados diretamente às características específicas das matérias-primas usadas no produto acabado, razão pela qual as amostras apresentam diferenças variáveis em relação às médias comparativas dos ensaios. Conclui-se observando a importância da padronização dos procedimentos, do desenvolvimento de novos métodos e da harmonização para assegurar a qualidade e eficácia clínica das heparinas não-fracionadas.

Recebido: 27/12/02

Aceito: 20/03/03

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Dez 2003
• Data do Fascículo
  Jun 2003

Histórico

• Aceito
  20 Mar 2003
• Recebido
  27 Dez 2002